Abstract
Bakgrunn
Pasienter diagnostisert med metastatisk kreft har nesten jevnt dårlige prognoser. Behandlinger tilgjengelig for pasienter med disseminert sykdom er vanligvis ikke kurativ og har bivirkninger som begrenser behandling som kan gis. En behandling som er selektivt giftige for svulster vil maksimere de gunstige effektene av behandlingen og redusere bivirkninger, potensielt gjør det mulig effektiv behandling som skal gis.
Metoder og funn
Vi postulert at svulsten-tropisk eiendom stamceller eller stamceller kan utnyttes til å selektivt levere en terapeutisk gen til metastatiske solide svulster, og at uttrykk for en passende transgenet ved tumor loci kan megle kurer av metastatisk sykdom. For å teste denne hypotesen, injisert vi HB1.F3.C1 celler transduced å uttrykke et enzym som effektivt aktiverer anti-kreft prodrug CPT-11 intravenøst i mus med disseminert neuroblastom svulster. De HB1.F3.C1 cellene overført selektivt til tumor områder uavhengig av størrelsen eller anatomisk lokalisering av tumorer. Mus ble deretter behandlet systemisk med CPT-11, og effekten av behandlingen ble overvåket. Mus behandlet med kombinasjonen av HB1.F3.C1 celler som uttrykker CPT-11-aktiverende enzym, og dette prodrug produsert tumorfri overlevelse av 100% av musene for 6 måneder (
P
0,001 sammenlignet med kontrollgrupper).
Konklusjoner
det nye og betydelige funn av denne studien er at det kan være mulig å utnytte svulsten-tropisk eiendom stilk eller progenitorceller å megle effektiv, tumor selektiv terapi for metastatiske svulster, som det ikke tolereres kurativ behandling er tilgjengelig for øyeblikket
Citation. Aboody KS, Bush RA, Garcia E, Metz MZ, Najbauer J, Justus KA, et al. (2006) Utvikling av en tumor-Selektiv tilnærming å behandle metastatisk kreft. PLoS ONE 1 (1): e23. doi: 10,1371 /journal.pone.0000023
Academic redaktør: Hans Clevers, Utrecht University, Nederland
mottatt: 08.08.2006; Godkjent: 10 august 2006; Publisert: 20.12.2006
Copyright: © 2006 Aboody et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health /National Cancer Institute (CA113446, CA79763, CA76202, og CA21765); . Stopp Cancer Foundation, Phi Beta Psi Sorority, The Rosalinde og Arthur Gilbert Foundation, Neidorf Family Foundation, Marcus Foundation, og amerikanske libanesiske syriske Associated veldedighet (ALSAC)
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksistere.
Innledning
Nevroblastom er den vanligste ekstrakraniell solid svulst hos barn. Vanligvis pasienter diagnostisert med høy risiko sykdom demonstrere en god første respons på behandling, men så mange som 80% av disse pasientene får tilbakefall med metastatisk sykdom som ikke kan behandles med terapi. I likhet med andre solide tumorer, når neuroblastomer metastaserer, de er svært vanskelig å behandle, og et flertall av barn med metastatisk neuroblastom dør av sin sykdom [1] – [3]. For tiden tilgjengelige behandlinger har anti-tumor effekt, men de frembringer også uønskede bivirkninger til normalt vev, noe som begrenser den behandling som kan administreres. Nye og effektive metoder for behandling av nevroblastom for
Fremgangsmåten som er beskrevet i denne studien er basert på å utnytte den tumor-tropisk egenskap av HB1.F3.C1 celler [4] -. [16] for å levere en effektiv terapeutisk middel selektivt til svulster. Den spesifikke Målet med studien var å vise at intravenøs administrasjon av HB1.F3.C1 celler som uttrykker CPT-11 (irinotecan) -aktiverende enzym kanin karboksylesterase (RCE) vil i betydelig grad øke antitumor effekt av tolererte dose av CPT-11 i mus bærende disseminert neuroblastom svulster. Fremgangsmåten som er beskrevet kan også være innrettet til å utvikle behandling for pasienter med andre typer av metastatiske faste tumorer.
Neurale stamceller (NSC) eller progenitorceller (NPC) og stamceller (MSC) har nylig blitt undersøkt som levering kjøretøy for behandling av subkutane transplantater, samt for behandling av tumorer i sentralnervesystemet eller lungene av prekliniske modeller. Dette er den første studien forsøker å utnytte den bemerkelsesverdige tumor-tropisme av disse cellene for å utvikle behandlinger for metastatisk, disseminert faste tumorer. Siden ingen effektive behandlinger er tilgjengelige for de fleste metastatiske tumorer, noe som viser at stilk eller progenitorceller av føtal eller voksen opprinnelse kan brukes til å forbedre prognosen for pasienter med metastatisk sykdom dødelig ville være meget betydelige.
Den anvendte cellelinjen i denne studien (HB1.F3.C1) ble avledet fra føtale telencephalon celler. Primære celler ble udødeliggjort av retrovirale innsetting av v-
myc
gen som var nødvendig for å opprettholde sin replikering potensial [17]. Etter immortalisering, HB1.F3.C1 cellene replikerer
in vitro
å danne identiske datterceller eller kan induseres til å differensiere til andre celler nevronal linjen, og dermed oppviser egenskaper både stamceller og forløperceller. Siden HB1.F3.C1 celler administreres systemisk migrere til og lokalisere
in vivo
på nettstedene til patologi inkludert svulster, foreslo vi å utnytte denne egenskapen til selektivt levere RCE å aktivere anticancer prodrug CPT-11 [18] – [20]. Vi antok at økt omdannelse av denne promedikament til dets aktive metabolitt (SN-38) ved svulster områder ville øke selektiv antitumoraktivitet. Vi intravenøst adenovirus-transduced HB1.F3.C1 celler som uttrykker en utskilt form for RCE til mus med disseminert neuroblastom. Mus ble deretter behandlet systemisk med CPT-11 og langvarig overlevelse av dyrene ble overvåket. Resultatene tyder på at romanen enzym /prodrug tilnærminger til behandling ved hjelp av stilk eller stamceller som levering kjøretøy kan ha nytte i behandling av metastatisk kreft.
Metoder
tumorcellelinjer
De tre humane neuroblastom cellelinjer brukt i denne studien var NB-1691, NB-1643, og SK-N-AS [21], [22]. Disse cellelinjene ble hentet fra Pediatric Oncology Group og American Type Culture Collection og reflekterer ulike neuroblastom fenotyper og genotyper: N-
myc
forsterket, N-
myc
ikke-forsterket /overexpressed, N-
myc
ikke-forsterket /lavt nivå uttrykk,
MDM2
forsterket, og ulike forhold av atom /cytoplasma p53. Hver type forsøk beskrevet nedenfor ble utført med alle tre cellelinjer; resultater fra representative forsøk er vist. Tre neuroblastom-cellelinjer ble brukt for å vise at resultatene observert var ikke begrenset til en enkelt cellelinje; Lignende resultater ble observert med alle tre cellelinjer. Tumorcellelinjer ble dyrket i DMEM inneholdende 10% FCS ved 37 ° C i en fuktig atmosfære som inneholdt 10% CO
2.
HB1.F3.C1 cellelinje
HB1. F3.C1 cellelinje er en multipotent, klonet cellelinje som ble generert ved å udødeliggjøre celler oppnådd fra telencephalon av en menneskefoster av 15 ukers svangerskap, ved hjelp av et retrovirus som koder for v-
myc-genet
[17] [23]. Den primære celler ble oppnådd i samsvar med retningslinjene fra Anatomisk patologi Avdeling for Vancouver General Hospital, med tillatelse til å bruke fostervev gitt av Clinical Research Screening Utvalget omfatter mennesker av University of British Columbia. HB1.F3.C1 er et etablert, godt karakterisert, stabil cellelinje [23] – [27]. HB1.F3.C1 celler selv fornye
in vitro
, er ikke-tumorigen, og er multipotent ved at de kan bli overtalt til å differensiere i nevroner, oligodendrocytter og astrocytter [17]. Bruken av denne cellelinje omgått den betydelige problemet med begrenset tilgjengelighet av store mengder primærceller og maksimert reproduserbarhet mellom eksperimenter. Cellelinjen ble dyrket i DMEM med 10% FCS ved 37 ° C i en fuktig atmosfære av 10% CO
2.
Transduksjon av HB1.F3.C1 celler til å uttrykke RCE
replikasjonsdefekt adenovirus som uttrykker en utskilt form av RCE under kontroll av cytomegalovirus (CMV) promoter (AdCMVrCE) ble konstruert ved anvendelse av standard metoder, slik som beskrevet tidligere [18], [20], [28]. HB1.F3.C1-celler ble ko-dyrket med AdCMVrCE i 24 timer før intravenøs injeksjon. Den enzymaktivitetsanalyse anvendt for å kvantifisere nivået av ekspresjon av RCE ved HB1.F3.C1-celler transdusert med adenovirus har også blitt rapportert tidligere [20].
HB1.F3.C1 cellemigrering, Injeksjon og lokalisering
for å undersøke om HB1.F3.C1 celler injisert intravenøst, migrere til disseminert svulst foci i mus, ble neuroblastom tumorceller injiseres intravenøst i halevenene av mus og lov til frø og utvikle svulster i to måneder. HB1.F3.C1 celler (2 × 10
6) ble deretter injisert
via
den samme ruten og organer ble høstet 3-4 dager senere for å vurdere flytting til makroskopiske og mikroskopiske svulster.
for terapeutiske eksperimenter, ble HB1.F3.C1 celler administrert 2 uker etter injeksjon av neuroblastom celler. På dette tidspunktet, svulster er mikroskopiske og oppdages av øyet eller ved å
in vivo
imaging. I samsvar med initiering av behandling på dette tidspunkt, foreslår at den mest sannsynlige eventuell klinisk anvendelighet av den beskrevne metode vil være å utrydde minimum restsykdom etter konvensjonell terapi. Denne eksperimentelle protokollen gjenspeiler mest direkte at potensiell anvendelse.
I både migrasjon og terapeutiske studier, 2 x 10
6 HB1.F3.C1-celler transdusert med adenovirus ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 20 var pre-merket med CM-Dil (chloromethylbenzamido-1,1′-dioktadekyl-3,3,3 «, 3»-tetramethylindocarbocyanine perklorat, molekylære prober, Eugene, Oregon) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble deretter skyllet 3 ganger med PBS og injisert i halevenen til tumorbærende mus. CM-Dil ble valgt fordi den er ikke-diffunderbare i kraft av sin kovalent binding til cellulære tioler, og har vist seg å være egnet for merking og
in vivo
sporing av celler i minst 10 uker [29] , [30]. I forsøk som inngår i denne utredningen, ble musene injisert med CM-Dil-merkede celler høstet 3-4 dager etter merking og injeksjon.
ES1
e Esterase-mangel alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) Mus
plasma fra SCID-mus inneholder høye nivåer av en gnager karboksylesterase som aktiverer CPT-11 [31], [32]. Derfor brukte vi esterase-mangel SCID-mus for alle
in vivo
terapeutiske studier [33]. Disse dyrene har nivåer av plasmaesterase sammenlignbare med de i humant plasma. Mus ble plassert i et AALAAC-akkreditert anlegget og ble gitt mat og vann ad libitum.
RT-PCR /PCR
Benmarg ble innhøstet fra tibia fra normale og tumorbærende mus, og RNA ble ekstrahert for RT-PCR deteksjon av tyrosin-hydroksylase (TH), en neuroblastom-cellemarkør. DNA ble ekstrahert fra en separat aliquot av benmarg for PCR av den V-
myc
genet for å identifisere HB1.F3.C1 celler. Primer sekvenser og RT-PCR betingelser for TH har vært publisert tidligere [21]. Standard fremgangsmåter ble anvendt for v-
myc
amplifikasjon ved anvendelse av en forover primer 5′-CCTTTGTTGATTTCGCCAAT-3 «og en revers primer for 5′-AGTTCTCCTCCTCCTCCTCG-3», med et glødetrinn på 62,5 ° C i 1 minutt i 30 sykluser. Den positive kontroll for TH ble RNA ekstrahert fra NB-1691-celler, og for v-
myc
gen var DNA fra HB1.F3.C1 celler. Negative kontroller inneholdt ingen RT eller ingen DNA, for TH og v-
myc
reaksjoner, henholdsvis.
histokjemi, Immunohistochemistry og immunfluorescens Imaging
Organer ble høstet, fiksert i 4 % paraformaldehyd /PBS, pH 7,4 og cryoprotected i 30% sukrose. Faste vev ble deretter integrert i oktober, serielt cryosectioned (10 mm), tine-montert på glassplater og lagres tørt ved -20 ° C. For rutinemessig histologisk screening, ble vevssnitt farget med hematoxylin og eosin av standardmetoder.
Tilstedeværelse av HB1.F3.C1 celler ved neuroblastom svulst loci eller i normalt vev ble undersøkt med fluorescens mikroskopi. I snitt preparert som beskrevet ovenfor, ble kjernene i alle celler farvet med DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol, Sigma Biochemical, St. Louis, MO; blå fluorescens), og detektert ved hjelp av epifluorescens-eksitasjons- /emisjonsfiltre av 340 -380 /420 nm (LP) (UV-2A, Nikon). HB1.F3.C1 celler, merket med CM-Dil (rød fluorescens), ble oppdaget ved hjelp av eksitasjon /emisjonsfiltre av 540-580 nm og 600-660 nm (Y-2E /C), ved hjelp av et Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop (Nikon Instruments, Melville, New York) er utstyrt med en SPOT RT Slider digitalkamera (diagnostiske instrumenter, Sterling Heights, MI). For å detektere humane neuroblastom-tumorer i mus vev, utførte vi immunhistokjemisk farging ved hjelp av et monoklonalt muse-antistoff som gjenkjenner humant mitokondrie protein (Chemicon, Temecula, CA). Snittene ble post-fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, skyllet, permeabilisert med 0,3% Triton X-100 /PBS, 30 min og inkubert i blokkeringsløsning (5% BSA + 3% normalt hesteserum + 0,1% Triton X-100 , 1 time). Seksjonene ble deretter inkubert sekvensielt med primært antistoff (1:100 fortynning) i 16 timer ved 4 ° C, biotinylert anti-mus IgG sekundært antistoff (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 2 timer, og avidin-FITC (Vector Laboratories) etter 1 time. Vevssnitt ble kontra med DAPI og montert med fluorescerende montering medium (DAKO). Den FITC fluorescens ble oppdaget av epifluorescence filter (465-495 nm eksitasjon, 515-555 nm utslipp, B-2E /C).
For rutinemessig histologisk evaluering av forekomst av svulster i forskjellige organer, vev seksjoner ble farget med hematoxylin og eosin. Tilstøtende seksjoner ble behandlet for immunoperoxidase-3,3′-diaminobenzidin (DAB) farging på samme måte som vev behandlet for fluorescens farging, bortsett fra at etter permeabiliseringen, ble endogene peroksydaser undertrykket med 0,3% hydrogenperoksyd /PBS i 30 min. Antistoffreaksjon til menneske mitokondriene ble senere oppdaget ved hjelp av en Vectastain ABC
Elite
kit (Vector Laboratories) og en peroxydasesubstrat Kit (Vector Laboratories) i henhold til produsentens anvisninger.
lav- og høy- forstørrelse bildene ble innhentet ved hjelp av et Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop (Nikon Instruments, Melville, New York) er utstyrt med lysfelt og fluorescens belysning. Bilder ble tatt opp og lagret ved hjelp av SPOT Avansert og Adobe Photoshop-programvare.
Modifisert Boyden Chamber celle migrasjon analysen
Modifisert Boyden kammer analyser ble brukt til å vurdere
in vitro
tropisme av HB1.F3.C1 celler til kreftcellekondisjonerte medier eller for å kontrollere media, ved hjelp av standard metoder. Kort sagt ble HB1.F3.C1 celler transdusert med en MOI på 0, 5, 10 eller 20 AdCMVrCE trypsinert, vasket og resuspendert i DMEM inneholdende 5% BSA. Celler (3 x 10
4 celler /100 ul) ble plassert inn i de øvre kamre og neuroblastom-celle-kondisjonert medium i nedre kammer. Neuroblastom celle-kondisjonert medium i både øvre og nedre kammer omfattet chemokinesis kontroll uten en kjemotiltrekkende gradient. Celler ble tillatt å migrere i 4 timer i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. Antallet migrerte celler HB1.F3.C1 i det nedre kammer i hver brønn ble kvantifisert ved bruk av CyQuant GR fluorescerende fargestoff (Chemicon) og en fluorescens mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Animal Studies
Disseminert neuroblastom ble produsert ved å injisere 5 × 10
5 NB-1691, NB-1643, eller SK-N-AS celler inn i halevenen hos mus. Vanligvis disse musene krever aktiv dødshjelp ca 75 dager etter injeksjon av neuroblastom celler. Brutto svulster i flere organer er synlige ved obduksjon. Denne metastatisk neuroblastom modellen har blitt godt karakterisert og er meget reproduserbar med hensyn til sykdomsforløpet og organene [34]. I tillegg oppsummerer modellen klinisk mønster av metastatisk neuroblastom ved at tumorer utvikles i multiple loci, blant annet i binyrene, benmarg og lever.
Hver behandlingsgruppe inkluderte 10 mus, overvåket daglig for tilstedeværelsen av sykdommen eller dårlig helse. Ukeplanen for administrasjon av HB1.F3.C1 celler og CPT-11 (7,5 mg /kg) er illustrert i figur 8. Dette regime ble administrert i 2 sammenhengende uker, etterfulgt av en 2 ukers hvileperiode og deretter en annen 2- ukers kurs av behandlingen. Alle dyr protokoller ble godkjent av City of Hope eller St. Jude Children Research Hospital IACUC. Når mus syntes å være i ubehag eller lidelse som bedømmes av uavhengige dyrepleiepersonell uten kunnskap om protokollen design, ble dyrene avlives. Alle avlives mus ble verifisert som tumorbærende ved obduksjon. Den endepunktet for den terapeutiske studien var langsiktig overlevelse.
SK-N-AS-celler (5 × 10
5) omformet til å uttrykke luciferase ble injisert i halevenen.
En måned etter injeksjon av tumorceller, ble musene injisert intraperitonealt med luciferin og avbildes ved hjelp av en Xenogen IVIS Imaging system, ifølge anvisningene fra produsenten.
Flere svulster var til stede i 100% av musene.
To representative mus er vist.
human neuroblastom-tumorceller ble injisert intravenøst for å produsere spredte tumorer.
på et passende tidspunkt etter injeksjon av neuroblastom-celler, neurale stamceller eller neurale stamcelle celler transdusert med adenovirus for å uttrykke et promedikament-aktiverende enzym (i denne studien, en utskilt form av kanin karboksylesterase [RCE]) blir injisert intravenøst.
Etter migrering av stamceller eller progenitorceller til tumorbrennpunktene, og en forsinkelse på 3-4 dager for å tillate forholdsvis høyt nivå ekspresjon av prodrug-aktiverende enzym inn i det ekstracellulære miljø ved tumor områder, blir musene behandlet med promedikamentet (i denne studien, CPT-11).
prodrug aktiveres selektivt ved tumor brennpunkter, for å øke den terapeutiske indeks av prodruget
(A) dissekert leveren fra et representativt dyr med levermetastaser.; ble dyret ofret to dager etter injeksjon av HB1.F3.C1 celler i halevenen.
(B) Lav- og (C) høy effekt forstørrelse av en seksjon av tumor-involvert lever, farget med . hematoxylin og eosin
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP vises mørk lilla (svarte piler); . Normalt vev synes rosa
(D) Liver seksjon farget med en anti-human mitokondrie protein antistoff og kontra med hematoksylin
Tumor mikrometastaser flekken mørk brun (røde piler).; normalt levervev er lilla.
(E) Immunofluorescensanalyse mikroskopi av leveren delen.
HB1.F3.C1 celler ble CM-Dil-merket før injeksjon, og er tydelig som røde celler.
leveren delen var farget med DAPI; tumor foci identifiseres av områder med tett pakket DAPI-farget tumor cellekjerner.
De røde pilene viser ekstravaserte HB1.F3.C1 celler proksimalt for en levervene (v).
Inset er stor forstørrelse av en DII-merket HB1.F3.C1 celle i tumoren. (F-H) Liver delen fra en svulst bærende dyr som fikk CM-Dil-merket HB1.F3.C1 celler ble farget med FITC-konjugert menneskelig spesifikk mitokondrie antistoff.
(F) Red CM-Dil -merkede HB1.F3.C1 celler.
(G) Den samme delen som viser FITC-merket (grønn) humane tumorceller og HB1.F3.C1 celler.
(H) overlegg av F (rød CM-Dil HB1.F3.C1 celler) og G (grønn FITC HB1.F3.C1 og kreftceller).
HB1.F3.C1 celler (orange /gul celler som markeres med hvite piler) migrert til levermikrometastaser (grønne celler) og infiltrert svulsten parenchyma i nærhet av en blodåre (bv, hvite stiplede linjer)
Scale barer:. 1 cm (A), 2 mm (B), 500 mikrometer (C), 200 mikrometer (F, G), 100 mikrometer (D, E, H), 10 mikrometer (E innfelt).
X-ray bilde av hind lem av en mus med avansert stadium neuroblastom (dag 82, venstre panel, målestokk: 1 cm)
bekreftelse av tumormassen som human SK-N-AS neuroblastom-celler ble utført ved hjelp av immunhistokjemi anti-humant mitokondrier antistoff (som ikke er vist. )
CM-Dil-merket HB1.F3.C1 celler (røde celler, injisert i halevenen 3 dager før ofre) lokalisert til svulst i margen (panel rett.; skala bar. 200 mikrometer)
konkordant påvisning av v-
myc plakater (HB1.F3.C1 celler) ved PCR og TH uttrykk (neuroblastom celler) ved RT-PCR i benmargsprøver.
benmarg prøver isolert fra dyr som er injisert med HB1.F3.C1 celler ble analysert for tilstedeværelse av v-
myc
(HB1.F3.C1 celler) eller ekspresjon av TH (NB-1643-celler).
HB1.F3.C1 celler var tilstede i benmargen bare når tumorceller var også til stede.
HB1.F3.C1 celler ble ikke detektert i benmargen av ikke-tumorbærende dyr.
de positive kontroller (+) ble DNA ekstrahert fra HB1.F3.C1 celler for v-
myc
, og RNA hentet fra NB -1691 celler for TH
De negative kontroller. (-) inneholdt ingen DNA eller RNA mal, henholdsvis
Normal og tumorbærende organer ble høstet, seksjonert og farget med. DAPI. HB1.F3.C1 celler ble ikke oppdaget i normal (A) hjernen, (B) nyre, (C) hjerte, (D) tarmen, eller (E) hudvev.
Rare, singel, HB1. F3.C1 celler (hvite piler) ble sett i (F) lunge, (G) lever og (H) milt
Scale barer:. 200 mikrometer (A-E), 100 mikrometer (F-H) .
Barer representerer gjennomsnittlig antall migrerte celler ± SEM av tredoble brønner i modifiserte Boyden kammer analyser.
en dag før den brukes i behandling, celler ble transduced med AdCMVrCE konstruksjon (se tekst).
den behandlingsplanen var basert på tids løpet av uttrykk for utskilt form av RCE, etter adenovirus transduksjon av HB1.F3.C1 celler (Danks, upublisert observasjon) og på en tidsplan for administrasjon av CPT-11 som har vist seg å være relativt effektiv for neuroblastom pasienter [35].
Statistiske analyser
Alle data ble analysert med GraphPad Prism programvare (San Diego, California). Analyser av resultatene cellemigrering (gjennomsnittlig celletall verdier ± S.E.M..) Av untransduced celler ble sammenlignet med celler transdusert med adenovirus. Disse dataene ble analysert ved hjelp av en to-tailed
t
-test. Analyse av Kaplan-Meier plott sammenlignet overlevelse av 10 mus per gruppe ved hjelp av en log-rank (Mantel-Haenszel) -metoden.
Resultater
Mus Modell av metastatisk Nevroblastom
Intravenøs injeksjon av 5 × 10
5 NB-1691, NB-1643, eller SK-N-AS humane neuroblastom celler produserer disseminert neuroblastom i 100% av esterase-mangel SCID mus. Den spres natur av tumorer er tydelig i figur 1 i to mus som fikk injeksjoner av halevene SK-N-AS-celler transdusert til å uttrykke luciferase. En måned etter injeksjon av neuroblastom celler ble luciferase underlaget luciferin injisert intraperitonealt til å visualisere svulster
in situ
. I samsvar med publiserte rapporter, svulster var til stede i flere organer og anatomiske steder, inkludert magen, beinmarg, lever og lunger [21], [34]. Siden 100% av musene injisert med neuroblastom-celler utvikle disseminert sykdom som til slutt resulterer i døden, denne modellen lettere evalueringen av terapeutiske eksperimenter som ble utført i henhold til skjemaet på figur 2. Denne figuren illustrerer den hypotese som skal testes. Mus injisert med menneske neuroblastom celler utvikle flere svulster. To uker etter injeksjon av neuroblastom-celler, blir HB1.F3.C1 celler transdusert med adenovirus som koder for et promedikament-aktiverende enzym administrert intravenøst. Tre dager senere, etter HB1.F3.C1 cellene er lokalisert fortrinnsvis til tumorsteder og prodrug-aktiverende enzym (RCE i denne studien) blir uttrykt ved høye nivåer, er prodrug (CPT-11) administrering initieres, gitt på en forutbestemt optimal timeplan. Den antitumor effekt av prodrug alene kan deretter sammenlignes med samtidig administrering av HB1.F3.C1 celler og prodrug, ved hjelp av overlevelse som endepunkt.
Lokalisering av HB.F3.C1 Cells til Nevroblastom Tumor i Liver
Hvis du først bekrefte at HB1.F3.C1 celler migrerer til og lokalisere ved disseminert neuroblastom svulster, ble mus med etablerte NB-1643 svulster injisert intravenøst med 2 × 10
6 CM-Dil merket HB1.F3. C1 celler. Etter 3 dager ble normale og tumorbærende organer fjernet og gjennomskåret, og bedømt mikroskopisk. Som vist i figur 3, multiple tumorer var tydelig ved grov inspeksjon i lever fra en representativ mus (panel A), og også ved mikroskopisk evaluering av Hematoxylin /eosin farget seksjoner (panelene B og C, fiolette områder) og immunoperoksidasefarging for human mitokondrie protein (panel D, brune områder). HB1.F3.C1 celler samlokalisert med disse tumor brennpunkter, som demonstrert av CM-Dil-merket, røde celler sett i panelet E. Dette panelet viser også ekstravasasjon av HB1.F3.C1 celler og deres migrasjon fra hepatiske vene (v). Panel F viser HB1.F3.C1 NSCs (CM-Dil-merket, rød) og panel G viser samme seksjonen farget med menneskelige mitokondrie antistoff-FITC (menneskelige NSCs og kreftceller, grønn). Panel H, et overlegg av plater F og G, demonstrerer ko-lokalisering av HB1.F3.C1 celler (orange /gul, angitt med hvite piler) og tumorceller (grønn), på steder umiddelbart ved siden av og fjernt fra blodkaret (bv). Lignende resultater ble observert for svulster i flere andre organer, inkludert eggstokk (ikke vist) og benmarg (figur 4).
HB1.F3.C1 Cells Lokal til neuroblastom metastaser i benmarg
siden benmarg er en hyppig åsted for neuroblastom metastase og marg aspirates eller biopsier brukes til å dokumentere stadium av sykdommen i høyrisikopasienter, søkte vi å finne ut om HB1.F3.C1 celler også infiltrert svulster på dette området. Den venstre panel av Figur 4 viser røntgen av femur av mus som bærer en makroskopisk tumor som har sin opprinnelse i benmargen. Dette dyret ble injisert intravenøst med CM-Dil-merket HB1.F3.C1 celler og avlivet tre dager senere. Arealet av benet angitt med rødt rektangel ble deretter behandlet for immunofluorescens-mikroskopi. høyre panel av Figur 4 viser tydelig HB1.F3.C1 celler (rød fluorescens) infiltrere tumorbærende marg, dokumentere at disse cellene migrert til og samlokalisert med makroskopiske tumorer (figur 4) samt mikroskopiske tumorer (figur 3 ). Imidlertid, mens interessant, betraktet vi det mer viktig og relevant å demonstrere migrering av HB1.F3.C1 celler til mikroskopiske tumorer i benmarg (figur 5), som ved sykdom tilbakefall er antatt å stamme fra gjenværende tumorceller som er tilstede i margen eller på primære områder. Dessuten er det viktig for en vellykket klinisk anvendelse av denne tilnærmingen for å vise at HB1.F3.C1 celler ikke er tilstede i normalt vev (figurene 5, 6).
Molecular Evidence for HB1.F3.C1 Cell og tumor Cell Co-lokalisering i Bone Marrow
for å ta det første av disse to spørsmålene, evaluert vi migrasjon av HB1.F3.C1 celler til kreftceller i benmargen, ved hjelp av en sensitiv molekylær tilnærming for å påvise tilstedeværelse av minimale antall av tumorer celler og /eller HB1.F3.C1 celler. For å oppnå dette, høstet vi marg fra mus som var blitt injisert intravenøst med NB-1691-celler, etterfulgt av HB1.F3.C1 cellene to uker senere. Som nevnt ovenfor, i det denne «trinn» av sykdom, tumorer er ikke påvisbar mikroskopisk. Vi så brukt PCR for å påvise v-
myc
-genet til stede i HB1.F3.C1 celler og RT-PCR for å påvise tyrosin hydroksylase (TH), en neuroblastom-cellemarkør. Dataene i Figur 5 viser at enten begge v-
myc Hotell og TH eller ingen av disse markørene ble oppdaget i en gitt marg. Dersom marg inneholdt tumorceller som antydet ved et påvisbart signal for TH, HB1.F3.C1-celler (et positivt signal for v-
myc
) var også til stede. Motsatt, når ingen neuroblastom celler ble oppdaget, HB1.F3.C1 celler var på samme måte umulig å oppdage. Denne «co-lokalisering» oppstod i løpet av 1 time etter injeksjon og vedvarte i minst 7 dager. Disse dataene er konsistent med resultatene i figur 3 og 4, og viser at HB1.F3.C1 celler raskt migrere til kreftceller
in vivo
.
Få HB1.F3.C1 celler finnes i normalt vev
for terapi å være tumor-selektive, var det også viktig å vise at HB1.F3.C1 cellene ikke migrere til andre normale vev. Følgelig, 2 x 10
6 CM-Dil-merkede celler ble injisert intravenøst i mus med NB-1643 tumorer og etter 3 dager ble alle organer fjernet og evaluert med hensyn på tilstedeværelse av HB1.F3.C1 celler. Figur 6 viser at få, om noen, HB1.F3.C1 celler var tilstede i normal hjerne, nyre, hjerte, tarm eller hudvev (panelene A-E, henholdsvis). Av og til, ble en enkelt celle observert i lunge, lever eller milt (panelene F-H, henholdsvis), men ingen fokus av CM-Dil fluorescens ble observert i noe normalt vev av en hvilken som helst av fem mus undersøkt. Vi konkluderte med at HB1.F3.C1 celler migrert selektivt til neuroblastom celler etter intravenøs injeksjon.
Terapeutisk effektivitet for behandling av metastatisk Nevroblastom
Etter å ha fastslått at HB1.F3.C1 cellene er tumor- tropisk
in vivo
, vurderte vi antitumor effekt av våre nevrale stilk /stamceller styrt enzym prodrug (NDEPT) tilnærming til terapi, ved hjelp HB1.F3.C1 celler transduced å uttrykke en utskilt form av en kanin karboksylesterase (RCE) og anticancer prodrug CPT-11. Vi først bekreftet, ved bruk av modifiserte Boyden kammer analyser, som adenoviral transduksjon og ekspresjon av RCE endret ikke de tropiske egenskaper av HB1.F3.C1-celler (figur 7). Vi har også bestemt at det maksimale nivået av ekspresjon av RCE inntraff 3-4 dager etter transduksjon (data ikke vist). Vi transduced HB1.F3.C1 celler med replikering-mangel adenovirus koding RCE, og injisert intravenøst de omsatte cellene i mus med disseminert SK-N-AS svulster. Mus ble behandlet i henhold til protokollen som er vist skjematisk i figur 8. Som vist i figuren, fire dager etter injeksjon av HB1.F3.C1 + AdCMVrCE celler (tre dager etter injeksjon av HB1.F3.C1 celler), satte vi behandling med CPT-11 (7,5 mg /kg) på daglig × 5 timeplan, en optimal doseringsplan for pasienter med neuroblastom. Denne behandlingen ble gjentatt neste uke, etterfulgt av en 2 ukers hvileperiode og deretter en annen to-ukers kurs for terapi. Kaplan-Meier graf i Figur 9 viser overlevelsesdata av ubehandlede mus sammenlignet med mus behandlet med CPT-11 bare, eller med en kombinasjon av HB1.F3.C1 celler som uttrykker RCE og CPT-11.
