Abstract
Formål
Magekreft er fortsatt en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis. Pasienter vanligvis til stede sent med lokal invasjon eller metastase, for der er det ingen effektiv behandling tilgjengelig. Etter tidligere studier som identifiserte adhesjonsmolekylet cadherin-17 (CDH17) som en potensiell markør for magekreft, vi utførte proof-of-prinsippet studier for å utvikle rasjonelle terapeutiske tilnærminger rettet mot CDH17 for behandling av denne sykdommen.
Metoder
Immunhistokjemi ble benyttet for å studere ekspresjonen av CDH17 i 156 gastriske karsinomer, og forholdet mellom overlevelse og CDH17 ekspresjon ble undersøkt ved multivariate analyser. Effekten av RNA interferens-mediert knockdown av CDH17 på proliferasjon av gastrisk karsinom-cellelinjer ble undersøkt in vitro og in vivo, så vel som virkningene på nedstrøms signalisering av immunblotting.
Resultatene
CDH17 var konsekvent oppregulert i humane mage kreft, og total overlevelse hos pasienter med CDH17 oppregulering var dårligere enn i de uten uttrykk av dette genet (5 år total overlevelsesrate 29,0% vs. 45,0%, P 0,01). Funksjonelle analyser viste at CDH17 knockdown hemmet celledeling, adhesjon, migrasjon, invasjon, clonogenicity og indusere G0 /G1 arrest. I mus, shRNA-mediert CDH17 knockdown markert inhiberer tumorvekst; intratumoral injeksjon av CDH17 shRNAs resulterer i betydelige antitumor effekt på transplanterte tumormodeller. Antitumor mekanismene bak CDH17 hemming medfører inaktivering av Wnt /β-catenin signalering.
Konklusjon
Våre resultater identifisere CDH17 som en biomarkør for magekreft og attraktiv terapeutisk mål for aggressiv kreft.
Citation: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Targeting CDH17 Undertrykker tumorprogresjon hos Gastric Cancer av Downregulating Wnt /β-catenin signale. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10,1371 /journal.pone.0056959
Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 22 oktober 2012; Godkjent: 16 januar 2013; Publisert: 15 mars 2013
Copyright: © 2013 Qiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation (30672408 til RHX). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste årsaken til kreftdød i verden. Selv om forekomsten av magekreft har sunket dramatisk i noen utviklede land det siste tiåret, er totalt en million nye tilfeller anslått til å bli diagnostisert hvert år [1]. Pasienter med denne sykdommen ofte har dårlig syn, sto for 10% av totale kreftdødsfall [2]. Selv etter radikal kirurgi, mer enn halvparten av pasientene gjenta seg. Spredning til lymfeknuter, dybde av tumorinvasjon og svulsten plassering har blitt identifisert som de viktigste clinicopathologic prognostiske faktorer [3], [4].
Lokale invasjon og fjernmetastaser forekommer vanligvis i avansert magekreft. Prosessen med invasjon og metastase er kompleks og krever den feilregulering av en rekke forskjellige cellulære elementer, inkludert kritiske adhesjonsmolekyler. Cadherin tilhører en av adhesjonsmolekylet familiene og spiller en avgjørende rolle i etableringen av celle-celle-interaksjon [5]. Cadherin-17 (CDH17), som også kalles lever-tarm (LI) cadherin eller humant peptid transporter-1 (HPT-1), er et strukturelt enestående medlem av superfamilien cadherin [6], [7]. Mens de såkalte klassiske cadherins, slik som E-, N- og P-cadherin, har fem cadherin gjentagelser innenfor det ekstracellulære domene, CDH17 består av syv cadherin gjentas. Dessuten har CDH17 bare 20 aminosyrer i det cytoplasmatiske domenet, mens klassiske cadherins ha et høyt konservert cytoplasmatisk domene som består av 150-160 aminosyrer. CDH17 er uttrykt i mus og mennesker nesten utelukkende i epitelceller hos både embryonisk og voksen tynntarm og tykktarm, med ingen detekterbar ekspresjon i magesekken og leveren [8].
Ved hjelp av integrerende genomiske og proteomic tilnærminger, har forskere begynt å identifisere nye onkogener og tumor dempere i magekreft. Tidligere studier av kliniske cohorts identifisert CDH17 som en potensiell sykdom markør for gastrisk karsinom [9], [10]. Til tross for disse betydelige kliniske resultater, de molekylære funksjoner av CDH17 forblir ukjent, og dens rolle i tumorigen magekarsinom har ennå ikke blitt bekreftet. Her ønsket vi å dissekere de onkogene signalmekanismer CDH17 i magekarsinom sammenheng og evaluert effekten av målretting CDH17 som en potensiell terapeutisk tilnærming for magekreft.
Metoder
Pasienter
studie~~POS=TRUNC besto av 156 påfølgende pasienter (106 menn og 50 kvinner) er planlagt for kirurgi fra 1. januar 2002 til 31. desember 2006 til Sun Yat-Sen universitetet Cancer Center, Guangzhou, Kina. Alle pasienter som deltok i denne studien hadde en histologisk bekreftet diagnosen av primær magekreft som ble ytterligere analysert patologisk etter operasjonen. Kirurgi bestod av delvis eller total gastrektomi i alle pasienter; en standardisert teknikk som ble brukt for kirurgisk reseksjon og lymphadenectomy, som beskrevet andre steder [3]. Pasienter som gjennomgikk ikke-resective kirurgi, og de med Siewert type I Cardia adenokarsinom ble ekskludert fra studien. Prøve og tumor størrelser ble registrert av patologer. Representative områder av svulsten ble valgt og snap-frosset. pTNM klassifisering fulgt kriteriene for sjette utgaven av UICC [11] sikret median alder av pasientene var 57,2 år (range: 27-78 år) Alder, kjønn, type kirurgi, tumor beliggenhet, TNM stadium, kjemoterapi, prøve lengde, tumorstørrelse, og histologisk differensiering, ble registrert for hver pasient i en database. Alle pasienter som gjennomgikk en hvilken som helst type kjemoterapi var på 5-FU, platina eller taxol-baserte regimer. Alle pasientene etter utskrivning fra sykehuset, gikk et oppfølgingsprogram i henhold til standard protokoll [12]. Oppfølgingen ble stengt i april 2010. Studien ble godkjent av etisk komité i Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center, alle deltakerne gitt sitt skriftlige samtykke til å delta i denne studien.
Cellelinjer og CDH17 antistoff
magekarsinom cellelinjer, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 og SGC-7901 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia), japanske Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan) og Beijing Medical University (Beijing, Kina). Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen). En mus monoklonalt antistoff mot CDH17 (ab54511) var fra Abcam (Cambridge, MA).
CDH17 kort hårnål RNA (shRNA)
pLKO.1 puro (7 kb) lentiviral konstruksjonen inneholder en U6 promoter og HIV-1 RNA emballasje signal med pruomycin- og ampicillinresistens elementer klonet 3 «av den humane fosfoglyceratkinase (hPGK) promoter. En cpptCTE ble innsatt 5 «av hPGK promoteren. Menneske CDH17 shRNA konstruksjoner ble generert ved å ligere følgende glødet oligomerer inn de unike Agel og EcoRI setene av pLKO.1 puro: CDH17 shRNA fremover (5’CCG GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G -3 «) og revers (5’AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G -3). Lentiviral forberedelser ble produsert av co-trans pLKO.1 puro tom vektor med CDH17 shRNA, og hjelper virus emballasje plasmider pCMVΔR8.9 og pMG.G (på et 10:10:01 ratio) i 293T celler. Transfeksjon ble utført ved anvendelse av lipofektamin og PLUS reagens (Invitrogen). Lentiviruses ble høstet ved 24, 36, 48 og 60 timer etter transfeksjon. To kontroller ble satt opp, der magekreftceller enten fikk ingen behandling, eller ble transfektert med egge ikke-målrettede RNAi vektor (Mock). -Infeksjon ble utført i nærvær av 8 mikrogram /ml polybren. Følgende infeksjon, AGS og MKN-45-celler ble valgt for stabil ekspresjon av de shRNAs ved bruk av 2 ug /ml puromycin. Cellene ble lysert for western blot analyse 10 dager etter smitte.
Immunoblotting og subcellulære fraksjone
Protein lysates ble fremstilt fra cellelinje monolagene bruker lysebuffer (1% NP-40,50 mM Tris -HCI, pH 8,0, 100 mM natriumfluorid, 30 mM natriumpyrofosfat, 2 mM natrium-molybdat, 5 mM EDTA, 2 mM natrium ortovanadat) inneholdende proteaseinhibitorer (10 mg /ml aprotinin, 10 mg /ml leupeptin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid ). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Cellelysater ble underkastet natriumdodecylsulfat-sulfacte-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE), og de separerte proteiner ble elektroforetisk overført til Immobilon-P-membran (Millipore). Etter blokkering av ikke-fett melk, ble membranene inkubert uavhengig i primær antistoff P53 (Cell Signaling # 9282), MDM2 (Zymed # 33-7100), P21 (Zymed # 33-7000), cyclin D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell Signaling # 9309), β-catenin (Zymed, 13-8400), GSK3p (Santa Cruz, SZ-7291) og p-GSK3p (Ser9) (Cell Signaling # 9336). Membranen ble vasket flere ganger i PBS med 0,1% Tween 20 og skannet i LI-COR Odyssey infrarød to-fargegjenkjenning imager system (LI-COR Biovitenskap) i henhold til produsentens instruksjoner.
subcellulære fraksjoner ble utført ved hjelp av spesifikke cellelyse buffere og gjentatte sentrifugeringstrinn (Nuclear ekstrakt kit fra Active Motive, Carlsbad, CA) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Cellefraksjonene ble løst opp i RIPA-buffer, og proteinkonsentrasjonen ble målt under anvendelse av BCA-proteinanalyse kvantifisering. Proteinekstrakter (20 ug) ble ytterligere løst i en x Laemmli-buffer, underkastet elektroforese på en 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner, som beskrevet ovenfor. Western blot analyse av poly-ADP-ribose polymerase (PARP, fra Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) og superoksid dismutase 2 (SOD2, fra ABFrontier, Seoul, Korea) ble utført for å bekrefte korrekt separasjon av kjernefysiske og cytosoliske proteiner.
Kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QPT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer og frosne adenokarsinom vev ved TRIzol reagens (Invitrogen). Revers transkripsjon av total RNA (2 Ag) ble gjort ved hjelp av en fordel RT PCR-sett (Clontech), og cDNA ble utsatt for PCR for 28 amplifikasjonssykluser med de følgende primere: CDH17 Fw, 5′-ACAATCGACCCACGTTTCTC og CHD17 Rv, 5 «-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-Aktin ble anvendt som en kontroll.
Immunhistokjemi (IHC)
I alt 156 formalinfiksert og parafininnstøpte gastrisk kreft vevsprøver ble valgt for studium IHC. IHC farging ble utført på 5-mikrometer vevssnitt rehydrert gjennom graderte alkoholer. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksyd i 15 min. Glass ble mikrobølgebehandlet i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i 10 min. Uspesifikk binding ble blokkert med 10% normalt kaninserum i 20 min. Vevet Glassene ble inkubert med anti-CDH17 (1:50 fortynning) i 60 minutter ved 37 ° C i et fuktig kammer. Glassene ble inkubert med biotinylert kanin-anti-mus-immunoglobulin ved en konsentrasjon på 1:100 i 30 minutter ved 37 ° C og deretter omsatt med et streptavidin-peroksidase-konjugat i 30 minutter ved 37 ° C og til slutt inkubert med 3-3 «diaminobenzidin som et kromogen substrat. For å utelukke et falskt positivt signal, var negative kontroller inkludert i hver test ved å bytte ut den primære antistoff med blokkering serum. To uavhengige observatører blindet til clinicopathologic informasjon scoret lysbildene. Definisjonen av fargingen var som følger: negativ, med 0% til mindre enn 5% av tumorcellene som viser immunoreaktiviteten; svak, 5-40% av tumorcellene som viser immunoreaktiviteten; positiv, mer enn 40% av tumorcellene som viser immunoreaktivitet. De positive saker ble videre under klassifisert i CDH17 + (immunoreaktivitets: 40-60%), CDH17 2+ (immunoreaktivitets: 60-80%) og CDH17 3+ (immunoreaktivitets: 80-100%).
I vitro-undersøkelser for å vurdere tumor fenotype
de eksperimentelle fremgangsmåter for cellevekst, foci formasjon, myk agar, cellemigrasjon, sårheling og cellesyklus analyser er beskrevet i den bærende Methods S1.
Rednings eksperimenter
redningen av CDH17 i shCDH17 AGS og MKN-45 cellelinjer er beskrevet i Supporting Methods S1.
in vivo musemodeller av magekreft
Denne studien ble gjennomført ut i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center (Permit Number: 09-0238). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Etter anestesi, ble Nude musene avlivet ved halshugging.
Svulstdannelse i nakne mus.
I vivo tumorigenesis ble undersøkt av tumor xenograft eksperimenter. Om 2 × 10
6 AGS celler infisert med CDH17 shRNA, kontroll AGS celler infisert med mock RNAi vektor og foreldre AGS celler ble injisert subkutant inn i høyre og venstre bakbein av 4 uker gamle hårløse mus (30 mus, 10 per tilstand). Tumordannelse i nakne mus ble overvåket over en 8 ukers periode. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen V = 0,5 x L x W
2. [13]
Tumor-bærende mus modell.
subkutane svulster ble indusert i nakne mus ved hjelp av AGS celler som ovenfor nevnt. En uke etter inokulering, ble musene behandlet med anti-CDH17 shRNA. Hver mus mottok 100 mL av intratumoral injectionscontaining 1 × 10
9 kopier av CDH17 eller mock lentivirus, to ganger ukentlig i 2 uker. Fem mus ble benyttet i hver gruppe. Tumorvekst ble overvåket daglig.
statistikker
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS 13.0. Forskjeller mellom variabler ble vurdert av χ2 analyse eller to-tailed Student t-tester. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, med mindre annet er angitt. Total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) kurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene mellom de to gruppene ble sammenlignet ved log-rank test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
CDH17 er sterkt uttrykt i mage carcinoma celler og er relatert til dårlig klinisk utfall
Først av alt, undersøkte vi uttrykket nivået av CDH17 i 156 magekarsinom eksemplarer av IHC: 69 (44,3%) av 156 tilfeller var positive, mens de resterende 87 tilfeller (55,7%) var negative eller svakt for CDH17 uttrykk (fig. 1). Ekspresjonsnivået var 3+ henholdsvis 21 (13,5%), 20 (12,8%) og 28 (17,9%) tilfellene +, 2 + og. Disse funnene tyder på at CDH17 kan spille en viktig rolle i magekreft tumorigenesis. Vi deretter sammenlignet de kliniske og patologiske funksjoner av pasienter med og uten CDH17 uttrykk. Det ble ikke observert statistisk signifikante forskjeller mellom de to gruppene med hensyn til kjønn, alder, tumorstørrelse, tumorlokalisering, dybde av tumorinvasjon, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser og TNM stadium (tabell 1).
IHC farging i gastrisk karsinom vev (opprinnelig forstørrelse x 200). A: Negativ, B: Svak, C: Positiv (+), D: Positiv (2+), E:. Positiv (3+)
Deretter undersøkte vi den potensielle effekten av CDH17 uttrykk status på den langsiktige overlevelsen av pasienter ved univariat og multivariat analyse. Median oppfølgingstid på 24,3 måneder, på slutten av oppfølging, 68 pasienter var fortsatt i live, 87 pasienter døde av svulst, og en pasient døde av andre årsaker; kreftrelaterte 5-års overlevelse i hele serien var 37,8%. Univariate analyser viste en sammenheng mellom total overlevelse og tumorlokalisering, histologisk differensiering, TNM stadium og CDH17 uttrykk (tabell S1). I multivariate analyser, svulststedet (p = 0,02) histologisk differensiering (p = 0,02), TNM stadium (p 0,001) og CDH17 uttrykk (p 0,01) var uavhengige prognostiske faktorer for total overlevelse. Fig. 2A viser den totale overlevelse forskjellen mellom pasienter med og uten CDH17 uttrykk. Median total overlevelse var 15,9 måneder hos pasienter med CDH17 uttrykk sammenlignet med 26,6 måneder i de CDH17 negativ eller svak uttrykk (P 0,01), tilsvarende en 16% reduksjon i dødelighet. Videre ble utført Sykdomsfri overlevelse (DFS) analyse i 131 pasienter som gjennomgikk R0 reseksjon. På slutten av oppfølging, 69 (52,7%) av pasientene var fortsatt i live, og 62 (47,3%) pasienter døde av svulst tilbakefall eller fjernmetastaser, multivariate analyser viste lignende resultater, histologisk differensiering, tumorlokalisering, dybde av tumorinvasjon (pT scenen), lymfe-node metastase (pN scenen) var uavhengige prognostiske faktorer for sykdomsfri overlevelse (data ikke vist). Vi fant også at pasienter uten CDH17 uttrykk har en bedre prognose enn de som med CDH17 uttrykk i svulstvev (Fig 2B.) (P 0,01). Total overlevelse ble redusert hos pasienter med høyt uttrykk for CDH17 (IHC 2+, 3+) enn hos pasienter med CDH17 + uttrykk (Fig. 2C). Median total overlevelse for pasienter med tumorer hadde høyere CDH17 uttrykk var 10,9 måneder for CDH17 3+, 21,1 måneder for CDH17 2+, og 25,7 måneder i de tildelt være CDH17 + uttrykk (p 0,01).
Kaplan -Meier overlevelsesanalyse med ulike CDH17 uttrykk. A. Total overlevelse i 156 pasienter med magekreft (p 0,01) B. sykdomsfri overlevelse i 131 magekarsinom pasienter som gjennomgikk R0 reseksjon (p 0,01). C. Total overlevelse i 156 pasienter med magekreft i henhold til CDH17 status (IHC 1+, 2+ og 3 +) (p 0,01).
CDH17 uttrykt i humane mage cellelinjer
undersøkt hvorvidt humane mage-carcinom-cellelinjer uttrykker CDH17 og således kan brukes for ytterligere å evaluere potensialet funksjon dette proteinet. Vi valgte et panel av 6 magekreft cellelinjer med ulike metastatisk potensial: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 og SGC-7901. CDH17 mRNA-nivået ble målt ved QRT-PCR-analyse. Sterk ekspresjon ble observert i primære og metastatisk gastrisk karsinom cellelinje (AGS og MKN-45) (fig. S1A). Western blot analyse bekreftet høy CDH17 protein uttrykk i AGS (etablert fra en primærtumor) og MKN-45 (metastatisk) (Fig. S1B).
Samlet utgjør disse resultatene tyder på at CDH17 er viktig for initiering og metastasering av magekreft; minst en undergruppe av godt akkrediterte mage carcinom cellelinjer beholder uttrykk for CDH17 åpner for ytterligere funksjonell karakterisering.
CDH17 knockdown induserer anti-tumor effekter in vitro
Neste, vi slått ned CDH17 i magekreft cellelinjer-AGS og MKN-45 bruker CDH17-spesifikke shRNAs. Knockdown ga 75% reduksjon i både mRNA og proteinnivåer (figur 3a.). Vi deretter vurdert de tumorigene og metastatiske egenskaper (spredning, kolonidannelse, vedheft, invasjon og cellesyklus) av CDH17 mangel mage kreftceller (shCDH17 celler) sammenlignet med modellvektor infiserte kontrollceller.
Uttrykket av CDH17 ble undertrykt av lentiviral-mediert CDH17 shRNA (shCDH17); celler infisert med ikke-målrettede vektor (Mock) og sperre AGS eller MKN-45-celler ble brukt som kontroller. (A) QRT-PCR (Venstre) og western blot (midt) viser mRNA og proteinnivå CDH17 i ulike eksperimentelle grupper etter puromycin utvalg. p-aktin ble benyttet som aloading kontroll. (A) (høyre) Vekstkurver av shCDH17 celler ble sammenlignet med Mock, AGS-celler ved XTT-assay. (Poeng, mener på minst tre uavhengige eksperimenter, barer, SD). (B) Representant hemming av foci formasjonen i enlagskultur (Venstre) og kolonidannelse i soft agar kultur (Right) av CDH17 knockdown. Kolonne Diagrammet viser kvantitative analyser av foci eller kolonier tall (kolonner, mener minst tre uavhengige eksperimenter, barer, SD). (C) (Venstre) Et sår ble opprettet på en Subkonfluente kultur for foreldre AGS, Mock celler og shCDH17 celler, og hastigheten for sårheling ble overvåket på 0, 24 og 48 timer. En representant fotografi fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Original forstørrelse, × 200. (C) (Høyre) Representative bildene viser shCDH17, Mock og AGS celler som invaderte gjennom matrigel. Antallet invaderer tumorceller ble kvantifisert. Kolonner, mener fra tredoble eksperimenter; barer, SD. Original forstørrelse, × 200. (D) cellesyklusanalyse ved hjelp av strømningscytometri. Knockdown CDH17 betydelig svekket de tumorigene og invasive egenskapene til AGS celler, mens indusere cellesyklus G0 /G1 arrest. (* P 0,05, ** p 0,01; ***, P 0,001)
CDH17 shRNA-mediert knockdown resulterte i betydelig redusert cellevekst av magekreft cellelinjer (P . 0.001 ) (fig. 3A, Høyre). Foci-dannelse ble også hemmet signifikant (P 0,001) i shCDH17 celler sammenlignet med Mock-celler (figur 3B, venstre.), Et tilsvarende resultat ble oppnådd i myk agar, hvori kolonidannelse ble betydelig redusert i shCDH17 celler (P 0,001 fig. 3B, Høyre). Rollen CDH17 i metastase ble studert av sårhelende og Transwell analyser. CDH17 knockdown var i stand til å redusere cellemobilitet (Fig. 3C, venstre), som bestemt ved såret analysen. Transwell-analyse viste at redusert uttrykk for CDH17 reduseres betydelig celle adhesjon (P 0,001) (Fig. 3C, Høyre). For å utforske mekanismen bak vekstinhibering av CDH17 knockdown, ble cellesyklus fordelinger av celler med CDH17 shRNA hårnål og Mock bestemt ved strømningscytometri: shCDH17 celler ble arrestert i G0 /G1 fase, med færre celler i G2 /M-fase (Fig . 3D). Anti-tumoreffekten av CDH17 knockdown ble også sett i den metastatisk gastrisk karsinom-cellelinje MKN-45 (fig. S2A-E). Ifølge den aksepterte standarder som vil sikre kvaliteten og nøyaktigheten av RNAi eksperimenter [14], utførte vi redningsforsøk re-uttrykke CDH17 i AGS og MKN-45 shCDH17 celler (Fig. S3A-B). Restaurering av CDH17 uttrykk i AGS og MKN-45 celler returnert cellene til foreldrenes fenotype, som bekrefter at de anti-tumor effekter av CDH17 knockdown var ikke på grunn utenfor mål effekter. Rednings eksperimenter viste at etter restaurering av CDH17 uttrykk i de to cellelinjer, tumorigenitet og metastatisk potensial økt til tilsvarende nivåer av foreldre AGS og MKN-45 celler (Fig. S3C-F). Disse resultatene gir sterke bevis for de onkogene roller CDH17 i mage carcinoma celler.
CDH17 som en in vivo Target for Gastric Cancer Therapy
Vi undersøkte om CDH17 er nødvendig for tumordannelse og invasivitet i gastric carcinoma celler i en naken mus modell. Vi subkutant injisert shCDH17, Mock og foreldre AGS celler til nakne mus. Svulster er vanligvis synlige makroskopisk i dorsal flanker innenfor en 6 til 8-ukers periode av celler injeksjon. En mus fra begge foreldre AGS og Mock grupper døde i løpet av tredje uke etter injeksjon (humane endepunkter ble brukt). Musene ble drept 8 uker etter tumorcelle injeksjon. I den gruppe mus injisert med shCDH17 celler, vises to mus uten tumor nodul, og 8 mus viste en betydelig redusert tumordannelse sammenlignet med mus injisert med mock-celler. Tumorstørrelse og vekt ble betydelig redusert hos mus injisert med shCDH17 celler sammenlignet med mus injisert med mock-celler (Fig. 4A). Disse resultatene viser at reduksjon av CDH17 ekspresjon i betydelig grad kan undertrykke tumorgenisitet in vivo.
A. Representative eksempler på svulster dannes i nakne mus etter injeksjon av shCDH17 celler i venstre rygg flankene. AGS og Mock-celler ble injisert inn i det høyre, henholdsvis. Linje Figuren illustrerer at endringene i volumet av subkutane svulster, shRNA vs. Mock, * p 0,05. B. Effekt av CDH17 shRNA undertrykkelse på veksten av subkutane tumorer i nakne mus. Subkutane tumorer ble indusert i nakne mus ved injeksjon av AGS-celler; behandling involverte en intratumoral injeksjon av Mock reagenser (ikke-målrettede vektor RNAi) eller shCDH17 diett i en dose på 10
9 viral partikkel /injeksjon på tumorstedet av dyrene (n = 3). Fotografier illustrere subkutan svulst produsert av Mock og shCDH17 i nakne mus. Volumet av svulst indusert i nakne mus ble målt mellom de tre eksperimentelle grupper etter 35 dager. IHC bildene viser at CDH17 uttrykk redusert i shRNA behandlede mus. Original forstørrelse, × 400. Linje Figuren illustrerer at endringene i volumet av subkutane svulster. shRNA vs. Mock, *** p. 0,001
For å ytterligere evaluere effekten av CDH17 knockdown på primærtumorvekst, så undersøkte vi om in vivo levering av CDH17 shRNA kan hindre vekst av en etablerte tumor xenograft fra paren AGS celler i nakne mus. En uke etter tumor-inokulering, da tumoren hadde nådd omtrent 100 mm
3, utførte vi en intratumoral injeksjon av CDH17 shRNA eller mock-vektoren i en dose på 10
9 viral partikkel /injeksjon på tumorstedet. Injeksjonen ble administrert to ganger ukentlig, i 2 uker. I dyrene injisert med Mock vektor, tumorene vokste progressivt i løpet av eksperimentet. Tvert imot, intratumoral injeksjon av CDH17 shRNA førte til betydelig mindre svulster ved hvert tidspunkt, inkludert den endelige volummåling (Fig. 4B). Undersøkelse av tumorcellene hos CDH17 IHC vist bemerkelsesverdig nedregulering av beregnet CDH17 mål i shCDH17 behandlede celler (P 0,05, Fig. 4B). Disse resultater viser at in vivo nedregulering av CDH17 i gastrisk karsinom celler reduserer tumordannelse hos mus, noe som tyder på at CDH17 er et terapeutisk mål for magekreft.
Nedregulering av Wnt /β-catenin signalering ved CDH17 knockdown
Vi avhørte flere veier for å oppdage den molekylære mekanismen for CDH17 knockdown-mediert hemming av magekreft vekst, spredning og metastasering. Vi fant flere medlemmer av Wnt /β-catenin vei til å bli uttrykt forskjellig mellom shCDH17 og foreldre celler. β-catenin uttrykk, GSK-3β fosforylering, og cyclin D1 uttrykk redusert; og Rb uttrykk økt i både AGS og MKN-45 shCDH17 celler. I tillegg uttrykk for P53, MDM2 og nøkkelen cellesyklus regulator p21 økte i CDH17-knockdown celler. (Fig. 5A). I en TOPFlash /FOPFlash reporter luciferase assay (Fig. 5B), restaurering av CDH17 både AGS og MNK-45 celler betydelig økt styrke TCF /LEF signaler sammenlignet med shCDH17 kontrollene. Videre, som vist ved hjelp av immunoblotanalyse, vi har oppdaget en økning av både total og atom β-catenin protein etter gjenopprettelse av CDH17 i AGS og MKN-45, sammenlignet med den shCDH17 (fig. 5C) .Together, disse resultatene indikerer at CDH17 knockdown resultater i nedregulering av Wnt /β-catenin banen i magekreftceller. Dette, i sin tur, antyder at CDH17 opprettholder den proliferative potensial gjennom Wnt /β-catenin sti-signalering.
A. Uttrykk for β-catenin, GSK-3β, p- GSK-3β, Rb, Cyclin D1were forhold mellom shCDH17 og Mock både i AGS og MKN-45 celler med Western blot analyse. MDM2, p53 og p21 også ble evaluert. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B. TOPflash /FOPflash reporter analysen viser at Wnt signal re-aktiveres etter CDH17 restaurering i AGS og MKN-45. (* P 0,05). C. Økning av både totalt og kjernefysisk β-catenin protein etter restaurering av CDH17 i AGS og MKN-45, sammenlignet med shCDH17.
Diskusjoner
CDH17 er en roman cadherin, sin struktur er forskjellig fra de av de klassiske cadherins ved at det N-terminale domene, og cytoplasmadelen viser ingen signifikant homologi med klassiske cadherins [6]. Den biologiske funksjon av CDH17 er fortsatt ukjent. Tallrike studier har rapportert forhøyede nivåer av CDH17 i forskjellige humane kreftformer, som forbinder ekspresjon av dette protein til prognose og risikovurdering [10], [15]. CDH17 overekspresjon har vært rapportert i adenokarsinom i ventrikkel [9], leverkreft [16] og tykktarmskreft [17]. Dette indikerer at CDH17 kan være avgjørende i tumorigenesis av mage og leverkreft.
Hos mennesker er CDH17 normalt uttrykt utelukkende på basolateral overflaten av hepatocytter og enterocytes. Etter den første rapporten fra CDH17 som en intestinal metapasia markør ved Grotzinger et al [9], har flere undersøkelser evaluert CDH17 uttrykk i magekreft. CDH17 ble uttrykt i 50-78% av magekreft vev med intestinal-type overvekt [18], [19]. I denne studien, viser vi at CDH17 er et onkogen og en attraktiv terapeutisk mål i magekreft: CDH17 er sterkt uttrykt i tumorvev, med nesten halvparten av magekreft blir CDH17 positive ved IHC. Park og kolleger evaluert CDH17 uttrykk i mer enn 200 magekreft vevsprøver, og rapporterte at det var sterkt uttrykt i tidligere TNM stadier [20], Videre fant de som har vist redusert uttrykk for CDH17 å være nært forbundet med tumor aggressivitet og lymfeknutemetastase av human gastrisk karsinom [20]. Men andre rapporterte at dets ekspresjon var mye høyere i avansert lymfeknutemetastase [18], [21]. I vår studie var det ingen sammenheng mellom CDH17 uttrykk og andre clinicopathological funksjoner.
Som en prognostisk faktor, CDH17 uttrykk viste en tendens mot en indikator for ugunstig å overleve i flere pasient kohorter, selv etter kontroll for tumorstadium. I denne sammenheng, median total overlevelse på 15,9 måneder i gruppen med positive CDH17 uttrykk, vs. 26,6 måneder hos pasienter med IHC negative tumorer representerer en klinisk signifikant sammenheng. Videre er en unders analyse viste dårlig total overlevelse hos pasienter med høy ekspresjon av CDH17 protein (IHC 2+ og 3+) sammenlignet med pasienter med lav ekspresjon av CDH17 protein (IHC +). Disse funnene er bemerkelsesverdig i lys av dårlig prognose i denne populasjonen.
