Abstract
Formidling av prostatakreft (PCA) celler til benmargen er en tidlig hendelse i sykdomsprosessen. Hos noen pasienter, spres tumorceller (DTC) sprer å danne aktive metastaser etter en lengre periode med undetectable sykdom som kalles tumor dvalen. Identifisere mekanismer for PCa dvalen og reaktive forbli en utfordring blant annet på grunn av mangel på
in vitro
modeller. Her preges vi
in vitro
PCa dvalen-reaktivering av induserende celler fra tre pasient-avledet xenograft (PDX) linjer til å spre seg gjennom svulst celle kontakt med hverandre og med benmargs stroma. Prolifererende PCA celler viste tumor celle-celle kontakt og inte clustering av immunfluorescens. Global genekspresjon analyser av prolifererende celler dyrket på benmargen stroma avslørte en nedregulering av TGFB2 i alle de tre prolifererende PCa PDX linjer sammenlignet med sine ikke-formerende motstykker. Videre er konstitutiv aktivering av myosin lettkjede-kinase (MLCK), en nedstrøms effektor av integrin-beta 1 og TGF-beta2, i ikke-voksende celler fremmes celleproliferasjon. Denne celleproliferasjon var forbundet med en oppregulering av CDK6 og en nedregulering av E2F4. Til sammen våre data gi den første klinisk relevant
in vitro
modell for å støtte cellular heft og nedregulering av TGFB2 som en potensiell mekanisme som PCA celler kan flykte fra dvalen. Målrette TGF-beta2-forbundet mekanisme kan gi nye muligheter for å hindre dødelig PCa metastase
Citation. Ruppender N, Larson S, Lakely B, Kollath L, Brown L, Coleman jeg, et al. (2015) Cellular Heft Fremmer prostata kreft celler flykte fra Dormancy. PLoS ONE 10 (6): e0130565. doi: 10,1371 /journal.pone.0130565
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 11 februar 2015; Godkjent: 21 mai 2015; Publisert: 19 juni 2015
Copyright: © 2015 Ruppender et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All genekspresjon filer er tilgjengelig fra GEO databasen (tiltredelse antall GSE64262)
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av Janssen Forskning og Utvikling LLC (https://www.janssenrnd.com), og PA1 CA85859 fra National Institutes of Helse (https://grants.nih.gov/grants/funding/ac_search_results.htm?text_curr=p01)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
formidling av prostatakreft (PCA) celler til benmargen er en tidlig hendelse i sykdomsprosessen PCa [1, 2]. I mange tilfeller er disse disseminerte tumorceller (DTC) prolifererer for å danne aktive metastaser etter en lengre periode med ikke-detekterbar sykdom etter prostatektomi. Dette latensperiode blir ofte referert til som tumor uvirksom. Til dags dato er fortsatt dvalen en signifikant klinisk utfordring, som PCA pasientene hadde skjelettmetastaser til slutt slutte å svare på andre linje behandling og til slutt gi etter for sykdommen. Dermed har det blitt viktig å identifisere mekanismer for svulst dvalen i et forsøk på å hindre PCa tilbakefall.
En sovende tumor celle ikke aktivt spre seg, har likevel potensial til å formere gitt de riktige eksterne signaler. Ved denne definisjonen, kan flere scenarier potensielt indusere dvalen, inkludert ugunstig svulstens mikromiljø, nærings sult, den iboende natur DTC, eller epigenetiske endringer forårsaket av mikromiljøet [2, 3]. Men ikke alle tilfeller av lat PCa nødvendigvis utgjør dvalen. En pasient kan rett og slett ha saktevoksende kreftceller bosatt på metastatisk området på tidspunktet for første behandling og erfaring tilbakefall kort tid etterpå. Andre kan aldri oppleve tilbakefall, mens en undergruppe av pasientene opplever tilbakefall bare etter lengre perioder. Hittil mekanismene for dvalen fortsatt i stor grad ukjent. Imidlertid er urokinase-lignende plasminogen aktivator (uPA) og dens tilhørende reseptor (uPAR) har vært implisert i reguleringen uvirksom i ulike kreftformer. Nærmere bestemt, høye nivåer av uPA og uPAR indusere uvirksom flukt med oppregulering ERK /p38-forhold i kreftceller [4, 5]. Denne høye uPAR-ekspresjon var assosiert med aktiveringen av α
vp
1 integrin, noe som resulterer i tumorvekst [4-7]. I en separat studie ble uPA-regulert migrering av tumorceller aktiveres av myosin-lettkjede-kinase (MLCK) [8] som fosforylering ble indusert ved ERK [9]. MLCK er en kjent regulator av kontraktilitet, motilitet, og adhesjon [10, 11], men rollen til MLCK i PCa uvirksom flukt er ukjent.
Matrix og intercellulær adhesjon har vært implisert i tumor uvirksom regulering. Undersøkelser har vist at integrin-mediert cellulær adhesjon til ekstracellulær matriks aktivere MAPK [12-14] som regulerer tumorvekst [15-19]. I PCA oppregulering av β
1 inte fremmer vekst og invasjon av celler [3, 20], og interaksjoner mellom tumor og stroma kan skyldes utslipp av sovende celler fra strålebehandling [21]. Nyere studier som undersøker menneskelige PCA cellelinjer på mus beinmarg stroma har identifisert viktige faktorer i mus blodkreft nisje som regulerer dvalen [22, 23].
Vi her preget dvalen og vekst av tre PCA pasient avledet xenografter (PDXs) etablert fra metastaser oppnådd ved rask obduksjon eller kirurgi på menneskelige mikromiljøet i benmargen
in vitro
. Disse PDXs (LuCaP 86,2, 92 og 93) som vises
in vitro
quiescence i typiske cellekultur forhold som kan representere dvalen, og vi forsøkte å identifisere rollen som celle-celle adhesjon i utgivelsen av PCa fra dvalen i en human benmarg sammenheng. Vi bestemt at tumor celle-celle kontakt på benmargen stroma er nødvendig for LuCaP PDX celler til å spre
in vitro Hotell og var forbundet med en universell nedregulering av TGFB2. Videre kan LuCaP PDXs dvalen reaktive bli rekapitulert av konstitutivt aktivere MLCK og cyclin-avhengig kinase 6 (CDK6).
Materialer og metoder
dissosiasjon, isolasjon og kultur av LuCaP PDX
in vitro
Benmargs stromale celler (BMSC) som ble isolert fra en pasient med PCa benmetastaser (BM2508) ble sådd på 50.000 celler /cm
2 overnattinger. Den følgende dag, BM2508-celler ble behandlet med 10 ug /ml mitomycin C (Sigma, St. Louis, MO) i 1 time. LuCaP PDXs som ble rutinemessig passert
in vivo
som beskrevet tidligere [21] ble skåret ut og dissosiert bruker Miltenyi menneskelige svulst dissosiasjon kit (Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA, # 130-95-929) og beriket av positiv seleksjon ved hjelp av magnetiske mikro mot menneskelig epitelial antigen EpCAM /CD326 (Miltenyi Biotec Inc .; # 130-061-101) i henhold til produsentens instruksjoner. LuCaP PDX-celler ble deretter sådd ut på toppen av BM2508 cellene ved enten 50.000 celler /cm
2 (G; vokser /prolifererende) eller 50 celler /cm
2 (NG, ikke vokser /sovende). På dag 8, ble LuCaP PDX cellene differensiert trypsinert og beriket av positiv og negativ seleksjon med magnetiske kuler, fluorescensmerkede for EpCAM /CD326 og individuelt plukket med en micromanipulator som beskrevet tidligere [24]. Videre, for å sikre at NG celler var sovende stedet for senescent, en β-galaktosidase assay (Pierce Biotechnology, Inc., Waltham, MA, # 75707) ble utført på alle NG LuCaP PDX celler i henhold til produsentens instruksjoner. Alle prosedyrer som omfatter mennesker ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Washington Medical Center og alle fag signert informert samtykke. Den dyrestudie ble spesielt godkjent av University of Washington Institutional Animal Care og bruk komité og alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med NIH retningslinjer.
Immunofluorescent flekker
LuCaP PDX cellene ble dissosiert , valgt ut og sådd ut som beskrevet ovenfor på dekkglass konjugert med lysin. Etter 8 dager ble cellene fiksert med iskald metanol, blokkert med 5% heste-geit-kyllingserum og farget for EpCAM og Ki67 eller
1 integrin ved hjelp av et FITC-konjugert musemonoklonalt antihumant Ber-EP4-antistoff ( DAKO, Carpinteria, CA, F086001), og et kanin polyklonalt anti-human Ki-67-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SC-15402) eller en kanin polyklonalt anti-humant ITGB1 antistoff (Santa Cruz Biotechnology, SC-9970 ) i forbindelse med et geit anti-kanin Alexa-Fluor 546 konjugert sekundært antistoff (Life Technologies, Carlsbad, CA, A-11035). Dekk ble deretter montert med forlenge Gold antifade reagens som inneholder DAPI (Life Technologies; P-36931).
Cell count og WST-1-analyser
C4-2B (en gave fra Dr. Leland Chung [25]) og dissosierte LuCaP PDX-celler (LuCaP 86,2, 92, 93, 96, 141; [26-28]) ble sådd ut i RPMI-1640 eller MEM (Life Technologies) henholdsvis supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS ). Celler ble utsådd enten tynt (50 celler /cm
2) eller tett (50.000 celler /cm
2) på et konfluent monolag av BMSC (50.000 celler /cm
2) som ble forbehandlet med 10 ug /ml mitomycin C. for C4-2B celler sådd sparsomt på BMSC, etter 1 og 8 dager ble cellene farget for EpCAM, Ki67, og DAPI som beskrevet ovenfor. Bare EpCAM + epitelceller (som representerer C4-2B celler fordi BMSC er EpCAM-) ble talt i hele kammeret under et fluorescerende mikroskop bruker 200 × forstørrelse. For C4-2B celler seeding uten BMSC, ble WST-1-analysen (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) utført i henhold til produsentens anvisninger. Absorbansen ble avlest på en mikroplateleser ved 450 nm, og bakgrunnen absorbans (media bare) ble trukket fra alle målinger. For LuCaP PDX-celler, etter 3, 7 og 14 dager på BMSC ble cellene trypsinert, farget for EpCAM og Ki67 som beskrevet ovenfor, og resuspendert i 50 ul forlenge Gold antifade reagens inneholdende DAPI. To porsjoner av 10 mL av fargede celler ble talt opp og EpCAM + epitelceller (dvs. LuCaP PDX celler) ble registrert.
flowcytometrisk analyse
C4-2B celler ble dyrket over natten i RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS og deretter behandlet med DMSO eller ML-7 (10 uM) i 24 timer og 48 timer. De behandlede celler ble trypsinert, fast, farget med 10 ug /mL DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindole, Life Technologies) /1% NP-40/10% DMSO, og lysert ved hjelp 25G sprøyte. Minst 10.000 fargede celler ble analysert ved hjelp av BD LSR II Flowcytometer System (BD Biosciences, San Jose, California) og cellesyklus ble analysert ved multicycle (De Novo Software, Glendale, California)
Viral transduksjon og medikamentell behandling av LuCaP PDX celler
in vitro
LuCaP PDXs ble skilt og valgt som beskrevet ovenfor, og belagt på 50.000 celler /cm
2 uten stromale celler. Den følgende dag ble celler transdusert ved en MOI (multiplisitet av infeksjon) av 10 med en av de følgende: a. En adenoviral vektor som enten inneholdt en aktivert form av myosin lettkjede-kinase (A-TMK, en gave fra Drs Zuzana Strakova, Jody Martin, og Primal de Lanerolle, [29]), en tom vektor, eller en lentiviral vektor som inneholdt enten cDNA for CDK6 eller GFP (Applied biologisk materiale, pLentiIII-EF1α). Celler ble transdusert i MEM supplert med 10% FBS og 8 mikrogram /ml polybren (Santa Cruz Biotechnology). Celler ble enten immunofluorescently farget som beskrevet ovenfor, eller trypsinisert for RNA-ekstraksjon. For å bestemme hvorvidt MLCK aktivitet er nødvendig for PCa proliferasjon, C4-2B celler, som lett sprer
in vitro
, ble platet ut på 50.000 celler /cm
2 i RPMI-medium (Life Technologies) supplementert med 10% FBS. Cellene ble deretter behandlet med enten 10 pM ML-7 (Sigma, I2764) eller DMSO kontroll i 24 timer
RNA-ekstraksjon og amplifikasjon
For 10-celle transcriptomic studien, 10 hver for seg isolert. celler pr xenograft linje ble lysert og amplifisert cDNA ble generert fra total-RNA ved hjelp av Nugen Ovation RNA Amplification System som tidligere beskrevet [24, 30]. CDNA ble kledd på Agilent 44k hele menneskegenomet uttrykk oligonukleotid mikromatriser (Agilent Technologies, Inc.). For andre
in vitro
eksperimenter, ble RNA isolert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, California). En mikrogram av RNA ble revers transkribert ved hjelp av Qiagen RT
2 første strand kit, etterfulgt av PCR matrise eller RT-qPCR analyse.
Merking og hybridisering av forsterket materiale til hele menneskegenomet uttrykk oligonukleotid mikromatriser
amplifiserte cDNA fra hver prøve ble merket ved hjelp av BioPrime totalt genomisk Labeling System (Life Technologies, Grand Island, NY) og microarray ble utført ifølge tidligere prosedyrer [24, 30] med små modifikasjoner. Kort sagt ble hybridiseringsprober fremstilt ved å kombinere 4 ug Alexa Fluor 3-merkete prøven med 400 ng Alexa Fluor 5-merkede referanse. Sondene ble denaturert ved 95 ° C og hybridisert ved 63 ° C på Agilent Menneskelig 4x44K mikromatriser (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), vasket, og fluorescerende array-bilder ble samlet inn ved hjelp av Agilent DNA microarray scanner. Dataene ble løss normalisert i løpet av matriser og quantile normalisert mellom arrays i R bruker Limma Bioconductor pakken. Data ble filtrert for å fjerne sonder med midlere signalintensitet under 300. Statistisk analyse av microarray (SAM) program (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) [31] ble brukt til å analysere uttrykk forskjeller mellom grupper som bruker uparede, to-utvalgs t-tester og kontrollert for multippel testing ved å estimere q-verdier ved hjelp av falske funnraten (FDR) -metoden. Microarray data er deponert i Gene Expression Omnibus database under aksesjonsnummer GSE64262.
Gene uttrykk analyserer
For å avgjøre om differensial transkripsjon observert i NG (ikke vokser /sovende) versus G (økende /prolifererende) grupper ble anriket for gener innenfor kanoniske trasé og Gene Ontologi gensettene, ble t-testresultatene underkastet Gene sett Enrichment Analysis (GSEA) ved hjelp av preranked modus med permutasjon testing av genet sett for å justere for multiple hypotesetesting, genererer en FDR. Uten tilsyn, hierarkisk clustering av de mest forskjellig uttrykt ble utført mellom NG og G grupper basert på SAM score (SAM scorer 2 og p≤0.05, totalt 238 gener) ved hjelp Cluster 3.0 (bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software /cluster /software.htm) og Java Utforsker (https://jtreeview.sourceforge.net/).
Oppfinnsomhet Pathway Analysis
238 differensielt uttrykte gener mellom NG og G gruppene var importeres til oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA, oppfinnsomhet Systems, https://www.ingenuity.com) for å identifisere molekylære og cellulære funksjoner og oppstrøms regulatorer involvert i celleproliferasjon eller dvalen som tidligere beskrevet [30]
Kvantitativ. real-time PCR
for PCR array, 25 ng av cDNA ble brukt for human cellesyklus PCR array (Qiagen Inc., PAH-020Z) i henhold til produsentens instruksjoner. For qPCR-analyse, 2NG (G og NG 10-blodlegemer), eller 10 ng (lentivirale overføringsstudier) av cDNA ble anvendt for platina SYBR grønn qPCR SuperMix-UDG-system (Life Technologies 11733-038), i forbindelse med de følgende primere: CDK6: (F) 5’AGGCTGCTGTTTTCTCTCCA3 «, (R) 5’CCACACTGCTTCTTGGGTCT3»; E2F4: (F) 5’TGATGTGCCTGTTCTCAACC3 «, (R) 5’GAGTCCTGTTCCCCTGCTCT3» .; RPS15: (F) 5’TCCGGCAAGATGGCAGAAGTAG3 «, (R) 5’CCACGCCGCGGTAGGT3»; CDC42: (F) 5’GTCACAGTTATGATTGGTGGAGA3 «, (R) 5» TCAGCGGTCGTAATCTGTCA3 «; FN1: (F) 5’AAGAGGCAGGCTCAGCAAAT3 «, (R) 5» GTCATAACAACCGGGCTTGC3 «; TGFB2: (F) 5’TCTTCCCCTCCGAAAATGCC3 «, (R) 5» TCTCCATTGCTGAGACGTCAA3 «
Resultater
PDX celler krever celle-celle kontakt for å spre
in vitro
PCA xenografter vi har etablert fra metastaser oppnådd ved rask obduksjon eller kirurgi ikke sprer
in vitro
etter dissosiasjon under standard monokultur forhold [32]. Av de fem LuCaP PCa PDX linjer vi undersøkt, viste ingen av dem målbar β-galaktosidase-aktivitet (data ikke vist), noe som tyder på disse cellene er hvilende snarere enn senescent. Som sovende celler per definisjon beholde potensial til å spre seg, søkte vi å finne ut om disse transplantater kan «aktivert»
in vitro
. Vi utviklet en
in vitro
modell recapitulating PCA cellene i kontakt med BMSC og tillot LuCaP PDX cellene sådd enten tynt uten tumor-tumor celle kontakt (NG, ikke vokser, 50 celler /cm
2) eller tett hvor cellene var i direkte kontakt med hverandre (G, vokser, 50.000 celler /cm
2, fig 1A). Vi her rapporterte at når LuCaP 86,2, 96 og 141 ble sådd tett på et monolag av BMSC, viste de en økning i celleantall etter 14 dager, mens de cellene som ble sådd tynt ikke klart å proliferere (fig 1B og data ikke vist) . I motsetning til dette, C4-2B cellene sådd sparsomt på BMSC viste en økning i celleantall etter 7 dager (S1 Fig). For å visuelt påvise sammenhengen mellom tumor celle-celle kontakt og spredning, utvidet vi studien til fem LuCaP linjer for immunofluorescent deteksjon. Etter 14 dager i kultur, ble ingen positiv Ki67 farging påvist i NG celler som ble tynt sådd uten tumor celle-celle kontakt (figur 1C, øvre panel). I samsvar med den trypan blå eksklusjon analysen ble positiv Ki67-farging observert i G-celler som var tett seeded og viste celle-celle kontakt, noe som tyder på at tumorcelle-celle-kontakt ble assosiert med celleproliferering (figur 1C, nedre panel).
A) En ordning som viser
in vitro
kultur betingelse for ikke vokser (NG) og økende (G) LuCaP PDX celler på BMSC. LuCaP celler ble sådd ut tynt på 50 celler /cm
2 eller tett ved 50.000 celler /cm
2 på et konfluent lag av BMSC (50.000 celler /cm
2) forbehandlet med 10 ug /ml mitomycin C til hemme BMSC celledeling. B) LuCaP celler seeded tett på BMSC ble kvantifisert ved positiv EpCAM flekker på dag 3, 7 og 14 etter seeding. C) LuCaP celler (86,2, 92, 93, 96 og 141) ble sådd tynt (øvre panel, NG) eller tettest (nedre panel; G) på BMSC. Etter 14 dager ble cellene fiksert med iskald metanol og fluorescens-farget med Ki67 å vurdere spredning. Green, EpCAM; Rød, Ki67; Blå, DAPI. Hvit pil: tynt seeded celler som viser negativ Ki67 flekker etter 14 dager. Forstørrelse: 200x. Skala: 50 mikrometer. Forsøkene ble gjentatt 2-3 ganger og grafer som viser gjennomsnitt ± SEM eller representative bildene ble vist.
P1 inte aktivitet forbinder med LuCaP PDX celleproliferasjon
in vitro
Når direkte celle-celle-kontakt oppstår, ble griner rapportert å bli aktivert som resulterer i cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon [33]. Vi undersøkte derfor i LuCaP PDX celler enten β
1 inte clustering ble aktivert i respons til celle-celle kontakt. I LuCaP 86,2, 92 og 93, når sådd tett på et monolag av BMSC, prolifererende G cellene viste gruppering av β
1 inte, mens de ikke-prolifererende NG celler sådd tynt ikke vise gruppering av β
en inte (fig 2).
LuCaP 86,2, 92 og 93 ble dissosiert og dyrket på en konfluent monolag av BMSC. β
1 inte immunfluorescens farging avslørt inte clustering (røde klynger og fremhevet av hvit pil) i tett seeded celler som vokste (G). Dette clustering ble ikke påvist i spredt seeded, nonproliferative celler (ikke vokser, NG). Green, EpCAM; Rød, β1 inte; Blå, DAPI. Forstørrelse: 200x. Skala: 20 mikrometer
Gene uttrykk analyse viste nedregulering av TGFB2 i voksende celler
Deretter gjennomførte vi microarray analyse av genuttrykk å avgrense mekanismene bak aktivering av β
1 integrin og celleproliferasjon. Totalt 238 gener (SAM scorer ≥2 eller ≤-2, p 0,05) ble uttrykt forskjellig mellom sovende /ikke vokser (NG) og prolifererende /voksende (G) celler i LuCaP 86,2, 92 og 93 (figur 3A) . Vi observerte at cellulær bevegelse var toppen molekylær og cellulær funksjon endres (figur 3B, p 0,05) og en redusert aktivering ble spådd (Fig 3C, z-poeng -2,4) i G i forhold til NG celler. Interessant, oppfinnsomhet hovedbane Analyse identifiserte en topp regulator effektor nettverk for de gener som er involvert i redusert aktivering av cellulær bevegelse, og viste at endotelin 1 (EDN1) var det vanlig oppstrøms regulatoren for nedregulering av CDC42, FN1, og FOSL1, noe som resulterte i redusert celle bevegelse (figur 3C og 3D). Til tross EDN1 bli identifisert som den øverste felles oppstrøms regulator for redusert cellulær bevegelse i G i forhold til NG celler, microarray uttrykk analyse viste at det ikke ble vesentlig endret i G i forhold til NG celler (1,2 ganger oppregulering i G celler med en SAM poengsum 0.2, ikke data vist). Siden
FOSL1
har et svært lavt endogent nivå, derfor har vi fokusert på å validere
CDC42 Hotell og
FN1
med real-time qPCR og fant at både gener ble nedregulert i G celler i to av de tre LuCaP PDX linjene som ble testet (fig 3E). Videre er TGFβ2 en kjent nedstrøms effektor av β
1 inte og oppregulering av
TGFB2
uttrykket har blitt rapportert å være assosiert med migrasjon og kreft dvalen [34, 35], vi undersøkt og funnet ut at
TGFB2
uttrykk ble konsekvent nedregulert i G i forhold til NG celler i alle tre LuCaP PDX linjer ved sanntid qPCR (figur 3E). I klinisk avledet DTC isolert fra benmargen, validert vi at
FN1 product: (p 0,01, fra genekspresjon datasett GSE48995, [26]) og
TGFB2 product: [35] ble oppregulert hos pasienter uten noe tegn på sykdom sammenlignet med pasienter med aktiv PCa metastase, mens ingen signifikant genekspresjon endring for
CDC42 plakater (p = 0,67) ble påvist mellom de to gruppene av DTC (data ikke vist).
A) Varme kartet hierarkisk gruppert differensial genuttrykk i NG og G LuCaP PDX celler. Green, downregulated; rød, oppregulert. B) Oppfinnsomhet pathway analyse som viser cellulær bevegelse var toppen molekylær og cellulær funksjon endres mellom NG og G celler. C) Liste over åtte gener som er involvert i redusert aktivering av cellulær bevegelse i G i forhold til NG-celler. D) EDN1 ble spådd å være den øverste regulator som påvirket celle bevegelse via nedregulering av FN1, CDC42, og FOSL1. E) Kvantitativ real-time PCR viste en nedregulering av FN1, CDC42 og TGFb2 i voksende LuCaP linjer. Data ble normalisert til nivåer av husholdningsgenet RPS15. NG: ikke vokser; G:. Voksende
Aktivering av MLCK fremmet PCa PDX celler spredning via CDK6 i fravær av BMSC
myosinlettkjedefosfatase kinase (MLCK) er en vanlig effektor for β
en inte, CDC42 og TGFβ2 og dens aktivisering har vært innblandet i celleproliferasjon [36-38]. For å avgjøre om aktivering av MLCK er involvert i LuCaP PDX celleproliferasjon, vi viralt omformet en konstitutivt aktiv form for MLCK (A-TMK) i LuCaP PDX celler. A-TMK transduksjon i LuCaP 86,2, 92, og 93 celler som normalt ikke sprer resulterte i celle clustering og positiv Ki-67 uttrykk, mens celler transduced med en tom vektor ikke viste celle clustering eller positiv Ki67 farging (Fig 4A). Genekspresjonsanalyser fokus på cellesyklus regulatorer vist at A-TMK-transduced LuCaP celler uttrykt oppregulert nivå av cyclin-avhengig kinase 6 (CDK6, 3-22 ganger) og en samtidig downregulated nivå av E2F transkripsjonsfaktor 4 (E2F4, fire til 6 fold fig. 4B)
A) LuCaP celler ble infisert med lentivirus som inneholder A-TMK (konstitutivt aktivere MLCK) viste positiv Ki67 flekker, mens celler transduced med en tom vektor ikke. B) I LuCaP 86,2, 92, og 93, ektopisk ekspresjon av A-TMK indusert en oppregulering av CDK6 og en samtidig nedregulering av E2F4 når sammenlignet med de tomme vektor-transduserte celler. Hemming av MLCK med MLCK inhibitor ML-7 trykt spredning av C) avskaffe Ki67 uttrykk, D) redusere celleviabilitet vurdert av WST-1-analysen og E) downregulating CDK6 uttrykk. E2F4 uttrykk ble ikke endret ved ML-7. Green, EpCAM; Rød, Ki67; Blå, DAPI. Forstørrelse: 200x. Skala: 20 mikrometer. ** P 0,01 sammenlignet med DMSO kontroll. CDK6: cyklin-avhengig kinase 6; E2F4: E2F transkripsjonsfaktor 4.
For å validere involvering av MLCK aktivering i celleproliferasjon, hemmet vi MLCK i C4-2B celler som lett sprer
in vitro
i et forsøk på å hemme celleproliferasjon. Ved MLCK hemming av MLCK inhibitor ML-7, ble C4-2B celleproliferasjon redusert som gjenspeiles av tap av Ki67 farging (fig 4C), nedgangen i WST-1 absorbans (Fig 4D), og arrestasjonen av celler i G1 fase (S2 fig). I tillegg, ble reduksjonen i celleformering ledsaget av en 4,9-gangers nedregulering in CDK6 mRNA ekspresjon i C4-2B celler behandlet med ML-7 (p = 0,007). Uttrykket av E2F4, men viste ikke en signifikant oppregulering i C4-2B celler (figur 4E). Samlet viser resultatene at det aktivering av MLCK spilt en rolle i å stimulere cellevekst som er assosiert med en oppregulering av CDK6.
Overuttrykte av CDK6 letter spredning av LuCaP xenografter
in vitro
for å validere oppregulering av CDK6 fremmet LuCaP PDX celleproliferasjon, infisert vi LuCaP 86,2, 92, og 93 celler med lentivirus inneholder konstitutivt aktiv CDK6 vektor og undersøkt spredning. LuCaP 86,2, 92, og 93 celler som normalt ikke proliferere i fravær av BMSC, men ektopisk ekspresjon av CDK6 fremmet celleproliferering som vist ved den positive Ki67-farging (figur 5).
LuCaP 86,2, 92 og 93 celler ble lentivirally omformet til overuttrykker CDK6 og kultivert
in vitro
å vurdere spredning. Positive Ki67 indikerte at CDK6 overekspresjon lettes proliferasjon i disse cellene. Green, EpCAM; Rød, Ki67; Blå, DAPI. Forstørrelse: 200x. Skala: 20 mikrometer
Diskusjoner
PCA celler kan forbli sovende /sovende i mange år, og sprer å danne aktive metastaser på fjerne områder.. Lite er kjent for å date om mekanismene bak induksjon og frigjøring fra dvalen i PCA celler som bor i benmargen. Store årsaker kan mangelen på pasientprøver og relevant menneskelig
in vitro Hotell og
in vivo
modeller. Vi har tidligere rapportert en potensiell uvirksom signatur forbundet med DTC isolert fra PCA-pasienter uten tegn på sykdom [30]. Her, i stedet for ved hjelp av udødeliggjorte PCA-cellelinjer som lett sprer
in vitro
, brukte klinisk relevante PDX-celler for å undersøke mekanismen som ligger bak direkte celle-celle-interaksjon for å gjenopprette celleproliferasjon. Vi karakterisert tre LuCaP PCA PDXs som befinner seg på det humane benmarg stroma, som vist hvilende /sovende og prolifererende fenotyper, avhengig av celletetthet såing. Våre resultater viser at tumor celle-celle kontakt indusert celleproliferasjon som kan representere dvalen rømning via aktivering av β
1 inte forbundet med universell nedregulering av TGFB2 signalering og oppregulering av MLCK aktivering /CDK6 ved PCA PDXs.
Nyere studier i andre faste tumorer, for eksempel i hodet, nakke, bryst og har implisert elementer av cytoskeletal migrering og adhesjon maskineri i aktiveringen av lat tumorceller [4-7, 38-41]. β
1 Inte er kritisk for initiering av tumorigenese og opprettholdelse av den proliferative kapasiteten til tumorer [33, 41]. I PCa, har vi funnet at celle-celle-kontakt, både mellom tumorceller og med en underliggende stroma, var assosiert med aktiveringen av β
1 integrin og var vesentlig for å lette veksten av hvilende PCA-xenograft-celler
in vitro
. Selv om celle-celle-kontakt har til vår kjennskap ikke blitt direkte rapportert som et krav til uvirksom frigivelse, har flere mekanismer som er knyttet til migrering og adhesjon av tumorceller blitt implisert i denne prosessen. Nærmere bestemt, aktivering av α
5β
1 integrin er blitt vist å frigi humane plateepitel carcinom og brystkreftceller fra uvirksom [6, 7, 39, 41], og aktivering av α
5 β
1 integrin indusere celle adhesjon og migrering [42, 43] samt spredning av ekstracellulær matriks [44]. Dermed er det ikke overraskende at gitt en mulighet til å komme i kontakt innenfor mikromiljøet i benmargen, disse normalt hvil LuCaP PDX cellene begynner å spre seg
in vitro
.
Aktivering av β
en inte har vist seg å indusere nedregulering av TGF β2 og Cdc42 [45, 46]. Global genekspresjon analyse på reaktivert celler kontra sovende celler markert en nedgang i TGF β2 signal i prolifererende PCa PDX celler som var forenlig med den observasjon at TGF β2 indusert dvalen av ondartet DTC i hode og hals plateepitelkarsinom [47]. Dette er i samsvar med data fra klinisk avledet DTC som
TGFB2
uttrykk er høyere i PCA pasienter uten tegn på sykdom sammenlignet med pasienter med avansert sykdom [35]. Videre Cdc42 ble implisert i aktivering av p38 og vekstarrest i-kreft [7] og ble nedregulert i prolifererende PCa PDX-celler i denne studien. Av notatet, er MLCK en velkjent nedstrøms effektor av adhesion- og motilitet-medierte mekanismer, inkludert β
1 inte [9, 10, 38, 40], og dens aktivisering har vært knyttet til celle overlevelse [40]. I vår studie, den nedregulering av CDC42 og TGFB2 pekte på en mulig aktivering av MLCK fører til celledeling. Faktisk, innføring av konstitutivt aktiv MLCK alene var tilstrekkelig til å indusere spredning i LuCaP PDX celler som normalt beholde sovende
in vitro
. Omvendt C4-2B celler, som lett sprer
in vitro
, ble veksten dempes ved behandling med MLCK hemming ML-7. Disse data korrelerte godt med en tidligere studie av Barkan og kolleger som viste quiescence
in vitro Hotell og hemming av metastatisk utvekst av ulike brystkreft cellelinjer ved hemming av MLCK [38].
I studien, aktivering av MLCK resulterte i en oppregulering av CDK6 i alle tre LuCaP PDX linjer. CDK-6 forbinder med cyklin D1 til overgangen celler gjennom G1 fasen av cellesyklusen [48] og er regulert av androgenreseptoren (AR) [49].
