Abstract
Genterapi representerer en attraktiv strategi for ikke-invasiv behandling av prostatakreft, hvor aktuelle kliniske intervensjoner viser begrenset effekt. Her, evaluere vi bruken av insektvirus, baculovirus (BV), som en ny vektor for human prostatacancer genterapi. Siden prostatatumorer representerer et heterogent miljø, en terapeutisk metode som oppnår langvarig regresjon må være i stand til å sikte på flere transformerte cellepopulasjoner. Videre vil diskriminering i målretting av ondartet sammenlignet med ikke-maligne celler har verdi i å minimalisere bivirkninger. Vi ansatt en rekke prostatakreft modeller for å analysere potensialet for BV å oppnå disse målene.
In vitro
, både tradisjonelle prostata cellelinjer så vel som primære epitelceller eller stromale celler avledet fra pasient prostatabiopsier, i to- eller tre-dimensjonale kulturer, ble brukt. Vi vurderte også BV
in vivo
i murine prostata cancer xenograft modeller. BV var i stand til fortrinnsvis transducing invasive maligne prostatakreftcellelinjer i forhold til tidlig stadium kreft og ikke-maligne prøver, en begrensning som ikke var en funksjon av atom import. Av mer klinisk relevant, ble primær pasient-avledet prostatakreftceller også effektivt transdusert ved BV, med robuste priser observert i epitelceller i basal-fenotype, som uttrykte BV-kodede transgener raskere enn epitelceller hos en mer differensiert, luminal fenotype. Maksimal transduksjon kapasitet ble observert i stromale celler. BV var i stand til å trenge gjennom tredimensjonale strukturer, inkludert
in vitro
kuler og
in vivo
ortotopiske xenografter. BV vektorer som inneholder en nitroreductase transgen i et gen styrt enzym pro-medikamentell behandling tilnærming var i stand til effektivt å drepe ondartede prostata mål etter administrasjon av den pro-drug, CB1954. Således er BV i stand til å overføre et større andel av prostata celletyper i en heterogen 3-D-prostata tumor, kan legge til rette for celledød ved hjelp av et pro-legemiddel tilnærming, og viser lovende som en vektor for behandling av prostatakreft.
Citation: Swift SL, Rivera GC, Dussupt V, Leadley RM, Hudson LC, MA de Ridder C, et al. (2013) Evaluering Baculovirus som en vektor for menneskelig Prostate Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 8 (6): e65557. doi: 10,1371 /journal.pone.0065557
Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal
mottatt: 1 februar 2013; Godkjent: 26 april 2013; Publisert: 06.06.2013
Copyright: © 2013 Swift et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble utført i henhold til EU-finansierte samarbeidsprosjekter: prostata Initiative for Gene Therapy «PIG» (FP5), Baculogenes (FP6) og Gene Therapy: en integrert tilnærming til neoplastiske Treatment «GIANT «(FP6), med ekstra støtte fra Yorkshire kreftforskning . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i Storbritannia, over 40 000 nye tilfeller av prostatakreft diagnostisert hvert år, og 11.000 pasienter dør som en direkte følge av denne sykdommen (Kilde: Office for National Statistics). Det humane prostatakjertel er et heterogent miljø, hovedsakelig består av epithelial og stromale celletyper. Den epiteliale rom består av et dobbeltlag av celler: et kontinuerlig basal laget av udifferensierte celler som er i kontakt med basalmembranen, belagt med differensierte sekretoriske celler luminal [1]. Basal epitellaget representerer den mest proliferative rommet [2]. Mens mesteparten av de fleste prostatakreft omfatter celler av epitelial opprinnelse [3], flere celletyper har kapasitet til å bidra til malignitet, og må bli utslettet for å oppnå en effektiv klinisk resultat.
Typisk scenen av prostata sykdom og respons fra svulsten til androgener er to viktige faktorer som direkte behandlingsstrategier. Mens lokalisert prostatakreft kan være kirurgisk reseksjon via radikal prostatektomi, dette er ofte ledsaget av uønskede bivirkninger. En alternativ tilnærming, androgen ablasjon, fjerner tilførsel av androgener at mange prostatatumorer stole på for vekst og overlevelse; imidlertid, gjentakelse av mer aggressive kastrering resistent prostatakreft (CRPC) er et vanlig resultat. Siden CRPC er slutt motstandsdyktig mot strålebehandling og kjemoterapi, nye strategier er viktig å gi bedre resultater for pasienter med prostatakreft. Genterapi er en mulig løsning, og vil ideelt sett være posisjonert for å målrette både primære og sekundære prostatakreft etter systemisk administrasjon.
Mens mange forskjellige vektorer har blitt evaluert for sikkerhet og effekt i genterapiforsøk [4], den bruk av ikke-menneskelige, ikke-patogene virus, for eksempel baculovirus,
Autographa californica
Multiple NucleoPolyHedrovirus (
Ac
MNPV), er et relativt studerte området. BV er en dobbelttrådet DNA-virus som naturlig infiserer insekter verter, og selv om BV effektivt kan transduce pattedyrceller, er produktiv replikasjon ikke er mulig på grunn av kravet for insekt-spesifikke cellulære maskineri [5], [6]. Som en genterapivektor, har BV flere iboende fordeler. Hovedtyngden av befolkningen har ingen tidligere eksponering for BV og er således immunologisk naive. BV kapsid er i stand til å utvide for å imøtekomme store transgene innstikk, og den naturlige tropisme av baculovirus er enkelt endres. BV er i stand til å transdusere både aktivt-delende og hvilende pattedyrceller, er en funksjon som har spesiell relevans i behandlingen av prostatakreft, en langsomt voksende tumor [7]. Tilstedeværelsen av baculovirus, selv ved en høy multiplisitet av infeksjon (MOI), er ikke giftig og har ingen innvirkning på cellevekst og differensiering potensial [8], [9]. Endelig har omfattende langsiktige sikkerhetsstudier, foretatt i 1960 da baculovirus dukket opp som et viktig prospekt som en biologisk insektmiddel, bevist baculovirus ufarlig for mennesker [10].
Evnen til BV å levere funksjonelt bærekraftig transgen ekspresjon i pattedyrceller ble først demonstrert i 1995 [11]. Siden da,
Ac
MNPV har vist seg i stand til å overføre et bredt utvalg av pattedyrcelletyper, inkludert humane primære nerveceller [12], lever [11], mesenchymale stamceller [13] og embryonale stamceller [9] . Mens de tidligste forsøk på å oppnå BV-mediert genoverføring
in vivo
sviktet på grunn av vektorinaktivering av serumkomponenter, så som komplement [14], effektiv transduksjon baculovirus kan oppnås i nærvær av kjemisk- eller protein- baserte komplement inhibitorer, enten som co-inokula [15], [16], [17] eller incorporations inn mot BV kapselproteinet [17], [18], [19]. BV har blitt brukt som en preklinisk genterapivektor
in vivo product: [12], [20], [21], [22], [23], og i sammenheng med kreft har med hell behandlet murine gastrisk xenotransplantater [24].
Her kan vi vurdere BV som en genterapivektor for behandling av human prostatakreft. Vi beskriver bruken av BV til preferensielt transdusere og levere både reporter og celle-dødelige gener til ondartede prostata prøver av cellelinje og pasient opprinnelse, i tillegg til tredimensjonale kulturer og
in vivo
murine tumorer med høy effektivitet.
Materialer og metoder
Insect cellelinje Vedlikehold
Sf21 og Sf9 (Invitrogen) cellelinjer (isolert fra eggstokkvev av høsten hæren ormen,
Spodoptera frugiperda
) ble opprettholdt i spinner hengende rørestav kolber ved 27 ° C i Grace medium supplert med 10% føtalt kalveserum (PAA Laboratories) og 0,1% (v /v) Pluronic F-68 (Invitrogen). Ettlagskulturer ble opprettholdt i fravær av Pluronic.
Menneske Prostata cellelinje Vedlikehold
LNCaP (androgen-sensitive, godt differensierte prostatakreftceller fra en lymfeknutemetastase) og PC-3 (androgen-uavhengig, dårlig differensierte prostatakreftceller avledet fra en benmetastase) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). PC346C (androgen-sensitive, godt differensierte prostatakreftceller fra en primær prostata svulst) ble etablert i Erasmus Medical Centre, Nederland [25]. P4E6 (epitelceller avledet fra en godt differensiert primære prostatatumor udødeliggjort av transfeksjon med HPV E6), ble PNT1A og PNT2C2 (non-maligne prostataceller fra forskjellige pasienter, henholdsvis, udødeliggjort av transfeksjon med SV40) etablert i vårt laboratorium [26] , [27]. Alle celler ble håndtert under god laboratoriepraksis forholdene i definerte passasje vinduer, ble månedlig sertifisert frie for mykoplasma og ble genotypet (ved hjelp av ATCC-godkjent Powerplex 1.2 system, Promega) for å sikre autentisitet. Celler ble rutinemessig passert etter tidligere beskrevet forhold [28].
Primær Cell Culture
Pasientprostatavevet ble tatt med informert og skriftlig samtykke og godkjennelse fra York forskningsetiske komité fra pasienter som gjennomgår transuretral reseksjon av prostata, cystektomi eller radikal prostatektomi. Epitelceller ble isolert som beskrevet tidligere [29] og valgt for α
2β
1
hi uttrykk ved hjelp av rask tilslutning til type I kollagen-belagte plater (BD Biosciences). Celler ble ko-dyrket på Collagen I Plast med bestrålte STO murine feeder-celler inntil veksten var vel etablert, i KSFM supplert med 5 ng /ml EGF, 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt, og 2 mM L-glutamin (KSFMsup). For å indusere differensiering, ble cellene dyrket i et 50:50 (v /v) blanding av DMEM og Ham F12 supplert med 10% FCS, 10 nM DHT og 2 mM L-glutamin (DH10) i 4-6 dager. Isolerte stromale celler ble dyrket i T25-kolber i RPMI supplert med 10% FCS og 2 mM L-glutamin.
Baculovirus Fremstilling
Rekombinante baculovirus-vektorer ble konstruert ved å bruke BacVector 1000 kit (Novagen), i henhold til produsentens instruksjoner, med skreddersydde pBAC64: CMV-EGFPCAT, pBAC64: CMV-EGFP eller pBAC64: CMV-NTR-EGFP overføre plasmider. Disse plasmidene har ryggrad pBAC4X-en (Novagen) med innsetting av
polh
promoter og
GP64
genet kodende sekvenser fra pBACsurf-en (Novagen) og cytomegalovirus (CMV) umiddelbar tidlig promoter kjører transkripsjon av EGFP, en EGFPCAT fusjonsprotein (BD Biosciences Clontech) eller mNitroreductase (NTR) -IRES-EGFP uttrykk kassetter. Rekombinante virus ble utsatt for tre runder med plakkrensing og høye titre aksjer ble dyrket ved å infisere Sf21 insektsceller ved MOI = 0,1 plakkdannende enheter (PFU) per celle og høsting virus supernatant etter 5 dager. Virus-inneholdende celle supernatant ble konsentrert ved ultrasentrifugering ved 24.000 RPM i 90 minutter ved 4 ° C ved anvendelse av en Beckman SW28 rotor og ytterligere renset ved ultrasentrifugering gjennom en sukrosegradient på 24 000 rpm i en Beckman SW41-rotor. Viruspartikler ble vasket og resuspendert i PBS (ca. 1/500 utgangs volum) og titrert ved hjelp av plakk-analyse på Sf9-celler. Partikkel: PFU-forholdet var vanligvis i området fra 100 til 300 [30], [31], [32]. For transduksjon av prostata celler, ble viruset fortynnet i serumfritt medium passer for hver celletype, med mindre annet er oppgitt.
Konfokalmikroskopi Analyse av Monolag og bilag
For både monolags og bilags confocal eksperimenter ble cellene sådd ut på 8-brønns kammers objektglass med et dekkglass base (Lab-Tek) ved en initial densitet på 2-5 x 10
4 celler per brønn (forbelagt med 0,1 mg /ml poly-L-lysin for LNCaP-celler). For å generere et bilag, medium ble endret etter 2 dager før en dual layer av epithelial vekst ble oppnådd. BV- [CMV-EGFPCAT] eller BV- [CMV-EGFP] partikler ble lagt på 500 PFU /celle for en bestemt tidsperiode etter som cellene ble vasket for å fjerne ubundet virus og fikset umiddelbart i 4% (w /v) paraformaldehyde . Celler ble permeabilised i 0,5% (v /v) Triton-X-100 (Sigma) eller 70% EtOH, og deretter blokkert i 10% serum. BV kapsid protein, vp39, ble oppdaget ved hjelp av en primær monoklonalt antistoff (P10C6), courtesy of Dr. L.E. Volkman, University of California, Berkeley, USA [33] og en geit anti-mus Alexa Fluor 568 sekundært antistoff (Invitrogen). I bilags eksperimenter ble antistoff-fortynninger fremstilt i 0,1% (w /v) BSA fraksjon V (Sigma) for å hjelpe til gjennomtrengning i basale lag, mens i monolayer eksperimenter ble antistoff-fortynninger fremstilt i PBS. For analyse av primær-celledifferensiering, ble HMWCK (Dako) antistoff tilsettes sammen med den etterfølgende påføring av et sekundært geite-anti-mus Alexa 568-antistoff (Invitrogen). En andre primære antistoff (CK18-FITC (Sigma)) ble deretter påført. Vectashield inneholdende DAPI (Vector Lab) ble tilsatt før visualisering av celler i henhold til fluorescens ved hjelp av et Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop meta.
flowcytometri
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 0,2-1 x 10
5 per brønn i en 48-brønnsplate og inkubert ved 37 ° C over natten. Celler ble vasket en gang i PBS før tilsetning av virus fortynnet i serumfritt medium passende for hver celletype. Etter at den ønskede lengde av tid, ble suget av virus, ble celler vasket en gang i serumfritt medium og overlappet i serum-inneholdende vekstmedium. Cellene ble løsnet ved hjelp av Trypsin:. EDTA og resuspendert i 0,02% (w /v) EDTA, med et minimum på 10.000 singlet hendelser telt ved bruk av en cyan ™ ADP strømningscytometer
PC346C sfæroide Transduksjon
spontant dannede kuler ble høstet fra overflaten av en T25-kolbe inneholdende PC346C-celler og inkubert i 10 minutter ved 37 ° C i fullstendig kulturmedium innehold BV- [CMV-EGFP] ved en konsentrasjon på 8,6 x 10
9 PFU /ml . Sfæroidene ble fortynnet i 2,5 ml medium og på nytt platet inn i en kolbe T12.5. Fluorescent bildene ble tatt med et Nikon Eclipse TE300 mikroskop på tre dager etter smitte.
ortotopiske xenografter
Svulster ble etablert ved injeksjon av 1 x 10
6 PC346C celler orthotopically inn dorsolateral prostata av atymiske nakne mus (NMRI nu /nu, Taconic M BA /S, Ry, Danmark) som beskrevet tidligere [34], i samsvar med etiske prosedyrer og under godkjenning fra Erasmus Experimental Animal Senter etikkomité. Tumor vekst ble overvåket av transrectal ultralyd ved hjelp av en tilpasset intravaskulær ultralyd system [35]. Ved tumor størrelser mellom 80 og 120 mg, to doser (3 × 10
7 eller 1 × 10
8 pfu) av BV- [CMV-EGFP] ble administrert intratumourally under anestesi. Dyrene ble avlivet 3 dager senere, tumorer ble høstet, fiksert i 2 timer i 2% (vekt /volum) paraformaldehyd i PBS, skiver på en Vibratome (Campden Instruments, Loughborough, UK) i 70 um tykke snitt og montert på objektglass i Vectashield (Vector Lab). EGFP-ekspresjon ble visualisert ved hjelp av konfokal mikroskopi (Carl Zeiss, Benelux).
Evaluering av celleviabilitet ved MTS-analysen
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
4 celler pr brønn i en 96-brønners plate og fikk feste seg over natten. BV- [CMV-NTR-EGFP] ble tilsatt til triplikate brønner ved MOI = 500 i 4 timer, vasket og inkubert i ytterligere 20 timer før tilsetning av CB1954 (20 uM for alle primærprøvene og cellelinjer med unntak av PC-3, hvor 40 uM ble anvendt). Etter ytterligere 48 timer for cellelinjer eller 30 timer for primærceller, ble celleviabilitet målt ved hjelp av CellTiter 96® Vannanalyse Reagens (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner og plater leses med en BMG Labtech Polarstar OPTIMA plateleser. Andelen av døde celler ble beregnet ved å sammenligne til levedyktige celler i en untransduced brønnen. En duplikat sett av brønnene ble brukt for flowcytometri som beskrevet ovenfor for å bestemme frekvensen av positivt transduced celler.
Resultater
BV Transduksjon er mest effektive i Ondartede Prostata cellelinjer i forhold til ikke-ondartet Styrer
for å bestemme kapasiteten på BV til forskjellig transduce maligne vs ikke-maligne prostata mål, vurderte vi mottakelighet av et panel av etablerte menneske prostata cellelinjer til BV transduksjon. Celler ble inkubert med et rekombinant BV vektor modifisert til å bære et EGFPCAT transgene (BV- [CMV-EGFPCAT]) ved anvendelse av en fast MOI på 500 og en inkubasjonstid på 48 timer. Maligne cellelinjer med høy metastatisk potensial, inkludert LNCaP, PC3 og PC346C, ble sterkt transdusert (~80% EGFP-positive celler), mens ikke-maligne cellelinjer PNT1A og PNT2C2 ble minst transdusert (opp til 10% EGFP-positive celler) (figur 1A). P4E6, en cellelinje avledet fra et igangsatt, men tidlig stadium tumor, var i det mellomliggende område, med ca. 20% EGFP-positive celler (figur 1A). Dermed frekvensen av celler positivt transduced av BV korrelert med kreft og metastatisk potensial.
(A) Prosent av EGFP-positive celler etter transduksjon av et panel av høy klasse ondartet (rød), lavgradig malign (svart ) eller ikke-maligne (blå) prostata cellelinjer med BV- [CMV-EGFPCAT] ved MOI = 500 i 48 timer. Feilfelt avbilde – /+ ett standardavvik. (B) Relative uttrykk nivåer av EGFP følgende transduksjon med BV- [CMV-EGFPCAT] på en mette MOI (500 for LNCaP, PC3 og PNT1A, 1000 for PNT2C2). Prosentandelen av EGFP-positive celler ble normalisert til det som oppnås etter 48 timers inkubering i nærvær av virus for hver celletype (satt til 1). Ondartet cellelinjer: PC3 (▴), LNCaP (▪); Ikke-maligne cellelinjer: PNT2C2 (♦), PNT1A (▾). Feilfelt avbilde – /+ ett standardavvik. (C) konfokalmikroskopi bilder (enkelt stykke eller Z-stack) av BV-transduced LNCaP, PC3 eller PNT1A celler på åtte timer etter transduksjon (MOI = 500). Red fluorescens indikerer BV kapsid (anti-vp39), nukleær farging i blått (DAPI) og BV-drevet EGFP uttrykk i grønt.
For å undersøke de optimale transduksjon forhold for svært utsatt (LNCaP, PC- 3) versus mindre utsatt (PNT1A og PNT2C2) prostata cellelinjer, vi analysert både MOI nødvendig for å oppnå transduksjon metning og kinetikken overføring på dette MOI. Cellene ble inkubert i 1 time i nærvær av økende doser av BV- [CMV-EGFPCAT], og andelen av EGFP-positive celler ble analysert etter 24 timer. MOI som kreves for å oppnå den maksimale frekvens av transduserte celler var 500 PFU per celle for LNCaP, PC3 og PNT1A, og 1000 PFU per celle for PNT2C2 (data ikke vist). Ved hjelp av disse mette Mois, ble kinetikken transduksjon undersøkt over tid. Ondartet prostatacellelinjer (LNCaP og PC-3) viste hurtig og effektivt opptak av BV- [CMV-EGFPCAT], som bare krever korte inkubasjonstider (~45 eller ~90 min, henholdsvis) for å nå 50% av nivåene tatt opp ved 48 h (figur 1 B). Omvendt, ikke-ondartet prostatacellelinjer (PNT1A og PNT2C2) kreves lengre inkubasjonstider (~ 10 timer eller ~8 h, henholdsvis) for å oppnå 50% av nivåene etter 48 timer (figur 1B).
Én tolkning av disse forskjellene i transduksjon er at kjernekraft import av BV kapsid er defekt i enkelte celletyper (anmeldt etter [36]). For å vurdere denne hypotesen i våre prostata cellelinje-modeller, ble subcellulære lokalisering av BV capsids undersøkt ved hjelp konfokalmikroskopi på åtte timer etter transduksjon i svært mottakelige ondartet LNCaP og PC-3 cellelinjer og mindre utsatt non-maligne PNT1A cellelinje . BV kapsider ble observert i kjernen av alle tre celletyper (figur 1C), og visuell analyse av flere synsfelt viste ingen forskjeller i nivåene av atom kapsid lokalisering. Men PC-3 celler hadde et høyere nivå av overflatebundet BV, mens PNT1A cellene hadde et høyere nivå av BV i cytoplasma (figur 1C).
Celler av Basal (Undifferentiated) Phenotype Are transduced lettere enn Luminal (Differensiert) Celler i Primær prostata epithelial kulturer
for å utvide vår evaluering av BV til en mer biologisk relevant situasjon, vi ansatt primære pasient biopsi-avledet prostata epiteliale cellekulturer. Siden mesteparten av menneske prostatakreft omfatter celler av epitelial opprinnelse, med både udifferensiert (basal) og godt differensierte (luminal) fenotyper stede, vi avgjort om BV var i stand til å målrette både epiteliale cellepopulasjoner på ulike stadier av differensiering. Primær prostata epitelceller utledet fra tre pasienttumorbiopsi (Gleason resultatet 6, 7 og 8/9) ble dyrket under to forskjellige betingelser: i KSFMsup medium for å opprettholde celler i en basal tilstand, eller i DH10 medium for å indusere differensiering, basert på arbeid etter [37]. Endringer i differensiering status under disse distinkte kultur forholdene ble bekreftet ved immunfluorescens analyse av klassiske differensieringsmarkører (basal markører: cytokeratins (CK) 1, 5, 10 og 14; luminal markør: CK18), basert på arbeid etter [38] (Supplementary Figur 1). For hver pasient, ble celler dyrket i KSFMsup eller DH10 inkubert med BV- [CMV-EGFPCAT] for å øke lengder av tid og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved 48 timer. Epitelial differensiering redusert overføringsfrekvenser samlet når cellene ble inkubert med virus i mindre enn 10 timer, for eksempel i celler avledet fra et Gleason 6 tumor, det maksimale nivået av infeksjon oppnådd i basal (KSFMsup) celler ved 4 h (45,33 ± 3,55 %) var betydelig høyere enn toppen av infeksjon i luminal (DH10) celler (21,69 ± 1,78%) i 8 timer (figur 2A). Over lengre perioder med BV inkubering forskjellen i overføringsnivåer mellom KSFMsup- og DH10-dyrkede celler ble mindre uttalt, men holdt seg lavere i differensierte (DH10) cellepopulasjon (figur 2A).
(A) Prosent av EGFP-positive celler ved 48 timer etter transduksjon med Bv- [CMV-EGFPCAT] ved MOI = 500 for å øke tidslengder i tre primære maligne prostata epitel-prøver (Gleason 6, 7 eller 8/9), holdes i en tilstand basal av kultur i KSFMsup (▪), eller dyrket i differensiering forhold i DH10 (▴). Feilfelt avbilde – /+ ett standardavvik. (B) Lokalisering av BV capsids i primære epitelceller fra en Gleason 8/9 svulst vokst i et bilag, enten en time eller 16 timer etter inkubasjon med Bv- [CMV-EGFPCAT] på MOI = 250. Red fluorescens indikerer BV capsids oppdaget med anti-vp39, er kjernefysisk DAPI farging vist i blått og BV-drevet EGFP uttrykk i grønt. Konfokale bilder av det øvre lag av celler (luminal-lignende, ved en gjennomsnittlig z-avstand på 14,58 um fra den ventrale stilling) og nedre sjikt (basal-lignende, ved en gjennomsnittlig z-avstand på 6,47 mikrometer fra den ventrale stilling) er vist. (C) frekvens (normalisert å spotte = 1%) eller at fluorescens intensitet EGFP-positive primære stromale celler avledet fra ondartede eller godartede biopsier 24 timer etter transduksjon med Bv- [CMV-EGFPCAT] på MOI = 500.
for ytterligere å undersøke den raske transduksjon av basale epitelceller med BV, vi ansatt en
in vitro
celle bilags modellen, som mimicks cellestruktur av prostatakjertelen. Bilaget omfattet et konfluent lag av basale epitelceller (CK1 /5/10/14 +) overlappet med en ufullkommen øvre lag av celler med en mer differensiert, luminal fenotype (CK18 +) [28], [38]. Primære maligne prostata epitelceller avledet fra en Gleason score 7 svulst fikk lov til å danne et bilag, deretter inkubert med BV- [CMV-EGFPCAT] i 1 time eller 16 timer og visualisert ved hjelp konfokalmikroskopi. Etter inkubasjon med BV i 1 time, ble virus kapsider visualisert i basallaget i et punktformet fargemønster, men ble ikke observert i luminal laget (figur 2B). Etter en lengre periode med inkubering (16 h), ble virus kapsider påvist i både basal og luminale lag. Imidlertid betydelige områder i luminal lag forble fri for virus kapsider (figur 2B)
BV kan raskt og effektivt transduce Primær prostata stromale celler
epithelial og stromal populasjoner representerer de to store cellulære komponenter av prostatakreft. Mens epitelceller omfatter typisk mesteparten av den maligne cellepopulasjon, er stromaceller vært implisert i en gjensidig tilbakekoblingssløyfe som støtter vekst og opprettholdelse av tumorceller [39], [40]. Dette tyder på at en vellykket prostatakreft behandling bør inkludere målrettet utrydding av malignitet-assosierte stromal rommet. Vi undersøkte derfor muligheten for BV å omsette celler av stroma opprinnelse. Stromale celler avledet fra maligne eller ikke-maligne primære prostatabiopsier ble inkubert med BV- [CMV-EGFPCAT] i 1, 16 eller 24 timer og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Etter 1 time ble ca. 30% av celler transdusert med BV, mens etter 16 timers inkubasjon ble hver stromal celle positivt transdusert med BV (figur 2C). Ingen forskjell ble observert i frekvensen av positivt-transduserte stromale celler basert på malignitet; imidlertid, på en per-celle-basis, stromale celler avledet fra ondartet prostatabiopsiprøver viste en større midlere fluorescensintensitet enn de som stammer fra benigne biopsiprøver ved tidlige tidspunkter (figur 2C). Stromale celler ble derfor svært utsatt for BV transduksjon.
BV kan vellykket transdusere 3-D Prostata Spheroids og ortotopisk xenotransplantater
Det har vært antydet at en effektiv genterapivektor må være istand til å trenge igjennom flere cellelag for å oppnå en klinisk relevant respons ved behandling av faste tumorer. Å karakterenes evne BV til å migrere gjennom cellelag, ansatt vi begge
in vitro Hotell og
in vivo
tredimensjonale kulturer. For
in vitro
modellering, hule kuler av ondartede PC346C prostataceller, som omfattet en «skall» av 2-3 cellelag og spontant løsrevet fra monolagene under rutine kultur, ble inkubert med BV- [CMV-EGFP] . Ved 72 timer etter inkubering, ble det observert en svært effektiv mønster av celle transduksjon, med en penetrasjon på BV gjennom alle cellelag (Figur 3A).
(A) PC346C sfæroidene transdusert med Bv- [CMV-EGFP] (eller håne transduced) 3 dager etter smitte. (B) PC346C svulster høstet fra xenopodet mus i 3 dager etter infeksjon med BV på 3 × 10
7 (én representant bilde vist) eller 1 × 10
8 (to representative bilder vist) pfu per vaksinasjon. Red fluorescens viser cellekjerner (Hoescht), mens BV-drevet EGFP uttrykk vises i grønt. Pilene angir stedet intratumoural BV injeksjon.
For i
n vivo
modellering, murine prostatakreft xenograft modeller, generert gjennom orthotopic injeksjon av PC346C cellelinje inn dorsolateral prostata av atymiske nakne mus ble injisert intratumourally med BV- [CMV-EGFP] på to ulike konsentrasjoner (3 × 10
7 eller 1 × 10
8 pfu). Ved 72 timer ble tumorene resekterte og analysert ved fluorescens mikroskopi. BV ble observert å kunne trenge inn i svulsten, og migrere bort fra den første injeksjonsstedet. Dette var spesielt tydelig etter administrering av høyere dose virus (figur 3B). Dermed, selv i tre-dimensjonale kulturer, BV var i stand til å oppnå en høy grad av celle transduksjon.
Ondartet prostata celler kan effektivt drept Bruke BV vektorer i et Nitroreductase basert GDEPT tilnærming
for å teste evnen til BV for å oppnå en celle-dødelig utfall, ansatt vi et gen styrt enzym pro-medikamentell behandling (GDEPT) tilnærming fokusert på bakteriell
nitroreductase plakater (NTR), som konverterer pro- medikament CB1954 (5- (aziridin-1-yl) -2,4-dinitrobenzamide) inn i en potent DNA kryssbindingsmiddel [41]. Derfor bygget vi en BV bærer et uttrykk kassett hvor sterk pattedyr CMV arrangøren kjørte uttrykk for mNTR-IRES-EGFP (BV- [CMV-NTR-EGFP]). Et panel av maligne og ikke-maligne prostatacellelinjer ble omformet med BV- [CMV-NTR-EGFP], og cellelevedyktigheten ble evaluert etter administrasjon av den pro-drug, CB1954. Andelen av ikke-levedyktige celler, som målt ved hjelp av MTS-analyse etter 48 timer, var signifikant høyere i maligne prøver med høy metastatisk potensial (PC346C, PC3 og LNCaP) sammenlignet med ikke-maligne prøver (PNT1A og PNT2C2) (P 0,001) (Figur 4A). Tidlig stadium ondartet prøver (P4E6) falt i mellom spekter av levedyktighet. Videre celleviabilitet følgende pro-medikamentadministrering var direkte relatert til frekvensen av BV transduksjon (figur 4A). Denne analysen ble forlenget inn i primær pasient-avledet epiteliale cellekulturer. Tre ondartede og to ikke-maligne prøver ble omformet med BV- [CMV-NTR-EGFP] og behandlet med CB1954. Ved 30 timer etter pro-medikamentadministrering, celledød i disse kulturene varierte fra 10% til 50%, uavhengig av sykdomsstatus (figur 4B).
(A) Prosent av ikke-levedyktige celler ved 48 timer post-transduksjon med BV- [CMV-NTR-EGFP] (MOI = 500) og behandling med CB1954 i et panel av prostata cellelinjer, vist i forhold til frekvensen av transduserte celler og justert for ubehandlede kontroller. Ondartet cellelinjer: PC346C (♦), PC3 (▴), LNCaP (▪), P4E6 (x); Ikke-maligne cellelinjer: PNT1A (+), PNT2C2 (•). Statistikk representerer t-test mellom PC346C /PC-3 /LNCaP vs. PNT1A /PNT2C2. (B) Prosent av ikke-levedyktige celler ved 30 timer etter transduksjon med BV- [CMV-NTR-EGFP] og behandling med CB1954 i enkelte primær prostata epitel celleprøver (n = 3 ondartede og n = 2 ikke-ondartet), justert for ubehandlede kontroller.
Diskusjoner
Flere modeller av sykdom har vist at baculovirus har et stort potensial som en roman vektor for genterapi. Her har vi undersøkt dens nytte for behandling av human prostatakreft. BV var i stand til å effektivt overføre et utvalg av prostata celler avledet fra flere kilder, inkludert
in vitro Kjøpe og
in vivo
modeller. BV demonstrerte differensial transduksjon av ondartet sammenlignet med ikke-maligne prostataceller, en observasjon som dukket opp uavhengig av vekst, ettersom cellelinjene aktuelle utstilt lignende proliferativ kapasitet (doblingstidene: PNT2C2 (39 h), LNCaP (34 h) PC- 3 (30-34 timer) og PNT1a (30 h) [26], [42], [43]). Selv om en primær pattedyr-cellereseptoren for BV feste fortsatt uidentifiserte, spekulere vi at kreft-assosiert oppregulering av heparansulfat-modifisert proteoglykaner (HSPGs) på tumorcelleoverflaten, [44], [45], som er kjent for å være involvert i BV bindings [16], [46], spiller en rolle i dette utfallet.
