Abstract
Mål
For å sammenligne de biologiske effektene av
125I frø kontinuerlig lavdose-rate (CLDR) stråling og
60Co γ-ray high-dose rate (HDR) stråling på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler.
Materialer og metoder
A549, H1299 og BEAS-2B celler ble utsatt for
125I frø CLDR stråling eller
60Co γ-ray HDR stråling. Overlevelses fraksjon ble bestemt ved anvendelse av en kolonidannende analyse. Cellesyklusprogresjon og apoptose ble detektert ved strømningscytometri (FCM). Uttrykket av apoptose relaterte proteiner caspase-3, kløyvde-caspase-3, ble PARP, kløyvde-PARP, BAX og BCL-2 oppdaget av western blot analyse.
Resultater
Etter bestråling med
125I frø CLDR stråling, var det en lavere overlevelsesfraksjon, mer utpreget cellesyklus-stans (G
1 rest og G
2 /M arrest i A549 og H1299-celler, henholdsvis) og en høyere apoptotiske ratio for A549 og H1299 celler enn etter
60Co γ-ray HDR stråling. Videre Western blot analyser viste at
125I frø CLDR stråling bemerkelsesverdig oppregulert uttrykk for Bax, kløyvde-caspase-3 og kløyvet-PARP proteiner og nedregulert uttrykket av BCL-2 proteiner i A549 og H1299 celler sammen med
60Co γ-ray HDR stråling. Men det var lite endring i apoptotiske forholdet og uttrykk for apoptose relaterte proteiner i normale BEAS-2B celler mottar samme behandling.
Konklusjoner
125I frø CLDR stråling førte til bemerkelsesverdig vekst hemming av A549 og H1299 celler sammenlignet med
60Co HDR γ-ray stråling; A549-celler var den mest følsomme for stråling, etterfulgt av H1299-celler. I motsetning til normale BEAS-2B-celler var relativt radio-resistente. Ubalansen av BCL-2 /Bax forholdet og aktivering av caspase-3 og PARP proteiner kan spille en nøkkelrolle i anti-proliferative effekter indusert av
125I frø CLDR stråling, selv om andre muligheter ikke har blitt ekskludert og vil undersøkes i fremtidige studier
Citation. Wang Z, Zhao Z, Lu J, Chen Z, Mao A, Teng G, et al. (2015) En sammenligning av de biologiske effektene av
125I Frø kontinuerlig lavdose-Rate stråling og
60Co høydose-Rate gammastråling på ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 10 (8): e0133728. doi: 10,1371 /journal.pone.0133728
Redaktør: Qinghui Zhang, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 23 januar 2015; Godkjent: 01.07.2015; Publisert: 12. august 2015
Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av No. 12140901402, https://www.nsfc.gov.cn, Science Foundation of China, ZMW Natural; og nr 20114014, https://www.wsjsw.gov.cn/wsj/n429/n432/n1487/n1508/userobject1ai79649.html fondet av Shanghai by helse og Family Planning Commission, ZMW. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste kreftformen og den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i kjønnsuavhengig populasjoner, sto for 14% av alle krefttilfeller og 28% av alle kreftrelaterte dødsfall i verden [1, 2] . Men, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80-85% av alle lungekreft tilfellene, og ca 40% av disse pasientene er diagnostisert med avansert NSCLC eller medisinsk ubrukelige sykdom med en 5-års overlevelse rate på mindre . enn 15% [1, 3]
Hos pasienter som er diagnostisert med avansert NSCLC eller medisinsk inoperable sykdom, er strålebehandling vanligvis et viktig behandlingsalternativ; denne behandlingen inkluderer
60Co γ-ray high-dose-rate (HDR) stråling og
125I frø kontinuerlig lavdose-rate (CLDR) stråling. Selv om ekstern radioterapi er fortsatt en av de viktigste former for kreftterapi for et bredt utvalg av ondartede humane kreftformer, har den alvorlige bivirkninger på det omgivende friske vev.
125I frø CLDR stråling har flere potensielle fordeler i forhold til ekstern radioterapi, slik som en lokalisert dosefordeling, sparsom av normalt vev, minimal invasivitet, noen komplikasjoner, utmerket lindring av smerte og lokal kontroll [4]. Derfor
125I frø CLDR stråling har gradvis blitt brukt i lokal behandling av pasienter med avansert og ubrukelige prostatakreft, lungekreft, kreft i bukspyttkjertelen, tykktarmskreft og spiserørskreft [5-9].
Selv om mange kliniske studier har rapportert at
125I frø CLDR stråling er en mulig adjuvant prosedyre for å kontrollere lokale symptomer og forlenge overlevelsen i avansert NSCLC, noen studier har vist forskjellen i de biologiske effekter mellom
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling på NSCLC-celler eller forskjellen i radiosensitivitie av NSCLC-celler.
det er velkjent at tumorcellene er karakterisert ved ukontrollert proliferasjon og redusert apoptose. For å opprettholde genomisk integritet, flere DNA-reparasjonssignalveier og cellesyklus sjekkpunkt kontroller er aktivert i respons til stråling-indusert skade. Celler som skulle gjennomgå apoptose, eller død ble den DNA-skade ikke reparert eller var det for å akkumulere tilstrekkelig [10]. Apoptose er en viktig mekanisme i IR-indusert celledød, og som oftest skjer gjennom mitokondriene-avhengige indre vei, noe som innebærer en rekke apoptose-relaterte gener som Bax, Bcl-2, caspase-3 og PARP [11]. Bcl-2 og Bax er en av de mest viktige gen parene regulerer apoptose, og deres ekspresjon er forholdsvis stabilt under normale omstendigheter. Når nivået av Bcl-2-protein økes, blir aktiveringen av caspase-3-protein hemmet. I motsetning til dette øker i Bax proteinekspresjon fremme aktiveringen av caspase-3 protein og induserer celleapoptose [11, 12]. Caspase-3 er den viktigste skarp protein, og dets aktivering resulterer i spaltingen av PARP, som er relatert til DNA-skade reparasjon, og til slutt apoptose [13, 14].
For å sammenligne effekten av strålebiologisk
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling, vi studert disse effektene i de vanligste patologiske typer lunge adenokarcinomceller (A549 og H1299) og i humane normale bronkial epitelceller (BEAS-2B). Celleoverlevelse fraksjon ble analysert ved hjelp av klonogene assay, cellesyklus-stans fremkalt av IR ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri (FCM), og at protein uttrykk nivåer av BCL-2, BAX, avspaltes-caspase-3 og Spaltet-PARP ble påvist ved hjelp av Western-blots .
Materialer og metoder
Cell kultur og strålingsforhold
i denne studien, den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer A549 og H1299 og normal menneskelig bronkial epitelcellelinje BEAS -2b var en gave fra Radiation Biological Laboratory of Suzhouuniversitetet (Suzhou, Kina). Cellene ble opprettholdt i Dulbecco’s-modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med FBS (10%), penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 pg /ml) i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO
2.
i denne undersøkelsen har vi brukt en in-house
125I frø strålingsmodell for CLDR [15, 16, 4], er modellen laget av polystyren materiale, og består av en lavere frø plakett sjikt og et øvre cellekultur plakk lag. I frøet plakk lag ble 14 frø i samme avstand innenfor utsparinger (4,5 mm x 0,8 mm) rundt en 35 mm diameter (D) omkrets. Således er en 6 x 35 mm D omkrets kan inneholde 84 frø, og en 6 x 35 mm cellekulturskål kan være plassert på cellekulturen plakk lag. Høyden (H) mellom frøet plakk og bunnen av cellekulturskål var 12 mm, noe som ga en D /H-forhold på 2,9. Under CLDR, den
125I stråling modellen ble alltid plassert i en føre-boksen i kuvøse; ventilasjonshull ble inkludert rundt ledningen boksen for å tillate CO
2 som er nødvendig for cellevekst for å gå inn og forlate bly boksen, som ble brukt for å hindre radioaktive lekkasjer. Modell BT-125-1
125I frø ble kjøpt fra Shanghai GMS Pharmaceutical Co., LTD. (Shanghai, Kina). Aktiviteten av enkelt
125I frø var 2,5 mCi, og den første dose var 18,32 cGy /t. Eksponeringstidene som kreves for å levere ulike doser ble beregnet ved hjelp av følgende formel:. De eksponeringstider for å levere doser på 200, 400, 600 og 800 cGy av
125I frø CLDR stråling med en initial dose på 18,32 cGy /t var 10.97, 22.00, 33.08 og 44.23 timer, henholdsvis.
60Co HDR γ-ray stråling ble generert ved hjelp av en 1,25 MeV GWXJ80 Cobalt-60 teleterapi enhet (Nuclear Power Institute of China) på Radiation Center, Suzhouuniversitetet (Suzhou, Jiangsu, Kina) [17]. Doseraten som ble brukt var 0,5 Gy /min. Avstanden mellom strålingskilden og celleplanet var 0,8 m. De eksponeringstider som trengs for å levere doser på 200, 400, 600 og 800 cGy ved hjelp av
60Co HDR γ-ray stråling ved den første dosen hastighet på 0,5 Gy /min var henholdsvis 4, 8, 12 og 16 minutter,. Celler gjennomgår eksponentiell vekst ble utsatt for
125I frø CLDR bestråling eller overfor
60Co HDR γ-ray stråling på to, fire, seks og åtte Gy. Kontrollceller ble underkastet den samme prosedyre uten stråling (0 Gy).
klonogene overlevelsesanalyse
A549, H1299 og BEAS-2B-celler som gjennomgår eksponentiell vekst ble trypsinisert for å danne en enkelt cellesuspensjon og utsådd i 35 mm kulturplater ved forskjellige fortynninger [18] (celleantall ble bestemt ifølge til bestrålingsdose, som følger: 200 celler pr tallerken for kontroll og 2 Gy behandlinger, 500 celler for 4 Gy behandling, 1.000 celler for 6 Gy behandling og 4000 celler for 8 den Gy behandling). Etter A24-timers inkubering, det A549, H1299 og BEAS-2B-celler ble utsatt for
125I frø CLDR bestråling eller overfor
60Co HDR γ-ray stråling fra 0, 2, 4, 6 eller 8 Gy, hvoretter cellene ble plassert i en 37 ° C inkubator og dyrket i 10-14 d å danne kloner. Deretter ble koloniene fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Kolonier med mer enn 50 celler ble regnet som kolonidannende enheter.
Cell syklus analyse av flowcytometri (FCM)
A549, H1299 og BEAS-2B celler som gjennomgår eksponentiell vekst ble utsatt for
125I frø CLDR stråling eller
60Co HDR γ-ray stråling fra 0, 2, 4, 6 eller 8 Gy. Etter bestråling ble cellene dyrket kontinuerlig i 24 timer. Deretter ble cellene trypsinert og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min. Supernatanten ble kastet, og cellene ble vasket med kald fosfatbufret saltvann (PBS) en til to ganger, og fiksert i 70% alkohol ved 4 ° C over natten. Cellene ble deretter sentrifugert på nytt, og fikseringsløsningen ble kastet. Deretter ble cellene vasket med kald PBS en eller to ganger, og deretter inkubert med 10 mg /ml RNase A og 500 ug /ml PI i mørke i 15-30 minutter ved romtemperatur for å bestemme den cellesyklusprogresjon til FCM.
Apoptose analyse av FCM
De tre celletyper ble bestrålt med
125I frø eller
60Co fra 0, 2, 4, 6 eller 8 Gy 24 timer etter plating. Ved 48 timer etter bestråling ble cellene høstet, resuspendert i 500 ul bindingsbuffer og blandet med 5 ul av Annexin V-FITC og 5 ul av PI på 15-30 min i mørke ved romtemperatur i henhold til produsentens instruksjoner (Biuniquer Technology) for å undersøke apoptotiske forholdet til FCM.
Western blotting
A549, ble H1299 og BEAS-2B celler som gjennomgår eksponensiell vekst utsatt for
125I frø CLDR stråling eller
60Co HDR γ-ray stråling fra 0, 4, 8 eller Gy. Cellene ble høstet, sentrifugert og vasket to ganger med iskald 1 x PBS 24 timer etter bestråling. Deretter ble totalt protein ekstrahert med lyseringsbuffer (Beyotime, Kina) inneholdende 1 mM PMSF (Beyotime, Kina) og en protease inhibitor cocktail tablett (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) per 10 ml av oppløsningen ble tilsatt. Deretter ble det totale protein isolert. Etter sentrifugering ble supernatanten overført til nye rør. Proteinkonsentrasjonene ble bestemt ved BCA assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Et totalt volum på 20 ul prøve inneholdende 50 ug protein ble separert ved SDS-PAGE og elektroblottet på polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Membranene ble deretter blokkert med 5% ikke-fettmelk i TBS-T (20 mmol /liter Tris-HCl, 150 mmol /l NaCl og 0,1% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert med det passende primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Etter å ha blitt fullstendig vasket med TBST ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur, hvoretter ble membranene igjen vasket med TBST. Deretter ble proteinene detektert ved hjelp av den forbedrede kjemiluminescens (ECL) system med prestained markører som molekylære størrelse standarder
De primære antistoffer som brukes i vår undersøkelse var anti-β-aktin (. 1: 1000 fortynning, 60008-1 -ig, Proteintech, USA), anti-caspase-3 (1: 1000 fortynning, 19677-1-AP, Proteintech, USA), anti-PARP (1: 1000 fortynning, 13371-1- AP, Proteintech, USA), anti-Bax (1: 1000 fortynning, 50599-2-Ig, Proteintech, USA) og anti-Bcl-2 (1: 1000 fortynning, 12789-1-AP, Proteintech, USA). De sekundære antistoffer som brukes i vår undersøkelse var pepperrot peroksidase-merket geit-anti-rotte-IgG (H + L) (1: 2000, A0192, Beyotime Institutt for bioteknologi, Kina) og pepperrot peroksidase-merket geite anti-kanin IgG (H + L ) (1:. 2000, A0208, Beyotime institutt for bioteknologi, Kina)
Statistiske analyser
Alle resultater er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE) av tre uavhengige eksperimenter, og hvert eksperiment brukte tre parallelle prøver. Signifikante forskjeller i data av forskjellige grupper ble evaluert av Student
t
test og enveis ANOVA. Signifikans ble satt til P-verdier under 0,05.
Resultater
klonogene overlevelse
For å undersøke om de anti-proliferative effekter indusert av
125I frø CLDR stråling var mer effektiv enn de av
60Co HDR γ-ray stråling på A549, H1299, og Beas-2B-celler og å detektere hvorvidt radiosensitivities av de tre cellelinjene var de samme, utførte vi en klonogene overlevelsesanalyse. Som vist i figur 1 (S1 Datasett), overlevelses fraksjoner av A549, H1299 og BEAS-2B-celler etter
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling ble signifikant redusert sammenlignet med den til kontrollceller ( P 0,05). For A549-celler, overlevelsesfraksjonen som induseres av
125I frø CLDR stråling var signifikant lavere enn den til
60Co HDR γ-ray-stråling på 4, 6 og 8 Gy (figur 1A, P 0,05); men forskjellen var ikke signifikant på 2 Gy. For H1299 celler, overlevelse fraksjonen i
125I frø CLDR stråling gruppe ble også redusert betydelig sammenlignet med den til
60Co HDR γ-ray stråling gruppe på 4, 6 og 8 Gy (figur 1B, P 0,05 ). Vi har imidlertid ikke observere en forskjell i overlevelse brøkdel mellom normal BEAS-2B celler behandlet med de to strålekilder ved samme doser (Fig 1 C, P 0,05). Fig 1D og 1E viser at overlevelsen fraksjon fra laveste til høyeste var A549 H1299 BEAS-2B i både
125I frø CLDR-stråling gruppen og
60Co HDR γ-ray-stråling gruppen (P 0,05 .)
AC: forskjellen i overlevelse brøkdel av A549, H1299 og BEAS-2B celler mellom
125I frø CLDR stråling og
60Co γ-ray HDR stråling. * Angir en signifikant forskjell (P 0,05) når man sammenligner de to strålingsbehandlinger og kontrollbehandling, og # indikerer en signifikant forskjell (P 0,05) når man sammenligner
125I frø CLDR stråling og
60Co γ-ray HDR stråling av de samme doser. D, E: Forskjellen i overlevelsesfraksjonen av de tre cellelinjene som mottar den samme behandling. * Angir en signifikant forskjell (P 0,05). Barer, standard feil (SE).
G
1 arrest i A549 celler og G
2 /M arrest i H1299 og BEAS-2B celler
For å utforske enten
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling forårsaker forskjellige typer av cellesyklus-stans, analyserte vi cellesyklusfordelingen etter bestråling med de to strålingskilder på 0, 2, 4, 6 og 8 Gy . Som vist i figur 2 (S2 Datasett), observerte vi G
1 arrest i A549 celler og G
2 /M arrest i H1299 og BEAS-2B celler etter bestråling med
125I frø og
60Co bestråling av 4, 6 og 8 Gy sammenlignet med kontrollceller (P 0,05); men forskjellen var ikke signifikant på 2 Gy. Videre flere A549 celler var i G
1 fase og flere H1299 celler var i G
2 /M fase etter
125I frø CLDR stråling enn etter
60Co HDR γ-ray stråling på 4, 6 og 8 Gy; denne trenden var doseavhengig (Fig 2A og 2B, P 0,05). Men det var ingen signifikant forskjell i G
2 /M arrest mellom
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling i normale BEAS-2B celler (figur 2C, p 0,05). Etter
125I frø CLDR bestråling av 4 Gy, G
1 fase prosentandel av A549-celler var 70,67 ± 0,86%, og G
2 /M-fase prosenter for H1299 og BEAS-2B-celler var 21,77 ± 0,31% og 16,86 ± 0,29%, henholdsvis. Men bare 59,59 ± 0,41% av A549 cellene i G
1 fase og 18,85 ± 0,99% av H1299 celler og 15,58 ± 0,48% av BEAS-2B celler var i G
2 /M fase etter
60Co HDR γ-ray stråling av 4 Gy; andre data er som vist i figur 2.
A: G
1 arrest av A549-celler bestrålt med de to strålekilder; B, C: G
2 /M arrest av H1299 og BEAS-2B celler etter bestråling med de to strålekilder. * Angir en signifikant forskjell (P 0,05) når man sammenligner to, fire, seks og åtte Gy bestråling av de to strålekilder og kontroll (0 Gy) behandling, og # indikerer en signifikant forskjell (P 0,05) når man sammenligner de to strålings behandlinger av den samme dose. Barer, standard feil (SE).
apoptotiske forhold på A549, H1299 og BEAS-2B celler
Cell apoptose indusert av IR er en av de viktigste effektene av tumor strålebehandling. Derfor er de apoptotiske forhold mellom A549, H1299 og BEAS-2B-celler etter bestråling med
125I frø og
60Co y-stråler ved 0, 2, 4, 6 og 8 Gy ble undersøkt (S3 datasettet). Som vist i figur 3A og 3B, som begge
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling førte til en markert økning i den apoptotiske forholdet mellom A549 og H1299-celler sammenlignet med kontrollbehandling ved 4, 6 og 8 gy (P 0,05), mens den apoptotiske forholdet var lik ved 2 Gy mellom de to typer stråling behandling og kontroll. Som forventet
125I frø CLDR stråling førte til en høyere prosentandel av apoptotisk A549 og H1299 celler enn gjorde
60Co HDR γ-ray stråling på 4, 6 og 8 Gy (fig 3A og 3B, P 0,05). Imidlertid var det ingen forskjell i den apoptotiske forholdet mellom BEAS-2B-celler som mottar
125I frø CLDR stråling,
60Co HDR γ-ray stråling eller kontrollbehandling (figur 3C, P 0,05). Som vist i figur 3D og 3E, den apoptotiske forholdet var A549 H1299 BEAS-2B for både
125I frø CLDR stråling gruppe og
60Co HDR γ-ray stråling gruppen (P 0,05). De apoptotiske forholdstall var 18,09 ± 0,42% og 13,79 ± 0,50% for A549 celler og H1299 celler henholdsvis etter
125I frø CLDR stråling av 4 Gy. I motsetning til dette apoptotiske forholdstall var bare 9,46 ± 0,42% og 8,79 ± 0,22%, henholdsvis, etter at
60Co HDR γ-ray stråling med 4 Gy; andre data er som vist i figur 3.
AC: forskjellen i apoptotiske forholdet av A549, H1299 og BEAS-2B-celler som mottar
125I frø CLDR stråling og
60Co γ-ray HDR stråling . * Angir en signifikant forskjell (P 0,05) når man sammenligner to, fire, seks og åtte Gy bestråling av de to strålekilder og kontroll (0 Gy) behandling, og # indikerer en signifikant forskjell (P 0,05) når man sammenligner de to strålings behandlinger av de samme dosene. D, E: forskjellen i apoptotiske prosenter av de tre cellelinjene bestrålt med
125I frø og
60Co y-stråler. * Angir en signifikant forskjell (P 0,05). Barer, standard feil (SE).
Ubalansen av Bcl-2 og Bax proteiner
klonogene overlevelse analyse, cellesyklus analyse og celle apoptose analyseresultater oppnådd ved hjelp av FCM tyder på at forskjellene mellom disse to strålings mehtods og den blanke kontrollgruppen var ikke signifikant ved 2 Gy bestråling; Derfor, valgte vi 4 og 8 Gy for bruk i denne studien. Det har blitt foreslått at Bcl-2 og Bax representerer en av de mest viktige gen parene for regulering av apoptose [19, 20]. Derfor, Bcl-2 og Bax protein-ekspresjon ble påvist ved western blot-analyse. Som vist på fig 4A og 4B, både
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling på 4 og 8 Gy kunne significantl oppregulerer ekspresjonen av Bax protein og ned-regulerer ekspresjonen av Bcl- 2 protein i A549 og H1299 celler sammenlignet med kontrollbehandling. Effektene indusert av
125I frø CLDR stråling var mer opplagt enn de av
60Co HDR γ-ray stråling. Som ventet var det ingen økning i Bcl-2 og BAX uttrykk i BEAS-2B celler etter bestråling av enten
125I frø CLDR stråling eller
60Co HDR γ-ray stråling (fig 4C).
En representant resultatet av tre uavhengige forsøk med identiske resultater vises. Con:. Kontroll
Aktivering av caspase-3 og PARP
Aktivering av caspase-3 og PARP proteiner er ofte ansett som de biokjemiske kjennetegn på en apoptotisk hendelse. Derfor ble spaltet-kaspase-3 og spaltet PARP-proteinene undersøkt ved western blot-analyse. Som illustrert på figur 5A og 5B, er uttrykk for Spaltet-kaspase-3 og spaltet PARP-proteiner ble oppregulert ved både
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling. Videre uttrykket nivåer av Spaltet-caspase-3 og spaltet-PARP var mye høyere i A549 og H1299 celler som hadde vært utsatt for
125I frø CLDR stråling enn hos de som hadde vært utsatt for
60Co HDR γ- ray stråling. Imidlertid var tydelig i nivåene av spaltede-kaspase-3 og spaltet-PARP-proteiner blant BEAS-2B celler eksponert ingen forskjell til
125I frø CLDR stråling,
60Co HDR γ-ray stråling og sham stråling (fig 5C ).
En representant resultatet av tre uavhengige forsøk med identiske resultater er vist.
Diskusjoner
i denne studien
125I frø CLDR stråling førte til mer bemerkelsesverdig A549 og H1299 celleveksthemming enn gjorde
60Co HDR γ-ray stråling, som er konsistent med resultatene av andre undersøkelser [21]; men forskjellen var ikke signifikant på 2 Gy for de to strålebehandlinger. Vi så også klart at Radiosensitivity var A549 H1299 BEAS-2B, som er i overensstemmelse med resultatene som rapporteres av Masahiko Nishizaki et al. [22]. Våre resultater har også foreslått at BEAS-2B-celler er resistente mot bestråling i forhold til A549 og H1299-celler.
Det er vel kjent at hver fase av cellesyklusen inneholder sjekkpunkter som gjør det mulig for arrest av cellesyklusprogresjon til enten å aktivere reparasjonsmekanismer eller aktivere cellen apoptotiske kaskade og celledød etter DNA-skade indusert av IR eller andre faktorer [23, 24]. I vår studie betydelig G
1 arrestasjonen av A549 celler ble indusert mer av
125I frø CLDR stråling enn ved
60Co HDR γ-ray stråling på 4, 6 og 8 Gy, som er konsistent med andre studier som evalueres i bukspyttkjertelen og prostata kreft celler [25, 26]. Men vi bør være oppmerksom på at det var også noen forskjeller. For eksempel rapporterte Junjie Wang som
125I frø CLDR stråling førte til langsiktig G
2 /M arrestasjonen av A549 celler ved 4 Gy med en initial dose på 2,77 cGy /h [21], som er i kontrast til den betydelige G
en arrestasjon med en initial dose på 18,32 cGy /t observert i vår studie. Forskjellen i den innledende doserate, og en rekke andre faktorer som for eksempel status av celler kan, i det minste delvis, står for denne forskjellen. De spesifikke mekanismene bak dette fenomenet er ukjent. Det var imidlertid G
2 /M arrest i H1299 og BEAS-2B-celler som fikk samme behandling. Geyer og medarbeidere har rapportert G
1 arrest i A549 celler og G
2 /M arrest i H1299 celler under samme bestrålings forhold, og ingen G
1 arrest ble observert i IR-behandlede celler som mangler p53 [27]. Disse resultatene er lik resultatene fra dette studiet. Selv om det var signifikant G
2 /M arrest av normale BEAS-2B-celler, graden av G
2 /M rest forårsaket av de to strålingskilder var like, noe som er konsistent med den kolonidannende evne observert hos den foreliggende undersøkelsen.
apoptose, også kjent som programmert celledød, er den viktigste mekanisme for IR-fremkalt celledød. For å opprettholde genomisk integritet, kan flere DNA-reparasjon signalveier og cellesykluscheckpoint kontroller er aktivert som reaksjon på strålingsinduserte skader, men hvis disse reparasjonsprosesser svikte eller uopprettelig skade akkumuleres til en viss grad, blir celle apoptose eller celledød indusert [10] . Ifølge våre observasjoner,
125I frø CLDR stråling førte til en høyere prosentandel av apoptotisk A549 og H1299 celler enn gjorde
60Co HDR γ-ray stråling, mens apoptotisk forholdet mellom BEAS-2B celler indusert av de to strålekilder ved 2, 4, 6 og 8 Gy var lik den for kontrollceller, som var konsistent med andre studier [19]. I vår studie, kan synes forskjellen i resultatene som oppnås ved bruk av
125I frø CLDR stråling og
60Co gamma HDR stråling overraskende. For x- eller y-stråler, er doserate blant de viktigste faktorene som bestemmer de biologiske konsekvensene av en gitt absorbert dose; som doseraten er redusert og eksponeringstiden forlenges, blir den biologiske effekten av den gitte dosen generelt redusert [28]. Imidlertid, når doseraten er redusert til mindre enn 1 Gy /time, redusere dosefrekvens kan resultere i økt celledreping; denne effekten har blitt ble kalt en invers dose-rate effekt og lavdose hyper-Radiosensitivity (HRS) [29].
I vår studie resultatene oppnådd ved bruk av en klonogene overlevelse analyse, cellesyklus analyse og celle apoptose analyse ved hjelp av FCM antydet at forskjellene mellom den testede strålebehandling gruppe og den blanke kontrollgruppen var ikke signifikant ved 2Gy; Derfor fokuserte vi på de potensielle molekylære mekanismene bak den mer tydelig anti-proliferativ effekt av
125I frø CLDR stråling sammenlignet med
60Co HDR γ-ray stråling på 4 og 8Gy.
apoptose oftest skjer gjennom mitokondriene-avhengige indre vei, som er en kompleks prosess som involverer en rekke apoptose-relaterte proteiner, inkludert caspase-3, PARP, Bax og Bcl-2 et al. [11]. Funksjonen av Bcl-2-protein, også kjent som pro-overlevelse protein Bcl-2, er til å inhibere apoptose og forlenger celleoverlevelse. Over-ekspresjon av Bcl-2-protein er assosiert med en dårlig respons på lungekreft behandling [30]. Bax, en pro-apoptotiske proteiner i BCL-2-familien, spiller en sentral rolle i formidling av apoptotisk respons [12]. Forholdet av Bcl-2 i Bax blir vanligvis betraktet som en determinant i initiering av apoptose [31]. Caspase-3-proteinet er det viktigste skarp protein. Funksjonen av PARP er rutine reparasjon av DNA-skade, og PARP er hoved substrat av caspase-3. Derfor aktivering av kaspase-3 og PARP-proteinene ble vanligvis betraktet de biokjemiske kjennetegn på apoptose [30, 32]. I vår studie, kan ubalansen mellom BCL-2 protein og BAX protein og høyere nivåer av kløyvde-caspase-3 og kløyvet-PARP proteiner delvis har fremmet økt apoptose sett i A549 og H1299 celler etter bestråling med
125I frø sammenlignet med
60Co gammastråler. For en celle for å overleve den dødelige skader på DNA DSB som er forårsaket av bestråling eksponering må være hurtig oppdages, og DNA-reparasjonsmekanismene må initieres. Noen forskere har vist at mer celledreping er forårsaket av ineffektiv aktivering eller en lavere aktivering av DNA-skade føleren ataxia telangiectasia-mutert (ATM) genet i cellene bestrålt ved lav dosehastighet (LDR) stråling i forhold til høy doserate (HDR) stråling selv når DNA allerede er skadet. I tillegg kan det hende at ATM-forbundet reparere veier ikke aktiveres etter bestråling av LDR stråling [33, 28]. IR er kjent for å forårsake G
2 /M eller G
1 rest og for å indusere apoptose i bestrålte celler [19]. Men i denne studien, de to behandlinger induserte en svak nedgang i overlevelse brøk og betydelig G
2 /M arrest, men klarte ikke å overtale betydelig apoptose i BEAS-2B celler.
Konklusjoner
i sammendraget, våre resultater viser at
125I frø CLDR stråling fører til mer bemerkelsesverdig vekst hemming av A549 og H1299 celler enn for
60Co HDR γ-ray stråling. Vi fant også at A549-celler var den mest følsomme for stråling, etterfulgt av H1299-celler, mens BEAS-2B-celler var mer resistente mot de to strålings behandlinger enn A549 og H1299 celler. Videre har denne studien viste at en ubalanse i Bcl-2 /Bax-forhold og aktivering av kaspase-3 og PARP-proteiner kan delvis forklare den anti-proliferativ effekt som induseres i A549 og H1299 celler ved
125I frø CLDR stråling. Men denne studien kun konsentrert seg om apoptose relaterte hendelser og ikke fokusere i dybden på DNA-skade reparasjon og cellesyklus sjekkpunkter på grunn av tid og finansiering begrensninger. Likevel, våre data illustrerer noen grunnleggende strålebiologisk effekter i NSCLC celler når det utsettes for
125I frø CLDR stråling.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 datasett. Overlevelses fraksjoner av A549, H1299 og BEAS-2B celler etter
125I frø CLDR stråling og
60Co HDR γ-ray stråling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0133728.s001 plakater (DOC )
S2 datasett. Cellesyklus distribusjon etter bestråling med
125I frø og
60Co gammastråler. (%)
Doi: 10,1371 /journal.pone.0133728.s002 plakater (DOC)
S3 datasett. De apoptotiske prosenter av A549, H1299 og BEAS-2B celler etter bestråling med
125I frø og
60Co gammastråler. (%)
Doi: 10,1371 /journal.pone.0133728.s003 plakater (DOC)
