PLoS ONE: Flere-integrasjoner av HPV16 Genome og Endret transkripsjon av Viral onkogener og Cellular genene er assosiert med utvikling av livmorhals Cancer

Abstract

Den konstituerende uttrykk for høyrisiko HPV E6 og E7 virale onkogener er den viktigste årsaken til livmorhalskreft. Omfattende utforske sammensetningen av HPV16 tidlige vitnemål og deres genomisk merknader, cervical squamous epitelvev fra 40 HPV16-infiserte pasienter ble samlet inn for analyse av papillomavirus onkogen transkripsjoner (APOT). Vi observerte forskjellige transkripsjons mønstre av HPV16 onkogener i utviklingen av livmorhalskreft til livmorhalskreft og identifisert en ny karakterutskrift. Multiple-integrering hendelser i vev av livmorhalskreft (CxCa) er betydelig oftere enn de med lav grad av plateepitel intraepitelial lesjoner (LSIL) og høy grad av plateepitel intraepitelial lesjoner (HSIL). Videre har de fleste cellulære gener innenfor eller i nærheten av disse integrasjons områdene er kreft-assosiert gener. Til sammen antyder denne studien at flere-integrasjoner av HPV genomet under vedvarende virusinfeksjon, som dermed endrer uttrykk mønstre av virale onkogener og integreringsmessige cellulære gener, spiller en avgjørende rolle i utviklingen av livmorhalskreft til livmorhalskreft.

Citation: Lu X, Lin Q, Lin M, Duan P, Ye L, Chen J et al. (2014) Flere-integrasjoner av HPV16 Genome og Endret transkripsjon av Viral onkogener og Cellular genene er assosiert med utvikling av livmorhalskreft. PLoS ONE 9 (7): e97588. doi: 10,1371 /journal.pone.0097588

Redaktør: Xuefeng Liu, Georgetown University, USA

mottatt: 02.10.2013; Godkjent: 21 april 2014; Publisert: 03.07.2014

Copyright: © 2014 Lu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81001343, 81172463), Department of Education i Zhejiang-provinsen (Y200907403) og Wenzhou Science and Technology Bureau (Y20090103, Y20100175 og H20100063). Disse sponsorene gitt støtte til forsøkene og innsamling av prøver. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos kvinner over hele verden. Den vedvarende infeksjon av høyrisiko humant papillomvirus (HR-HPV), som genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, og 59 er vesentlig for utviklingen av livmorhalskreft [1], er og over 50% tilfeller forårsaket av HPV16 [2]. Virale oncoproteiner, E6 og E7, av HR-HPV bidra til cervical karsinogenese ved inaktivering av to viktige cellulære tumor suppressor protein, p53 og pRb, henholdsvis [3] – [6]. Disse virale oncoproteiner i infiserte celler kan også resultere i kromosom ustabilitet og akkumulering av mutasjonshendelser [7].

A virus tidlig promotor oppstrøms for løy E6 ORF, slik som p97 i HPV16 [8], [9] , P99 i HPV31 [10], [11] og P105 i HPV18 [12], [13], er ansvarlig for nesten alle tidlig genekspresjon, inkludert E6 og E7. Oppstrøms cis-elementer i LCR interagere med cellulære transkripsjonsfaktorer og den virale transaktivator /repressor E2 og regulerer transkripsjonen av HPV E6 og E7 gener [8], [14]. Videre er DNA-metylering [15], alternativt RNA-spleising [9], [16], [17] og tidlig poly (A) område polyadenyleringssignal [18], [19] også deltar i reguleringen av E6 og E7 genekspresjon [19].

til dags dato har en full transkripsjon kartet onkogen HPV16 og HPV18 i HPV-infiserte celler og flåten vev er bygget [19], [20].

Det er vel kjent at integreringen av HPV genomer er en viktig hendelse i livmorhals karsinogenese [21], [22]. Foruten viral genom integrering i aktivere cellulære onkogener eller inaktivere cellular tumor undertrykkende gener [23] – [25], HPV genom integrering i vertsgenomet kan endre transkripsjons mønstre av både virus og vertsgener [26]. Det har blitt rapportert at integrasjonen av HPV-genomer kan forstyrre den virale E2-genet i cellene og frigi dens inhibering av virale tidlige promotor som styrer ekspresjon av E6 og E7 [27]. I tillegg kan E6 og E7 transkripsjoner cotranscribed med cellulære sekvenser være mer stabil, og dermed styrke deres uttrykk nivå [28] -. [30]

transkripsjons mønstre av HPV16 i vev av livmorhalskreft er rapportert [ ,,,0],26], [31]. Det var en episomal HPV tidlig genet transkripsjon (E7-E1

∧E4) og flere integrerte HPV transkripsjoner (som E7-E1

∧cellular RNA, E7-E1

∧E4-cellulært RNA, etc. ) i HPV16-infisert vev. Imidlertid transcriptional valg som reaksjon på endringer i miljøet er en dynamisk prosess for å oppnå optimal genekspresjon for celleoverlevelse og karsinogenese [32]. I denne studien har vi brukt en modifisert teknikk for forsterkning av papillomavirus onkogen transkripsjoner (APOT) [26] til omfattende utforske strukturen og sekvenser av HPV16 E7 relatert transkripsjoner og deres genomisk merknad i 8 LSIL (lavgradige plateepitel intraepitelial lesjoner), 24 HSIL (høyverdig plateepitel intraepitelial lesjoner), og åtte CxCa HPV16-positive livmorhalsbiopsiprøver.

Materialer og metoder

Pasient og prøver

Vevsprøver av primærlivmorhals lesjoner som inneholder dysplastiske epitel /tumorceller ble hentet fra Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University (Zhejiang-provinsen i Kina) fra desember 2010 til april 2012. tilstedeværelsen av HR-HPV ble oppdaget av hcii test, og screening av HPV16 i HR -HPV-positive prøvene ble gjort av HPV-genotypene deteksjon kit (KaiPu, Guangzhou, Kina) [33]. Alle av dem har ikke fått strålebehandling eller cellegift før operasjon, og hver pasient gjennomgikk en colposcopically rettet biopsi. De innsamlede biopsiprøver ble delt i to. En porsjon ble underkastet standard for histopatologisk diagnose, mens den annen porsjon ble lagret i RNAlater (Ambion, Austin, Texas, USA) ved -80 ° C for etterfølgende analyse. På grunnlag av den histopatologisk diagnose, ble prøvene delt i LSIL (CIN I, n = 8), HSIL (CIN II, n = 22; CIN III, n = 16) og cervix carcinoma (CxCa, n = 17). Ytterligere 8 cervical vev med normal cytologi og HPV DNA negativitet som kontroller ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk hysterektomi grunn av benigne gynekologiske sykdommer. Studien er godkjent av Medical Ethics Committee of Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. Alle kvinner ble informert og ga sitt skriftlige samtykke til å delta i studien.

RNA og DNA isolering fra kliniske prøver

Total RNA fra biopsiprøver beskrevet ovenfor ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Calif ., USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For å fjerne resterende DNA-kontaminering ble RNA forberedelse behandlet med RNase-fritt DNase (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens protokoll. Renset total RNA ble oppløst i RNase-fritt vann og lagret ved -80 ° C. Konsentrasjonen og renheten av total-RNA ble kvantifisert ved UV spektrofotometer ved 260 nm og 280 nm, og 1% agarosegel-elektroforese. Kun RNA prøver med et A260 /A280-forhold på 1,8-2,0 og høy integritet ble anvendt for ytterligere forsøk.

revers transkripsjon og PCR-amplifisering av Transkripter

APOT assay var rapportert tidligere var basert på nestet PCR reaksjoner [26], som bare kunne forsterke de rike transkripsjoner og ignorere utskrifter med lavere nivåer i prøvene. Så endret APOT analysen ble brukt til å forsterke HPV onkogene transkripsjoner. Primerne for disse reaksjoner ble utformet i henhold til Klaes R, et al [26]. Total RNA (1 pg) ble reverstranskribert ved anvendelse av en oligo (dT)

17-primeren er koplet til en linkersekvens

RT product: [34] i henhold til produsentens protokoll av revers transkriptase Kit (Toyobo, Japan) . For å verifisere første-tråd cDNA kvalitet, ble PCR ved anvendelse av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH)-spesifikke primere utført som tidligere beskrevet [35]. Første-tråd cDNA som omfatter virale oncogen-sekvensene ble deretter amplifisert ved PCR ved anvendelse av

p1

-HPV16E7 spesifikk primer (5′-CGGACAGAGCCCATTACAAT-3 «) og linker

p0 plakater (5′-GACTCGAGTCGACATCG-3- «) som revers primer; og PCR-amplifisering ble utført i et reaksjonsvolum på 50 ul. Forskjellig fra tidligere rapporter, ble PCR-sykluser økt til 35, og alle prøver bare utføres én runde PCR reaksjon. For å verifisere spesifisitet av denne prosedyren ble «minus-RT» kontroll der revers transkriptase utelatt fra reaksjonene ble også utført parallelt.

Sekvensanalyse av vitnemål

APOT amplifiseringsprodukter var visualisert ved hjelp av 2,5% agarosegelelektroforese. PCR-produktene av interesse ble kuttet ut fra gelen og ekstrahert ved bruk av DNA-agarosegel gjenvinning kit (TianGen, Beijing, Kina). De tilsvarende amplimeres ble klonet inn i kloningsvektor (TransGen, Beijing, Kina) og DNA-sekvensanalyse ble utført ved bruk av en ABI 3730 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) i henhold til standard protokoller. Sekvense Resultatene ble analysert ved hjelp av BLASTn program levert av National Center for Biotechnology Information, USA. I tillegg ble de kromosomintegrasjonssider konstatert ved hjelp av National Center for Biotechnology Information (BLAST) og European Molecular Biology Laboratory (EBI). Dessuten ble de skjøre områder og gener integrasjons områder definert på NCBI skjøre site map viewer og UCSC Blat verktøyet.

Resultater

Spesifisitet av APOT analyse for HPV16 onkogene transkripsjoner

prinsippet for APOT analysen er en 3 «hurtig amplifikasjon av cDNA-ender (RACE) PCR-analyse som oppnår amplifisering og kloning av området mellom et enkelt kort sekvens i et cDNA-molekyl og dets ukjent 3′-ende [34]. Generelt, de integrerte transkripsjoner avledet fra E6 og E7 onkogener omfatte virale sekvenser på sine 5’ender og vertsgenomsekvenser på sine 3»- endene [26]. Den forventede størrelsen på produkter som kommer fra en episom-avledet transkripsjon er 1050 bp [26] Amplimers som viste en annen størrelse enn 1050 bp kan derfor være avledet fra en integrert HPV genom. Å vitne spesifisiteten av den modifiserte APOT analysen, cDNA fra HPV16-positive Caski celle inneholder integrerte HPV16 genom og HPV-negative normale cervical vev, samt «minus-RT» styrer hvor revers transkriptase ble utelatt fra reaksjonene var anvendes. De amplifiserte produktene av de cDNA fra HPV16-positive Caski celle var lik den tidligere rapport [26], mens ingen RT produkt ble oppnådd fra de normale vev i livmorhalsen uten HPV DNA og «minus-RT» kontroll (figur 1). Disse dataene indikerte den modifiserte APOT analysen kan spesifikt gjenkjenne transkripter avledet fra den integrerte HPV-genomet.

Amplifiserte produkter fra CaSki-celler (A), HPV16-positive CxCa (B), HPV-negative normale vev i livmorhalsen (C) og «minus-RT» kontroller av RNA isolert fra HPV 16-positive prøver (D) ved APOT analysen ble separert på 2,5% agarosegel. A:

Lane 1-3

var tre forskjellige subkultiveres CaSki celler (som en positiv kontroller); B:

Lane 1-3

var tre forskjellige CxCa prøver; C:

Lane 1-3

var tre forskjellige normale cervical vev (som negative kontroller); D:

Lane 1-3

ble tilsvarende med prøver i henholdsvis B,; M:. 250 bp DNA stiger

Kjennetegn på HPV16 onkogene utskrifter i vev av cervikal intraepitelial neoplasi og cervix carcinoma

For å analysere HPV16 onkogene transkripsjoner, 40 HPV16-positive livmorhals prøver (LSIL, n = 8; HSIL, n = 24; CxCa, n = 8) med god kvalitet RNA ble valgt ut blant 63 innsamlede prøvene i denne studien. Totalt 133 transkripsjoner inneholder virus fragmenter ble funnet. Blant disse transkripsjonene, 64 fragmenter hadde HPV16 E7-E1 * sekvensene ved deres 5′- endene og har direkte forbindelse med poly A ved deres 3′- endene (figur S1). Videre var det fire forskjellige forstyrrelser av E1 regionen ved nt 880, 949, 1054 og 1234 (figur S2). Transkripsjoner inneholder en E1-spleisedonoren signal ved nt 880 [36] kan tilhøre potensial episomal mønster, mens karakterutskriften som avkortet ved nt949 kan være et resultat av intern priming ved oligo dT [37]. Andre transkripsjoner som avkortet ved nt 1054 og 1234 verken inneholdt poly A-sekvenser, eller noen polyadenyleringssete tilhører viral eller vert, så disse transkripsjonene ble sett på som potensielle integrerte mønstre. I tillegg har vi også funnet en annen avskrift som har E7 ORF skjøtes ved nt 880 til E4-spleiseakseptoren stedet ved nt 3358 og deretter skjøtes fra E4-spleisedonoren signal ved nt 3632 til L1-spleiseakseptoren område på 5639, og også avsluttet ved poly A (figur S1). I denne transkripsjon er E4 ORF ikke forstyrres. Mangel på et spleisedonorsignal ved nt 5815 i denne transkripsjon indikerer at HPV16-genomet avbrutt ved nt 5815 kan også ta del i virusgenomet integrasjon.

I tillegg var det 64 virale transkripter direkte knyttet til vertsgenomet sekvenser og de var alle begynte med begynnelsen av fremover primer (p1) ved nt 729. Disse HPV16 onkogene integrert transkripsjoner kan deles tre forskjellige typer (figur 2). Blant disse transkripsjonene, har type A HPV16 E7-E1

* sekvensene ved deres 5’ender og direkte koblet til vert genomsekvenser. Men det var to forskjellige integrasjons områder av E1 region (på nt880 og nt1107) i denne type (Figur S3). Tomta på nt880 inneholdt en E1-spleisedonoren signal mens området avkortet ved nt1107 kan være mer sannsynlig å linearvirus sirkulære genomet for integrering i vertsgenomet. Avskrift av type B har en E2 ORF forstyrret på nt2870 og Type B sekvens komponerer av HPV16 E7-E1

∧E2

* på sine 5’ender og vertsgenomsekvens ved dets 3′- endene. I avskrift type C, blir E1

∧E4 stoppkodon avbrutt for virus integrering og en hel E1

∧E4 ORF uten et stoppkodon er smeltet i ramme for å være vert sekvens. Av disse tre mønstrene, hadde transkripsjoner av type A og C er rapportert av Wentzensen N, et al. [31]. Men avskrift av type B hadde ikke tidligere blitt rapportert i forstadier til kreft og kreft i livmorhalsen

Type A viser E1 sekvenser skjøtes direkte til mobilflankerende sekvens.; Type B viser E1 skjøtes til E2, med E2 smeltet sammen med en mobil sekvens; Type C viser E1 skjøtes til E4, med E4 kjører inn i en mobil sekvens.

▴, er det to integrasjons steder i E1 (data vist i Figur S3). Boksene innenfor skråstreker representerer seks nukleotider mellom E7 og E1gene.

Videre HPV16 onkogener viste signifikant forskjellige transkripsjons mønstre i vev av LSIL, HSIL og CxCa (figur 3, 4 og tabell 1). Blant disse 3 transkripsjonsmønster som detekteres i våre pasienter, type A og type B var høyere prevalens enn Type C, som ble observert i nesten alle patologiske typer, mens Type C ble påvist bare i prøver av CxCa, med en deteksjon frekvens av 75% (tabell 1 og figur 4). Alle pasientprøver vises Type A, men alle CxCa prøvene hadde type B og type C (figur 4). I samsvar med den antagelse av mulig integrering av virusgenomet i de senere stadier av kreftutvikling [38], [39], utbredelsen av fusjons transkripsjoner var høyere i HSIL og CxCa enn LSIL.

HPV16-positive kliniske prøver med LSIL, HSIL og CxCa ble utsatt for APOT analysen og separert på 2,5% agarosegeler,

Lane 1-5

bety fem forskjellige prøver i hvert patologisk type. M:. 250 bp DNA Stiger

Integrasjon områder og karakterisering av den cellulære flankerende sekvens

For å identifisere de enkelte kromosom steder, alle 64 fusion-transkripsjoner som inneholder virale og cellulære sekvenser ble ytterligere analysert ved BLASTn sammenligninger til hele genomet databasen. Våre data viser at alle kromosomer, bortsett Chr21 og X, ble integrert med HPV16-genomet, noe som bekrefter tidligere rapporter om at ingen preferanse HPV integreringssete ble sett i valg av det humane kromosom [40]. Noen loci, som 1p36.22, 1p36, 2p24, 2q33, 5q31.1, 5q31, 6p24, 8p23, 10q22.1, 13q22.1, 19q13 og 19p13.3, ble rapportert tidligere [31], [41] – [45] (tabell 2). Blant disse integrering hendelser, fjorten av 40 prøver viste flere integrasjonssider (tabell 2). Selv om de lokale DNA-rearrangementer kunne skje ofte og hurtig etter integreringen [43], har vi funnet at cellulære flankerende sekvenser i 11 vev ble kartlagt til forskjellige kromosomer, noe som indikerer nærværet av flere uavhengige integrasjoner i disse prøvene. Videre fant vi at flere integrering hendelser var signifikant høyere i CxCa vev (75%) enn i livmorhalsen vev av LSIL (50%) og HSIL (53,8%). Screening av alle integrering loci viser at 35 av 63 kartlagte integrasjons steder ble plassert i eller nær en skjør nettsted med en avstand på 26 bp til 5 MBP (tabell 2). Blant de 22 kartlagte skjøre områder, ble FRA13A funnet i 4 uavhengige utvalg. Tjueto transkripsjoner var ikke forbundet med noen skjøre området.

De cellulære flankerende sekvenser av viral-cellulære fusion transkripsjoner ble videre undersøkt for kjente gener. De fleste av disse kondenserte transkripter hadde en cellulær sekvens fra det kodende orienteringen av kjente gener og tretti transkripter hadde den cellulære sekvens fra et intron region, og 8 transkripter ble smeltet sammen med en følelse ekson sekvens av de forutsagte genene (tabell 2). Blant disse spådd gener,

AMICA1

,

DAPK1

,

EBAG9

,

PIBF1

ble rammet to ganger,

MRPS31

fire ganger og

PRDX5

selv seks ganger av viral integrering. På samme tid ble den nærmeste verts gener til hvert integreringssete i retning av transkripsjonen også analysert (tabell 2). Blant disse predikerte genene integrert eller lukket til integrering nettstedet, identifiserte vi flere tumorassosierte gener, inkludert

PRDX5

,

CD28

,

ROCK2

,

RHOH

,

TIMP3 Hotell og

DAPK1

, etc. Som vist i tabell 1, transkripsjoner inn D og E ble bare påvist i CxCa og de fleste av deres integrering loci ble plassert i eller nær den skjøre områder av FRA13C, FRA22B, FRA2I og FRA13A. De gener assosiert med transkripsjoner inn D og E var onkogener (

CD28 Hotell og

EBAG9

), tumorsuppressorgener (

TIMP3

), eller tumorrelaterte gener (

PIBF1 Hotell og

MRPS31

).

Diskusjoner

Integrering av HPV genomet til verts kromosomer representerer en tidlig klonal hendelse for å gi en ekstra selektiv fordel for utvidelse av svulst. Viral transkripsjoner har blitt oppdaget av APOT analyse [26], [31], [42] – [45]. Selv APOT analysen har noen fordeler i deteksjons transkripsjoner fra hvert kromosom integrasjon område, er det flere begrensninger. For det første er det vanskelig å forsterke meget lange integrasjons-avledede transkripter, noe som vil undervurderer antall tumorer med integrert HPV DNA [45]. For det andre er APOT en type nestet PCR, som kan ha en tendens til å forsterke utskrifter med høyere nivåer og ignorere de med lavere nivåer. For det tredje har det blitt rapportert at den indre poly A priming kan erstatte oligo (dT) primer innenfor visse grenser, og generering av et sett av forankrede oligo (dT) primere for cDNA-syntese. Disse sekvensene er forårsaket av indre priming avbrutt genererings av full-lengde cDNA og forvirret analyse av alternativ spleising [37]. Med vår modifisert APOT analyse for å detektere transkripsjon mønster av cervical vev, fant vi mange viral transkripsjoner forbundet med poly A eller vertsgenomsekvenser i HPV16-smittet cervical squamous epitelvev. Vi la merke til at det var mange av virus transkripsjoner direkte endte med poly A ved deres 3′- ender. Med unntak av den rapporterte E1-spleisedonor signal hotellet (nt 880), Avkortings områder på nt1054, 1234 og 5815 verken inneholdt interne poly A-sekvenser eller noen polyadenyleringssignaler bør være potensial nye integrerte områder og behov for videre analyse. Viral-cellulær fusjon transkripsjon av type A og C har blitt rapportert tidligere [26], [31], [41]. I Type C avskrift, ville integreringen avbrudd av E4 termineringskodon resultere i E4 å bruke en rekke termineringskodon. I denne studien har vi også lagt merke til at noen av livmorhalskreft prøvene inneholdt alle tre typer av vitnemål var viral-cellulære fusion transkripsjoner.

HPV16 transkripsjons mønstre i LSIL, HSIL, og CxCa var signifikant forskjellig. Vi fant ut at den type C transkripsjon ble bare påvist i prøver av CxCa og flere tilfeldig integrering sider eksisterte i våre vevsprøver. I likhet med tidligere rapporter [31], [38] – [42], [46], [47], vår studie indikerer at HPV integrering ikke har foretrukket område på det humane genomet. Med unntak av kromosom 21 og X, andre kromosomene er alle utsatt for HPV16 integrering. Omtrent 55% integrasjoner ligger i eller nær en skjør nettsted. Forskjellig fra tidligere rapporter [42], [45], oppdaget vi at integrering hendelser oppstår ofte flere ganger betydelig mer i livmorhalskreft enn i LSIL og HSIL. Disse dataene ikke bare gi biologisk støtte til epidemiologiske observasjon at vedvarende infeksjon med bestemte typer HR-HPV er den viktigste årsaken til livmorhalskreft [1], men også indikere at påfølgende valg for og opphopning av mutasjoner i ennå-å-be- identifiserte viktige cellulære regulatoriske gener som fremmer ytterligere progresjon til livmorhalskreft.

integrasjonen ikke bare endrer transkripsjonsmønsteret relevant for feilregulert ekspresjon av de virale onkogener, men også påvirker ekspresjonen av verts genet med virusgenomet integrasjon. Integrasjonen endrer ekspresjonen av vertsgener i integrerings områder, selv om dette skjer i løpet av de intronsekvensene [43], [45]. I vår studie identifiserte vi et bredt spekter av kreftassosierte gener i integrerings områder og flankerer sekvens regioner. De fleste av gener i integrerings steder ble assosiert med tumorutvikling, og nitten gener ble sterkt knyttet til livmorhalskreft. Noen av dem fungerer som kreftbeskyttelse (for eksempel,

MIR-34a

,

MSH2

,

WWOX Hotell og

TIMP3

,

m.fl.

) eller onkogener (for eksempel,

ROCK2

,

CD28

,

EBAG9 Hotell og

ANGPT1

,

et al

). Interessant, de fleste av dem ble ikke rapportert i tidligere dokumenter [31], [45].

MiR-34a

, en viktig tumor suppressor, er nedregulert i livmorhalskreft [48], [49]. Det har blitt rapportert at oncoprotein E6 av HPV16 og HPV18 kan hemme ekspresjon av tumorundertrykkende

MIR-34a

ved destabilisering av p53 og resulterte i celleformering [50]. Avbrudd av

MIR-34a

genet kan videre tolke fenomenet redusert uttrykk for

MIR-34a

i livmorhalskreft.

MSH2

er en DNA mismatch reparasjon protein, og i forbindelse med DNA-reparasjon pathway [51], [52]. Redusert uttrykk for MSH2 kan være en risikofaktor i tidlig stadium livmorhalskreft [53].

ROCK2

, et viktig signalmolekyl, kan fremme livmorhalskreft metastase ved oppregulering og aktivering av uttrykk og funksjon av moesin protein gjennom RhoA /ROCK2 vei [54]. Foruten de kreft-assosiert gener, kan genene i integrerings områder og flankerende sekvens regioner også være gunstig for viral genom integrering.

FANCM

som er en DNA-translokase og sterkt knyttet til DNA-replikasjon regulerer kontrollposten signalering og replikasjonsgaffelen progresjon [55], [56]. Andre gener, så som

COX6B1

er relatert til celle apoptose [57] og

ESRRA

også har blitt rapportert i forbindelse med kreft i livmorhalsen [58]. I tillegg blant 45 integrering hendelser, 13 hendelsene førte til antisense transkripsjon av kodende sekvenser, for eksempel

PRDX5

,

EBAG9 Hotell og

CD28, etc

. Disse integrasjoner ble generelt ansett av ingen interesse. Imidlertid ble deres fornuft sekvenser assosiert med DNA restaurering eller svulst utvikling og kan påvirke både vert og viral genuttrykk under utvikling av livmorhalskreft. Den mest integrering i antisense-orientering ble genet som koder for peroxiredoxin 5 (

PRDX5

), et beskyttende emzyme mot oksidativt stress [59], [60]. Sin endrede ekspresjon på grunn av HPV16 integrering kunne ha betydelig virologisk konsekvens, sammen med integrering i DNA-reparasjonsgener, for eksempel FANCM og MSH2. Oppregulering av

EBAG9

uttrykk har blitt observert i flere ondartede svulster [61]. Den synergistiske faktor stimulering av

CD28

som opprettholder immun homeostase spiller en rolle i å øke mottakeligheten for livmorhalskreft [47].

Som konklusjon, forandringer av transkripsjonsmønstre for HPV 16 tidlige gener går langs med progresjon fra cervikal intraepitelial neoplasi for cervix karsinom og viral genom integrering i vertskromosomet. Endringen eller utvalg av transkripsjons mønstre og integrering på uttrykk for vertsgener i integrasjons områder og flankerer cellulære sekvens regioner kan alle ta del i onkogenese av HPV16-indusert kreft.

Hjelpemiddel Informasjon

Figur S1 .

Typene virale sekvenser knyttet til poly A ved deres 3′- ender. Den type klasse I viser E1 sekvenser direkte endte med poly A; den type klasse II viser E1 skjøtes til E4 og deretter til L1 og endte også med poly A sekvenser.

▴, er det flere trunkeringstegn steder i E1 (data vist i Figur S2)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0097588.s001 plakater (TIF)

Figur S2.

Ulike trunkeringstegn steder i E1-regionen i den type klasse I. Det er fire avkortede steder i E1, 880, 949, 1054 og 1234, henholdsvis

doi:. 10,1371 /journal.pone.0097588.s002

(TIF)

Figur S3.

Flere spleiset donorsteder i E1. I Type A er det to integrasjons steder i E1, 880 og 1107, henholdsvis. De solide bokser bety cellulære sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0097588.s003 plakater (TIF)

Takk

Vi takker Zhi Ming Zheng fra NIH og Kong -Nan Zhao for nyttige kommentarer og revisjoner.

Legg att eit svar