Abstract
Bakgrunn
akt1 (v-akt murin thymoma viral onkogen homolog 1) er en kinase av den aktiverte oftest proliferert og overlevelsesreaksjonsveien av kreft. Nylig er det blitt vist at E17K mutasjon i Pleckstrin homologi (PH) domene av akt1 protein fører til kreft ved å forsterke fosforyleringen og membran lokalisering av protein. Mutant har vist motstand mot akt1 /2-hemmer VIII narkotika molekyl. I denne studien har vi vist de detaljerte strukturelle og molekylære konsekvenser forbundet med aktiviteten regulering av mutant protein.
Metoder
Dokking poengsum utstilt betydelig tap i samspillet affinitet til akt1 /2-hemmer VIII medikamentmolekylet. Videre er molekylære dynamikk simuleringsstudier presentert et tegn på hurtig konformasjonell drift observeres i mutanten struktur.
Resultatene
Det var ikke noe tap i stabilitet mutanten sammenlignet med naturlig struktur og den store kation-π interaksjoner ble også vist å være beholdt. Videre er de aktive residuer som er involvert i membran lokalisering av protein oppviste betydelig økning i NHbonds dannelse i mutant. Økningen i NHbond dannelse i aktive rester står for den 4 ganger økning i membranen lokalisering potensialet i protein.
Konklusjon
Det samlede resultatet antydet at selv om mutasjonen ikke forårsake noen stabilitet tap i struktur, kan de tilhørende patologiske konsekvenser har oppstått på grunn av den raske konforme driver observert i mutant akt1 PH domene.
Generelt Betydningen
metodikken gjennomført og resultatene oppnådd i dette arbeidet vil lette å bestemme kjernen molekylære mekanismer for kreft mutasjoner og i å utforme sine potensielle legemiddel hemmere
Citation. Kumar A, Purohit R (2013) Kreft Associated E17K Mutation Forårsaker Rapid Konformasjonell Drift i akt1 Pleckstrin homologi (PH ) Domene. PLoS ONE 8 (5): e64364. doi: 10,1371 /journal.pone.0064364
Redaktør: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Frankrike
mottatt: 30 januar 2013; Akseptert: 12. april 2013, Publisert: 31 mai 2013
Copyright: © 2013 Kumar, Purohit. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
akt1 (v-akt murine thymom viral onkogen homolog 1) kinase er et medlem av muligens de mest vanlige aktiverte proliferasjon og overlevelse bane i kreft [1] – [6]. AKT genet familiemedlemmer er assosiert med kreft hos mennesker; spesielt fremtredende er den genetiske forsterkning av akt2. Punktmutasjon i akt1 har blitt påvist i Proteus syndrom [2], endometrial karsinom [4], [7] og leukemi [5], [8] – [9], genamplifikasjon i en enkelt gastrisk karsinom ut av en skjerm av mer enn 225 forskjellige humane ondartede sykdommer [10], og i en gliosarcoma av 103 ondartet kreft glial [11]. I en annen studie ble det funnet at akt1 kinase aktivitet ble ofte forhøyet i flere high-end, sene stadier av kreft [12] selv om de nøyaktige mekanismene for slike observasjoner er fortsatt uklart. Aktiveringen av akt1 er drevet av membran lokalisering, noe som i sin tur initiert ved bindingen av pleckstrin homologi (PH) domene til fosfatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (ptdins (3,4,5) P3) eller phosphatidylinositol- 3,4-bisfosfat (ptdins (3,4) P2), etterfulgt av fosforylering av regulerings aminosyrene serin 473 (Ser 473) og treonin 308 (Thr 308) [3], [13]. Den patologiske foreningen av AKT med plasmamembranen er en felles tråd som forbinder AKT til kreft [1] – [7], [14] – [15]. Den onkogene oppførselen til Gag-AKT fusjonsprotein fra murine leukemi retrovirus AKT8 (v-akt murine thymom viral onkogen homolog 8) krever en membran-måls myristoylation signal den første presumptive bevis for at patologisk membran lokalisering av akt1 kinase aktivitet kan trans hos mus [16]. Videre er betydningen av AKT i human kreft i stor grad utledes fra hyppigst forekommende mutasjoner i enzymer som regulerer aktiviteten til disse sekundære budbringersystemer fosfolipider (ptdins (3,4,5) P3, ptdins (3,4) P2), og til syvende og sist fører aktivering av AKT gjennom membranen rekruttering [1], [3], [17], [18]. Svulster prøver fra pasienter med brystkreft, tykktarmskreft og tilfeller av leukemi er vist på vanlige havn aktivesomatiske mutasjoner i akt1 [1], [5]. I tillegg er tap av tilhørende samvirkende medlemmer slik som fosfatase og tensin homolog (PTEN) lipid fosfatase-aktivitet er rapportert i glioblastom, prostata og livmorkreft ved hjelp av somatiske mutasjoner [11], eller ved brystkreft ved hjelp av epigenetisk stanse [12], som representerer en alternativ indirekte mekanisme for aktivering av AKT. Derfor synes akt1 å ha en avgjørende, men passiv rolle i onkogenese og fungerer som en indirekte mellomledd mellom muterte oppstrøms regulatoriske proteiner og nedstrøms signalmolekyler.
onkogen aktivering av akt1 kan være forårsaket av flere midler, mest vanlig forekommende enten på grunn av kompromiss i sin membran-målretting av PH domene, eller på grunn av de patologiske konformasjonsendringer som forekommer i det mutante struktur. De genetiske mutasjoner i PH domene har tidligere blitt rapportert å forstyrre lokalisering atferd og tap av følsomhet mot ptdins og har ført til store konsekvenser for sin funksjonelle oppførsel [1]. Mens screening årsakene bak en slik observasjon, danner beregnings tilnærmingen en betydelig ryggrad og serverer i gjennomføring ivrige eksperimentelle observasjonene i lavkostland inngang. En punktmutasjon ved nukleotid 49 som resulterer i en substitusjons lysin for glutaminsyre ved aminosyre 17 (AKT (E17K)) har vært implisert i krefttilfeller [1], [3], [19] – [21]. Den molekylære årsaken bak tilhørende onkologiske resultatet er ennå ikke undersøkt i mye detalj. Det er kjent at binding av phosphoinositides til PH domene aktiveres akt1. I apo konformasjon, Glu 17 opptar phosphoinositide-bindende lomme og danner et nettverk av hydrogenbindinger. I arbeidet med Carpten et al. (2007), ble det vist at Lys 17 substitusjonen resulterer i en endring i overflateladning rundt lommen fra negativ med Glu 17 for effektivt nøytralt i mutanten [1]. Denne mutasjonen har resultert i et økt nivå av AKT fosforylering på Thr 308 og Ser 473 sammenlignet med vill-type. Akt1 (E17K) kinase aktivitet ble vist å være omtrent fire ganger høyere enn den til akt1 (WT), noe som tyder på at mutasjonen har endret akt1 regulering og dermed det forbedrer cellulær aktivitet [1]. Videre har det også vært foreslått at mutasjonen forårsaker stor affinitet for økning PI (4,5) P2 som er avgjørende for den konstitutive plasmamembranen målretting av mutanten PH domene og således til den onkogene arten av full-lengde proteinet E17K akt1 [3]. Dessuten ble det også foreslått at den E17K PH domene mutasjon forårsaket strukturelle endringer i pH-domenet, noe som ytterligere hindret dets interaksjon med akt1 /2 inhibitor VIII [1]. Alle disse observasjonene tyder sterkt på at de skadelige konformasjonsendringer i mutant PH domene kan ha forårsaket slike patologiske utfall.
Molecular dynamisk simulering (MDS) har vært en lovende tilnærming for å undersøke konformasjonsendringer i mutant protein struktur med hensyn til dets opprinnelige konformasjon [22] – [29]. Vi vet at endringer i den konformasjonelle orientering av et proteinmolekyl påvirker dens vekselvirkning med ligand så vel som dets biologiske partnere. I dette arbeidet fokusert vi vår studie på å undersøke endringer i dynamisk oppførsel av akt1 PH domene indusert av kreft forårsaker E17K mutasjon. Tidligere undersøkelser har vist at E17K mutasjon har en potensiell rolle i å indusere vesentlig endring i akt1-PH domene konformasjon, så vel som å indusere motstandsdyktighet mot akt1 /2 inhibitor VIII [1]. Vi har utført MDS i forestillingen å antyde de konforme endringene som skjer i mutant struktur som kan forklare de observerte molekylære endringer og tilhørende patologiske utfall. Videre tilkoblings studiene hjalp også til å bestemme endringer i ligand-interaksjonen affinitet til protein. Samlet våre resultater gitt et sterkt bevis på stor konformasjonsendring drift forekommer i mutant protein sammenlignet med de innfødte.
Materialer og metoder
Datasett
Vi valgte krystallstrukturer av innfødte PH (PDB ID: 1UNP), E17K struktur (PDB ID: 2UZS) og struktur av akt1 /2-hemmer VIII (PDB ID: 3O96) fra Brookhaven Protein dataene Bank [30] for vår undersøkelse. De oppnådde strukturene var energi reduseres ved bruk GROMOS96 43a1 Forcefield gjennom gromacs 4.5.4.package [31].
kationer π Interactions
kationer rc interaksjoner ble beregnet ved hjelp av registreringsprogram [32]. Kation-rc interaksjoner i proteinstrukturer ble identifisert og evaluert ved hjelp av en energibasert kriterium for å velge vesentlige sidekjede-par. Den prosentvise sammensetning av en bestemt aminosyrerest som bidrar til kation-π interaksjoner oppnås fra ligningen: hvor «i» står for de fem rester (Lys, Arg, Phe, Trp og Tyr),
n
cat-π er antall av rester som er involvert i kationer π interaksjoner, og
n product: (i) er antall rester av type «i» i de vurderte proteinstrukturer.
Furthere den kation-π interaksjon er i økende grad anerkjent som en viktig ikke-kovalent binding samhandling relevant for strukturbiologi. Den bruker en variant av de optimaliserte potensialene for flytende simuleringer (OPLS) kraftfelt for å tilveiebringe en energisk evaluering av alle mulige kationer π interaksjoner i et protein. Den elektrostatiske energi () beregnes ved hjelp av ligningen: hvor og er kostnadene for atomene
i
og
j
, henholdsvis, og er avstanden mellom dem. Van der Waals energi er gitt ved:
Hvor og; og er van der Waals radius og brønndybde, henholdsvis.
Hvis ≤-2,0 kcal /mol, er paret regnet som et kation-π interaksjon. Dersom -1,0 kcal /mol, er strukturen avvist. Hvis -2,0 ≤-1,0 kcal /mol, er strukturen beholdt bare hvis ≤-1,0 kcal /mol
ligandbindende Cavity Analyse
ligandbindende hulrom akt1 PH domenestruktur ble. undersøkt ved CASTp verktøy [33]. CASTp implementerer inkrementelle vanlige trianguleringer, ofte referert som veide Delaunay triangulering og alfa komplisert å måle formen complimentarity av gitt makromolekyl. Den måler også overflate tilgjengelige lommer og innvendige hulrom som er utilgjengelige. Tiltak følge analytiske beregninger identifiserer areal og volum av hver lomme og hulrom [33].
Komplementaritet Analyse
Vi brukte webserver PatchDock [34] for å beregne komplementaritet av akt1 /2-hemmer VIII og akt1 PH domene. Den underliggende prinsippet om denne serveren er basert på molekylær form representasjon, overflate patch matchende pluss filtrering og scoring. Det er rettet mot å finne tilkoblingstransformasjoner som gir god molekylær form komplementaritet. Slike transformasjoner, når den brukes, indusere både brede grensesnittområder og små mengder steriske sammenstøt. Segmentering algoritme implementated for påvisning av geometriske patcher. Flekkene blir filtrert, slik at bare lapper med «hot spot» rester beholdes. Videre er hybrid av geometriske Hashing og Pose-Clustering matchende teknikker implimented å matche patcher. Alle komplekser med uakseptable gjennomføringer av atomer av reseptoren til atomer av liganden kastes. Til slutt blir de gjenværende kandidatene rangeres i henhold til en geometrisk form komplementaritet stillingen. 3D-koordinatene av innfødte og mutante strukturer ble utsatt for docking med akt1 /2-hemmer VIII.
Docking Analyse
Molekylære docking studier ble utført for å undersøke hvilken rolle mutasjon i å påvirke akt1 /2-hemmer VIII bindingsaktiviteten av kinesin domene ved å bruke Autodock 4.0 [35]. AutoDockTools 1.4.6 ble brukt for å etablere Autogrid punkter samt visualisering av forankrede ligand-aminosyre strukturer [35]. Grid kart sentrert på ligander bindingsstedene for innfødte og mutante strukturer ble konstruert for å dekke akt1 /2-hemmer VIII bindende lommer. Lamarckian genetisk algoritme ble brukt til å utføre molekyltilkoblings simuleringer. Simuleringer ble utført ved hjelp av opp til 2,5 millioner energi evalueringer med maksimalt 27000 generasjoner. De laveste energi conformations ble ansett som bindende conformations mellom akt1 /2-hemmer VIII og PH domene.
Molecular Dynamics Simulering
Molecular Dynamics Simulering ble utført ved hjelp gromacs 4.5.4 pakke [31] . Strukturer av innfødte og mutant PH ble brukt som utgangspunkt for MD simuleringer. Systems ble oppløst i en rektangulær boks med TIP3P vannmolekyler på 10 en marginal radius. Ved fysiologisk pH strukturene ble funnet å være negativt ladet, således for å gjøre simuleringen system elektrisk nøytral, tilsatte vi 2 kloridioner (CL
-) i simulatoren boksen ved hjelp av «Genion» -verktøyet som følger med gromacs pakke . Opprinnelige løsemiddelmolekylene var avslappet mens alle de oppløste atomer ble harmonisk behersket til sine opprinnelige posisjoner med en kraft konstant på 100 kcal /mol for 5000 skritt. Emtol konvergenskriterium på 1000 kcal /mol og fourierspacing på 0,12 nm ble anvendt. Etter dette ble hele molekyl system underkastet energi minimalisering ved hjelp av konjugert gradient metode. Berendsen temperatur koblingsmetoden [36] ble brukt til å regulere temperaturen inne i boksen. Isotropisk trykk kobling ble utført ved anvendelse av Parrinello-Rahman metode. Elektrostatiske interaksjoner ble beregnet ved hjelp av partikkel Mesh Ewald metoden [37]. Ioniseringen tilstander av residuet ble satt egnet til pH 7 med alle histidiner antatt nøytral. Trykket ble holdt ved 1 atm med det tillatte kompressibilitet rekke 4.5E
-5 atm. SHAKE algoritme ble brukt til å begrense bindingslengdene som involverer hydrogen, som tillater en tid steg på 2 fs. Van der Waals og Coulomb interaksjoner ble avkortet på 1,0 nm. Den ikke-limt par listen ble oppdatert hvert 10. trinn og conformations ble lagret hver 0,5 ps. Posisjon beherskelse simulering for 2000 ps ble iverksatt for å tillate løsemiddel molekyler å gå inn i hulrom region av struktur. Til slutt, systemer ble underkastet MD simulering for 50 ns. Vi har beregnet den sammenlignende analyse av strukturelle avvik i native og mutante PH struktur. RMSD, RMSF, SAS og Rg analyse ble utført ved hjelp g_rms, g_rmsf, g_sas og g_gyrate verktøy hhv. Antall forskjellige hydrogenbindinger som dannes ved spesifikke rester til andre aminosyrer i proteinet i løpet av simuleringen (NHbond) ble beregnet ved bruk av g_hbond. NHbond bestemt på basis av donor-akseptor avstand som er mindre enn 0,35 nm og av donor-hydrogen-akseptor. Grafer ble plottet ved hjelp av Grace GUI toolkit 5.1.22-versjonen.
Diskusjon
Carpten et al
Resultater og. (2007) foreslo at E17K mutasjonen hadde forårsaket store heving i akt1 aktivitet [1]. I henhold til de slutninger som er presentert i sitt arbeid, forårsaker mutasjonen signifikant forandring i konformasjonen til akt1 PH domene som til slutt fører til over fosforylering, 4,5 gangers økning i dets membran lokalisering tendens og heving av kinase aktivitet som kan føre til kreft [1] – [6]. Dessuten forårsaker mutasjonen tap i binding med akt1 /2 inhibitor VIII. Selv om de eksperimentelle resultatene er presentert den marginale oversikt over den molekylære mekanisme forbundet med E17K mutasjon, vi fortsatt mangler detaljert forklaring av den observerte fenotype på molekylært og atomært nivå. For å forstå de tilhørende strukturelle og molekylære endringer, gjennomførte vi molekylær docking og molekylær dynamikk simulering. Resultater oppnådd i vår studie gitt interessante slutninger, peker mot rask konformasjonsendring drift i E17K PH domene. Først undersøkte vi den mest tilgjengelige ligandbindende hulrom akt1 PH domene hjelp CASTp verktøyet. Fra CASTp resultatene var det klart at restene 38 til 52 og 77 til 87 aminosyre-posisjoner danner de mest tilgjengelige hulromsområdene for ligand-interaksjon. For å undersøke endringen i bindende affinitet i native og mutant protein, vi videre gjennomført complimentarity analyse ved hjelp patchdock verktøyet. I patchdock resultater totalt docking score på mutant med ligand ble funnet å være lavere sammenlignet med naturlig struktur (tabell 1).
Molekylær docking-analyse ble utført med Autodock 4,0 pakke for å avdekke endringer i akt1 /2 inhibitor VIII bindingsaffinitet i mutant struktur sammenlignet med naturlig. Et bemerkelsesverdig tap av interaksjon affinitet ble observert hos mutant struktur sammenlignet med naturlig. I native den optimale bindingsenergien var -12,32 kcal /mol, mens i mutant det ble funnet å være -3,87 kcal /mol (tabell 1). En bedre innsikt av endring i molekylær interaksjon kan sees i fig. 1. Det ble observert totalt 6 aminosyrerest interaksjoner med akt1 /2-hemmer VIII i den opprinnelige strukturen, mens i mutant var det bare en interaksjon funnet. Videre mønstre av innfødte interaksjoner ble ikke beholdt i mutant struktur. Restene Met ett, Tjen to, Asp 3, Gin 59, Gin 79 og Arg 86, som var aktivt deltar i hemmer samhandling i native, ikke viser noen rolle i mutant struktur (Fig. 1). Disse molekylære interaksjoner avslørte de skadelige konsekvensene av mutasjon på akt1 /2-hemmer VIII interaksjon affinitet PH domene.
Struktur til venstre viser innfødte PH- akt1 /2-hemmer VIII kompleks og struktur til høyre viser mutant PH ( E17K) -. akt1 /2-hemmer VIII kompleks
Protein-ligand interaksjoner ble ofte ledsaget av betydelige endringer i sin konformasjon. Dermed å undersøke årsaken til akt1 /2-hemmer VIII bindende affinitet tap i mutant struktur og å forstå de strukturelle konsekvensene av E17K mutasjon, gjennomførte vi molekylær dynamikk simulering av innfødte og mutant akt1 PH domene. Vi undersøkte RMSD, RMSF, Rg, SASA og NHbond variasjon, og avstand svingninger mellom de viktige samspill rester på mors og mutant struktur. RMSD for alle Cα atomene fra den første strukturen ble beregnet som ble betraktet som den sentrale opprinnelse for å måle proteinsystem. Her RMSD måler gjennomsnittlig avstand mellom atomene protein ved de to påfølgende tilstander. På fig. 2 og fig. 3, innfødte og mutant PH protein viste tydelig mote av avvik til 13 ns fra sin start struktur, noe som resulterer i ryggraden RMSD ~0.3 i native og ~0.4 i mutant. Etter 13 ns, mutant PH protein viste ekstreme avvik mønster til slutten av simuleringen når sammenlignet med nativ. På 13 137 ps mutant strukturen viste en brå økning i RMSD verdi når opp til 3,36 nm og videre tilbake til 0,44 nm på 16 078 ps (fig. 2, Fig. 3). Denne trenden med svingninger fortsatte i mutant strukturen til slutten og viste ekstreme avvik sammenlignet med innfødte. Videre mutant nådd opp til sitt høyeste RMSD nivå på 35 931 ps, når opp til 4,9 nm. Alle disse data foreslo at mutant strukturen hadde gjennomgått tydelig conformational drift gjennom simulering, mens slike driver ikke ble observert i den opprinnelige strukturen. De ovenfor observerte konformasjonelle fonner var videre i overensstemmelse med resultatene som oppnås ved analyse av tidsavhengige variasjoner sekundær struktur gjennom DSSP analyse. Mutant struktur terminale rester viste konformasjonell drift fra alfa-helix å bøye formen, mens en slik avdrift ikke ble sett i native struktur (fig. 2). Videre ble ekstreme konforme driver observert i mutant mellom 25 NS-35 ns. Mengden av bøyninger betydelig øket etter 34 ns tidsintervall i mutant struktur (fig. 2). Spesielt i residuet området 80-105, ble det observert tydelig måte av konformasjonell drift fra alfaheliks til å bøye og spolen form i den mutante struktur (fig. 2), og er vist i fig. 4. Alle resultatene var tett i samsvars til RMSD avvik (fig. 2, fig. 3, fig. 4). Vi har også vist de overlagrede strukturer for nativt og mutant ved begynnelsen av simuleringen og for bestemte tidstrinn hvor den konformasjonelle fonnene oppstått ved høyere område (fig. 2). Det virket som om den raske drivende hadde også forårsaket visse domener overganger og konformasjonsforandringer endringer i mutant struktur, spesielt i den C-terminale region av PH domene, sammenlignet med naturlig.
Figur vises øverst representerer mors og mutant DSSP plot. I midten er de pålagte innfødte og mutante strukturer vist. Her de innfødte er vist i grønt og mutant i rødt. Nederst er det RMSD plottet vist. Native vises i svart og mutant i rødt.
Native vises i svart og mutant i rødt.
Her mors vises i grønt og mutant i rødt.
med sikte på å avgjøre om mutasjon påvirket dynamisk oppførsel av rester og å undersøke årsaken til slike konforme driver observert i RMSD og dSsp resultater ble RMSF verdier av innfødte og mutante ryggrad rester beregnet ( fig. 5). RMSF verdier av mutante restene ble funnet å være signifikant høyere hos mutant struktur sammenlignet med naturlig (fig. 5). Dette viste at den observerte drivende var ledsaget av økning i atom svingninger i mutanten struktur. Rotasjonsradien (Rg) er definert som den masse-vekt root mean square avstand av samling av atomer fra deres felles massesentrum. Derfor gir det et innblikk i den generelle dimensjonen av protein og har bistått i å undersøke begrepet raske konforme driver observert i mutant struktur. Treghetsradius tomt for Cα atomer av protein vs tid på 300 K er vist i fig. 6. RG svingninger i mutant struktur var svært lik de ovennevnte observerte RMSD endringer. Etter 13 137 ps ble det observert en plutselig økning i Rg-verdier i mutant struktur, som når opp til sitt høyeste nivå på 4,1 nm, mens Rg-verdien til naturlig struktur holdt seg på 1,5 nm. Videre på 35931 ps nådde den opp til maksimal verdi av 5,62 i mutant. På slutten av simuleringen, viste mutant struktur Rg verdi på 4,16, mens i native ble det funnet å være 1,42.
Native vises i svart og mutant i rødt.
( a) Komplett Rg svingninger. (B) begrenses til maksimalt øvre Rg grense på 6 nm. Native vises i svart og mutant i rødt.
Løsemiddeltilgjengelighets areal kontoer for bimolecular areal assessable til løsemiddelmolekyler. Rise i SASA verdi i mutant struktur betegner det er relativ utvidelse i forhold til innfødte. Endringen av SASA av native og mutante proteiner med tiden er vist i fig. 7. Mutant protein indikerte større verdi av SASA med tiden, mens opprinnelig viste lavere SASA verdi. Lengre svingninger i Rg plottet indikerte at det mutante proteinet, så vel som ATP-bindende domene kan bli gjennomgår en betydelig strukturell overgang. Dette ble ytterligere understøttet av SASA resultat der mutant ble funnet å utvise stor SASA sammenlignet med naturlig. Alle disse observasjon kollektivt antydet at mutant kan ha gjennomgått drivende som til slutt førte til overgang til en åpen konformasjon og kan ha oppstått på grunn av stabilitets tap i proteinstruktur. For således å klargjøre dersom mutasjonen hadde forårsaket skader den strukturelle stabiliteten av proteinet under prosessen med drivende, undersøkte vi den totale energien svingning i hele simuleringen. Resultatene viste svært svak økning i total energiverdi i mutant struktur som utelukkes begrepet stabilitet tap forårsaket av mutasjon (Fig. 8).
Native vises i svart og mutant i rødt.
Native vises i svart og mutant i rødt.
Hydrogen obligasjon er den viktigste faktoren for å opprettholde den opprinnelige konformasjon av protein og protein fleksibilitet er direkte proporsjonal med intra NHbonds mellom aminosyreresidier [38] – [40]. Intramolekylær NHbond analyse av naturlige og mutante proteiner ble utført med hensyn på tid for å forstå forholdet mellom fleksibilitet og hydrogenbindingsdannelse. Mutant struktur viste et betydelig mindre antall av NHbond dannelse under simuleringen når sammenlignet med nativ struktur (fig. 9). Denne observasjonen var i samsvar med økningen i RG, og Saša verdier i mutant og sterkt antydet at de observerte konforme driver og økning i atomsvingninger skulle ha vekket på grunn av tap av NHbond formasjonen i protein. Videre aminosyreresidiene K30, K32, W36, R38, R40, Q53, R56, K57 og V58 hadde blitt vist å være aktive komponentene i deres lokalisering til membran [41]. Således vi beregnet antall NHbond forming av disse rester for å studere effekten av mutasjonen på membranen lokalisering. Selv om det totale antall NHbonds dannet i mutanten strukturen var betydelig lavere sammenlignet med naturlig, gjorde det totale antall NHbonds som dannes i disse rester ikke lider av noen vesentlige tap som følger av mutasjonen. Tap i NHbond dannelse ble observert i rester K30 og Q53, mens andre rester har enten viste høyere antall NHbonds eller opprettholdt den opprinnelige telling av NHbonds hele simuleringen i mutant struktur (fig. 10). Disse resultatene var også i sterk samsvars til observasjons rapportert av Carpten et al., (2007) [1] hvor det ble vist at mutasjonen hadde forårsaket betydelig økning i membranpotensialet lokalisering av protein. Økningen i NHbond formasjonen i disse rester kan være en sterk faktor i å forklare økningen i membranen lokalisering potensialet mutant protein.
Native vises i svart og mutant i rødt.
(a) K30 (b) K32 (c) W36 (d) R38 (e) R40 (f) Q53 (g) R56 (h) K57 (i) V58. Native vises i svart og mutant i rødt.
Betydningen av kation-π interaksjon hadde blitt undersøkt i flere undersøkelser for deres tilsvarende rolle i å opprettholde stabiliteten av proteiner. Vi undersøkte totalt 3 energetisk vesentlige kation-π interaksjoner blant Arg86-Phe55 (fig. 11a), Lys8-Trp99 (Fig. 11b) og Arg69-Trp22 i akt1 PH domene (fig. 11c). For å undersøke om de kationer π interaksjoner beholdes i mutant struktur, vi videre undersøkt svingningene forankringslengde for disse fjernt kation-π interaksjon. Det var bemerkelsesverdig observasjon at kation-π interaksjoner i naturlig så vel som mutant ble beholdt. Videre Arg69-Trp22 interaksjon viste tydelig svingning mønster og kan spille innflytelsesrik rolle i å indusere conformational drift (Fig. 11c). Ved kollektivt studere alle de strukturelle og molekylære endringer i akt1 PH domene kan vi si at den observerte conformational drivende, økning i atomsvingninger og tap av total NHbonds i mutant strukturen betydelig bidratt i å forårsake observert patologiske konsekvenser som følger av E17K mutasjon. Videre fire ganger økning i membran lokalisering potensial kan ha blitt forårsaket av økningen i NHbonds i aktive lokalisering rester av PH domene. Disse observasjonene førte oss til den konklusjon at kreften forbundet fenotypen observert i tilfelle av akt1 PH domene E17K mutasjon er forårsaket av de rapporterte molekyl og konformasjonsendringer som også forårsaker resistens mot akt1 /2 inhibitor VIII ved å indusere form drivende i dens tilsvarende bindende lomme .
(a) Arg86-Phe55 (b) Lys8-Trp99 (c) Arg69-Trp22. Native vises i svart og mutant i rødt.
Konklusjon
aminosyrevarianter vanligvis induserer patologiske utfall ved å skade den innfødte konformasjon av protein. Den E17K mutasjon i akt1 PH domene hadde blitt rapportert å indusere kreft og motstand mot akt1 /2-hemmer VIII. For å undersøke den detaljerte molekylære mekanismen bak slike utfall, gjennomførte vi molekylær docking og molekyldynamikk simulering av innfødte og mutant struktur. Stabiliteten og viktig aminosyre-interaksjoner ble beholdt i mutant struktur, som utelukkes muligheten for skadelige effekten av mutasjon. Videre ble det observert en brå økning i RMSD verdier og konforme driver i mutant sructure. Videre er motstanden mot akt1 /2 inhibitor VIII kraft var forårsaket av endringer i konformasjonelle struktur av den bindende lomme. I konklusjonen, det samlede resultatet exaplained at den molekylære årsaken til 4 ganger økning i mutant protein lokalisering og kinase aktivitet, som har slutt forårsaket kreft forbundet fenotyper.
Takk
Vi erkjenner takknemlig forvaltningen av Vellore Institute of Technology University og professor Riccardo Zecchina fra HuGeF-Torino for å gi muligheter til å utføre dette arbeidet.
