Abstract
ERG, et medlem av ETS transkripsjonsfaktor familie, er ofte overuttrykt i prostatakreft som et resultat av sin fusjon til androgen-responsive Tmprss2 genet. Ulike genomiske rearrangements og alternativ spleising arrangementer rundt krysset regionen føre til flere kombinasjon av Tmprss2: ERG fusion transkripsjoner som korrelerer med forskjellig tumor aggressivitet, men deres spesifikke funksjoner og biologiske aktiviteter er fortsatt uklart. Kompleksiteten i ERG uttrykk mønster er forsterket ved bruk av alternative arrangører, spleiseseter, polyadenyleringsseter og oversettelse initiering områder i både innfødte og fusion sammenhenger. Vår systematisk karakterisering av innfødte ERG og Tmprss2: ERG varianter avslører at deres ulike onkogene potensial er påvirket av status for Ets domene og konfigurasjonen av 5 «UTR regionen. Spesielt uttrykk og aktivitet av funksjonell ERG og Tmprss2: ERG varianter er påvirket både av oversettelsesinnvielses signaler innen de ulike isoformer og ved hemmende oppstrøms åpne leserammer (uORF) i sine 5 «UTR. Stabil uttrykk for ERG og Tmprss2: ERG varianter fremmet celle migrasjon /invasjon, induserte en blokk med spredning og induserte en senescence lignende tilstand, noe som tyder på en rolle for disse variantene i prostata tumorigenesis prosessen. I tillegg til Tmprss2: ERG fusjonsprodukter, er en gruppe av relaterte innfødte ERG isoformer også høyt over-uttrykt i fusjonsførende prostatakreft, og har samme oversettelse initiering hotellet (i ERG exon 4) med den ofte observert Tmprss2 exon1 sluttet å ERG exon 4 (T1: E4) fusion-avledet variant. Bruk av dette ATG kan være fortrinnsvis nedregulert ved rettede antisense-baserte forbindelser, eventuelt som representerer basis av en målrettet tilnærming som skiller mellom tumor-assosiert og normal ERG
relasjon:. Zammarchi F, G Boutsalis, Cartegni L (2013) 5 «UTR Kontroll av Native ERG og Tmprss2: ERG Varianter aktivitet i prostatakreft. PLoS ONE 8 (3): e49721. doi: 10,1371 /journal.pone.0049721
Redaktør: Bin Tian, UMDNJ-New Jersey Medical School, USA
mottatt: 27 juli 2012; Godkjent: 19 september 2012; Publisert: 05.03.2013
Copyright: © 2013 Zammarchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Work var støttet av DOD tilskuddet PC081477. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
translokasjon er godt etablert viktige hendelser i utviklingen av hematologiske maligniteter og sarkomer [1]. Identifiseringen av tilbakevendende trans mellom androgen-responsive Tmprss2 genet og medlemmer av Ets familien av transkripsjonsfaktorer i prostatakreft (PCA) har endret panorama av PCa biologi [2].
Mer enn 80% av PCa prøvene havn onkogene fusjoner, vanligvis involverer 5′-regionen til Tmprss2 locus (med sin promoter) sammenføyd med åpen leseramme (ORF) til forskjellige Ets gener [3], selv om andre kombinasjoner er blitt beskrevet [4], [5] , [6]. Den mest vanlige omorganisering, Tmprss2 exon1 sluttet å ERG ekson 4 (T1: E4, eller variant III) er til stede i -50% av PCA tilfellene [3]
ETS Genfusjonene spille en rolle i overgangen. fra prostata intraepitelial neoplasi (PIN) til adenokarsinom og er forbundet til aggressive lesjoner og dårlig prognose [7], [8], [9], [10], [11]. Overekspresjon av ERG i prostata cellelinjer aktiverer celle invasjon programmer og resultater i utviklingen av PIN-koder i mus, men kan ikke kjøre kreft [5], [8], [10], [12], som samarbeidet med separate genetiske skader, for eksempel PTEN tap, er nødvendig for å utløse progresjon til langt fremskreden sykdom [7], [13], [14].
Flere varianter av den normale ERG-gen-produktet er beskrevet, som følge av en kombinasjon av alternativ spleising, polyadenylering og transkripsjonsstart [15], [16], [17], [18]. Detaljene i genomiske rearrangements også innføre betydelig strukturell heterogenitet i 5 «regionen. I tillegg til den vanlige T1: E4-transkript, Tmprss2 eksoner 1, 2 og 3 kan kombineres med ERG-eksoner 2, 3, 4, 5 og 6 i forskjellige alternative spleise mønstre som kan generere i det minste 17 distinkte Tmprss2: ERG transkripter [2- ], [19], [20], [21]. Disse kan fungere som markører for sykdomsprogresjon og relatere til aggressivitet av svulstene [8], [9], [19]. Spesielt T2: E4 variant (Tmprss2-exon2: ERG-exon4 eller variant VI), hvor den opprinnelige ATG i Tmprss2 exon 2 er i ramme med ERG ORF, assosiert med patologiske og kliniske sidene ved aggressiv sykdom [19] .
mekanistisk grunnlag for de forskjellige onkogene potensialet av fusjons isoformer er ikke klarlagt, og den kan være relatert til iboende forskjeller i de N-terminale regioner eller til effekt (e) at variasjonen i fem «regionen av mRNA kan ha på RNA stabilitet eller uttrykk.
for å teste denne hypotesen, vurderes det å bruke 3 alternative arrangører, 2 felles alternativ spleising hendelsene og 3 polyadenyleringsseter (PAS) i normalt vev i forhold til Tmprss2: ERG-uttrykke prostatakreft. Disse uavhengig regulert hendelser kombineres for å generere 30 «viktigste» innfødte isoformer, noen som vi funnet for å bli også svært overuttrykt i svulster. Karakteriseringen av translasjons-initierings-områder som brukes av de mest vanlige innfødte ERG og fusjons varianter viser at den spesifikke organiseringen av 5′-UTR-regionen er en av de viktigste faktorer som bestemmer deres biologiske aktivitet og identifiserer et ATG i exon 4 som en antatt mål for antisense-baserte oversettelses hemming i prostatakreft.
diskusjon
Oppbygging av ERG Gene
Flere innfødte ERG isoformer kan oppstå
Resultater og på grunn av en kombinasjon av alternative arrangører, skjøting og polyadenylering. Disse isoformer kan i sin tur kombineres med Tmprss2 og andre 5 «partnere for å fremstille en rekke ERG-avledede varianter, med variable prognostiske verdier [8], [9], [19]. For bedre å forstå virksomheten i ERG-avledet onkogene produkter, søkte vi å først avklare ERG genet struktur og å karakterisere dens uttrykk mønster.
Det er betydelige uoverensstemmelser i den publiserte ERG nomenklatur, med minst fire forskjellige klassifisering ordninger, med de åpenbare konsekvens av å generere forvirring i å forstå og å sammenligne data fra forskjellige studier (for eksempel: den store terminal eksonet som inneholder Ets og transaktivering domener er variabelt referert til som exon 11 [2], [22], 12 [3] , 16 [18], [23], 17 [24]).
Vi rapporterer i figur 1A et up-to-date riss av exon-intron struktur av ~300 Kb ERG locus (ENSG000000157554) og foreslå en enhetlig, rasjonell nomenklatur av RNA og proteinvarianter som tar sikte på å innlemme de mest etablerte konvensjoner. Strukturen er hovedsakelig basert på de 11 eksoner av Refseq oppføring NM_004449.4 (Uniprot oppføring P11308 for ERG2), og inkorporerer ekson nummereringen brukt i den forutgående Tomlins papiret [2], [22] første beskriver Tmprss2: ERG fusjon. Kort sagt, har vi opprettholdt som «exon 4» den 218nt exon som er hovedsamarbeidspartner for Tmprss2 og som «ekson 11″ den store 3897nt ekson koding av Ets domene; vi kalt Exon 1a, 1b, 1c de tre gjensidig utelukkende «første» eksoner følge de tre godkjente arrangører P
A, P
B og P
C. For å sikre rasjonell inkludering av flere eksoner som kunne ha blitt avdekket i fremtiden, utmerker vi av bokstavene de alternative eksoner ikke er en del av de 11 referanse seg. For eksempel, den 72 nt alternativ ekson inkludert mellom eksoner 7 og 8 er kalt «ekson 7b «
(A) Top:. Den ~300 Kb menneskelige ERG locus, trukket grovt å skalere. Omtrentintronstørrelsene er angitt, sammen med eksoner posisjon (barer). Rødt indikerer første eksoner, blå vanligste alternative seg og grå uvanlig seg. Midten: Exon struktur, med ekson størrelser på bunnen. Blå boksene viser de viktigste predikerte ORF, hvite bokser de uoversatt regioner og grå uvanlige eksoner. Røde sirkler angir polyA nettsteder. Bunn: innretting av eksonene som danner hoved ORF (ERG-1b) med protein domener. Tallene angir størrelser på aminosyrer. PNT = spisse domene, AD = alternativ domene, Ets = Ets domene, TAD = trans domene. Asterisk og sirkelen indikerer posisjonen til den første og andre ATG. (B) Menneskelig ERG hovedvarianter. Justering av eksoner som utgjør de 30 viktigste RNA varianter av menneskelig ERG. Blå indikerer ORF, lyseblå ekstra regionen fra ATG i ekson 3. For hver variant, er det foreslåtte navnet indikert ved siden forrige nomenklatur (hvis tilgjengelig). Den foreslåtte protein navn er rapportert langs spådd størrelse i aa og kd. Varianter som stammer fra den alternative bruken av arrangøren 1a og 1b er paret som de fører til relaterte mRNA og identiske proteiner
Vi identifiserte de viktigste alternative regulerings hendelser som genererer majoriteten av ERG variasjon. 3 alternativ arrangører (P
A, P
B og P
C); to vanlige alternative spleise hendelser (inkludering /Hoppetau av exon 4 eller 7b); tre separate polyA signaler (PAS 7bpA, 11LpA og 12pA). Kombi bruken av alternative arrangementer genererer 30 mulige «store» ERG transkripsjon varianter (figur 1B), som kan kode 15 forskjellige spådd ERG-relaterte polypeptider, med 3 forskjellige N-terminaler, 3 forskjellige C-terminaler og en mulig intern variasjon (inklusjons eller hopper av 24 aa i den alternative domene kodet for av Exon 7b).
i tillegg til den 30 «store» variantene som er beskrevet i figur 1, en mengde av «mindre» isoformer har blitt rapportert i litteraturen, eller er presentere i databaser. Listen inkluderer varianter som viser hoppe av eksoner 2, 5, 7 og 8; bruk av en proksimal (Short) polyA nettstedet i ekson 11 (11SpA) eller av en ekstra intronic en nedstrøms ekson 8 (8PA); og inkluderingen av supplerende alternative eksoner 7c, 10b og av flere alternative exoner avledet fra intron 3 (eksoner 3b-H), angitt i grått i figur 1A. Isoformer ERG4, ERG6 og ERG9 fra forrige Owczarek studie [18] er mindre varianter og er omklassifisert i denne gruppen.
Siden noen av disse ekstra mindre hendelser kan kombinere selvstendig med alle strukturelt kompatible store isoformene, hundrevis av varianter kan potensielt bli generert. Men disse hendelsene ser ut til å forekomme sporadisk, og deres fysiologiske betydningen er ukjent
ERG Expression: a. Kreft-assosiert Bryter i Arrangøren Usage
Vi setter ut for å undersøke bruk av arrangører, PAS eller spleisesignaler ved qPCR-analyse av ERG ekspresjon i forskjellige normale vev, tumorer og cellelinjer (figur 2). Selv om en viss grad av vev til vev variabilitet er observert (Fig. S1A), generelt promoter P
C (gjennomsnittlig A C (t) = 10,2) synes å være den mest aktive i normalt vev (inkludert i prostata), -25-fold og ~ 10 ganger mer aktiv i gjennomsnitt enn promotorene P
A (A C (t) = 14,9) og P
B (A C (t) = 13,4), henholdsvis (figur 2A). På den annen side, i et panel på 8 primær PCA prøver som uttrykker Tmprss2-ERG-fusjoner, promotor P
B (middel A C (t) = 5,4) står for hoveddelen av nativt ERG transkripsjon og er til stede på nivåer sammenlignbare med dem av fusjons selv (A C (t) = 6), over 100 ganger mer rikelig enn de samme transkriptet i normal prostata (A C (t) = 12,8) (figur 2B og S1A fig.). Faktisk, i flere Tmprss2: ERG førende prøver de innfødte P
B promoter, snarere enn fusjonsgenet, er den viktigste kilden til ERG transkripsjon (Fig S1B.). Sammenlignet med normal prostata, promotorene P
A (A C (t) = 9) og P
C (A C (t) = 8) også er aktivert, men ikke til den grad på P
B. I PCA-cellelinjer, p
B er den eneste aktive opprinnelige ERG-promotoren, med ikke målbare signaler fra P
A eller P
C (figur 2C). To av de testede cellelinjer, PCA VCap og NCI-H660, uttrykker Tmprss2: ERG fusjon (figur 2C, komp symboler), som i stedet er fraværende i PCA-cellelinjer som ikke inneholder den Tmprss2: ERG fusion (LnCap, DU145, C4- 2, åpne symboler og fig. S1C). Som forventet ble det ikke uttrykk fra noen av de innfødte arrangører observert i NCI-H660 cellelinje, som bærer fusjon på begge alleler og mistet alle endogene arrangører [25].
Kvantifisering av qPCR av alternativ ERG varianter i normalt vev (A, D), primær PCA prøver (B, E) og PCA cellelinjer. (C, F). (A-C) Kvantifisering av promoter bruk. Primersett spesifikke for de 3 ulike ERG arrangører og for Tmprss2: ERG fusjon der brukes, sammen med en primer sett spenner eksoner 5-7 å kvantifisere total ERG. Normale vev ikke uttrykker fusjonsprodukt. Expression varianter 1a og 1c er nesten umulig å oppdage i PCA cellelinjer analysert. For panel C, åpne symboler indikerer LnCap, DU145 og c4-2 (ikke uttrykker Tmprss2: ERG fusion), fulle symboler angir VCap og NCI-H660 (uttrykker Tmprss2: ERG fusion). Se også fig. S1 A-C. (D-F) Kvantifisering av qPCR alternativ polyadenylation bruk. Primersett spesifikke for de 3 ulike polyA nettsteder der brukt, sammen med en primer sett å kvantifisere total ERG og ett sett for å kvantifisere total ekson 11 nivåer for å antyde 11SpA bruk. Se også fig. S1 D-F. I alle tilfeller, representerer hver angitt verdi gjennomsnitt av ≥3 uavhengige forsøk og er presentert som A C (t) normalisert til husholdningsgenet GAPDH derfor en «høy» A C (t) -verdien betyr lave nivåer av ekspresjon og en «lav» value betyr høy grad av ekspresjon. Horisontale linjer indikerer middelverdien. Stjernene indikerer at produktet ikke ble påvist i prøven, og ville derfor være tilsvarende en eksperimentell punkt ved toppen av bordet, men det er ikke reflektert av middelverdien.
Fra dette første sett av eksperimenter vi konkludere med at en promoter bryter skjer i PCA svulster og cellelinjer, og at økt bruk av innfødte arrangøren P
B er førsteamanuensis med (og muligens bidrar til) svulsten fenotype.
Overuttrykte ERG ved PCA ble tidligere beskrevet [23], men etter oppdagelsen av Tmprss2: ERG fusjon, har det vært typisk knyttes til denne hendelsen. Men våre funn at i tillegg til de fusion-avledet transkripsjoner, noen innfødte ERG varianter kan også være svært overuttrykt i PCA antyder en større rolle for native ERG ved PCA utvikling. Dette støttes av den observasjon at endogene musen
Erg
transkripsjoner er overexpressed i svulster fra prostata betinget
PTEN
– /-;
Trp53
– /- mus, sammenlignet med
PTEN
– /-;
Trp53
+ /+ mus [7]. Viktigere, mens den sistnevnte modell resulterer i en lat form av PCa, den tidligere frembringer en aggressiv fenotype [7].
differensial aktivering av de tre native promotorer i fusjonsførende PCA prøvene tyder på at denne avvikende ekspresjon er transcriptionally regulert. En interessant mulighet er at aktivering av det native p
B promoter kan drives direkte eller indirekte av ERG seg selv som en del av en positiv reguleringssløyfe. For eksempel ble flere antatte c-myc-responsive bestanddeler identifisert umiddelbart oppstrøms av ERG p
B-promotoren [18]. Siden c-Myc er en nøkkel nedstrøms mål av ERG [26], androgen-avhengig aktivering av ERG fra fusjon, eller en separat PTEN-avhengig Myc-aktivering [27] kan utløse et selvbærende ERG /Myc onkogene løkke, hvilken kan til slutt bli androgen-uavhengig. Faktisk, i overensstemmelse med denne modell, en mate fremover mekanisme hvor ekspresjonen av endogene ERG styres av overekspresjon av fusjonsprodukt er nylig blitt beskrevet [28]
ERG Expression:. Alternative polyadenylering og Splicing
Analogt til hva vi gjorde for å studere arrangørens bruk, så utforsket vi rollen som alternativ polyadenylation og spleising i uttrykket av ERG varianter. Av de tre hoved PAS beskrevet (figur 1), blir 11L-PA som er nødvendig for en fullstendig funksjonell ERG-protein, mens den PAS i intron 7b (7b-pA) og ekson 12 (12-pA) genererer C-terminalt trunkert ERG isoformer mangler Ets DNA-bindende domene og trans domene (TAD).
11L-pA PAS ble den mest brukte i normalt vev (gjennomsnitt, A C (t) = 10,8), ca 8 ganger mer enn 7b-pA (A C (t) = 13,8) og 50 ganger mer enn 12-pA (A C (t) = 16.6) (fig. 2D). Men i Tmprss2: ERG-uttrykke PCA prøver (A C (t) = 5,2), bruk av 7b-PA er sterkt aktivert, og blir omtrent like vanlig som den 11L-pA (A C (t) = 5,8) (figur 2E) . Det samme gjelder i PCA cellelinjer som uttrykker fusjon (figur 2F) tyder på at du bytter til dette mønsteret av uttrykket kan relatere til tumorprogresjon. Det er viktig å merke seg at mens denne varianten mangler Ets og TAD domener, det beholder dimerisasjon determinants, og dermed dets uttrykk kan påvirke aktivitet av andre helaftens varianter stede. En proksimal PAS i exon 11 (11S-pA) [15], [18] ble indirekte bedømt ved å sammenligne qPCR av områder på hver side av det (E11 og 11L-PA), og tilsvarende nivåer av ekspresjon ble observert, noe som tyder på at bruken av 11S-pA er marginal under de fleste normale og patologiske tilstander (figur 2D-F og figur S1D-F)
Siden alternative spleisevarianter kan påvirke ERG eller Tmprss2. ERG fusion funksjoner [24], analyserte vi regionene rundt ekson 7b og exon 4 i normale vev, PCA prøver og cellelinjer ved semi-kvantitativ PCR. Begge alternativ spleising hendelsene var mulig å påvise, med en klar utbredelsen av ekson 4 og ekson 7b inkluderings varianter. Vi har imidlertid ikke observere noen betydelig berikelse i den relative mengden av enten spleisevarianter i PCA prøver, noe som tyder på at modulering av disse to spesifikke spleise hendelser ikke kan spille en avgjørende rolle ved PCA.
Til sammen disse data tyder på at full-lengde produkter, som inneholder ekson 7b og Ets og TAD domener, er de mest tallrike ERG varianter uavhengig av status for oppstrøms regioner, både i normale vev og svulster. Den sterke økningen av den avkortede TE: 7bpA isoform forhold til full-lengde variant kan bare reflektere endringer i spleise /polyadenylation maskiner av kreftceller, men det kan også indikere sin (ennå uutforsket) rolle i ERG biologi i svulster
N-terminal heterogenitet av ERG isoformer
for å vurdere om den beskrevne heterogenitet i 5 «regionen påvirke ERG uttrykk og aktivitet, vi sub-klonet den innfødte varianter ERG-1a, ERG-1b, ERG 1C, ERG-1b.Δ4, ERG-1c.Δ4, og den felles fusjons variant T1: E4, med sine komplette 5 «UTR og med ekson 7b inkludert (figur 3A.). Ved transient transfeksjon i HeLa-celler, ERG-1c cDNA effektivt uttrykte det forventede 54 produkt kd (fig. 3B, spor 4). Tvert imot, ekspresjonen av de native ERG-1a og 1b ERG-variantene var ineffektiv, noe som resulterer i peptider som er mindre enn den ~55 KDa forventes hvis den første i leseramme ATG i exon 3 ble anvendt (Fig. 3B, kolonnene 2-3 ). Interessant, dette peptid ko-migrerte med den som genereres av den transiente over ekspresjon av T1: E4 fusion variant, ved ~ 50 kd (felt 5). Ytterligere variasjon i den N-terminale region stammer fra ekson 4 hopper over, som endrer ERG hoved ORF slik at de forutsagte utgangs ATGs i ekson 1c eller exon 3 ikke ville være i stand til å generere en ERG-relatert peptid (figur 3A). Transient overekspresjon av ERG-1b.Δ4 eller ERG-1c.Δ4 både resulterte i ERG-beslektede peptider som migrerer ved ~44 KDa, i samsvar med bruken av en i-ramme M5 ATG i exon 5 (figur 3B, kolonnene 7,9) . Dette er mest tydelig når man bruker ERG antistoff C-17, som lett gjenkjenner rekombinant ERG, men ikke de endogene proteiner. En annen ERG antistoff (C-20) fortrinnsvis gjenkjenner en endogen bånd tilsvar i størrelse til ERGΔ4 (baner 1-5), gjør bytte til M5 bruk vanskeligere å oppdage.
(A) N-terminal heterogenitet i menneskelige innfødte ERG varianter. De 5 «regionene for de angitte varianter er gjengitt. Bokser representerer eksoner med ORF i blått. Red flått under eksoner indikerer i-frame ATGs i eksoner 1c og eksoner 3 til 5. out-of-frame produkter forårsaket av ekson hoppe fra den ellers i ramme ATGs er angitt i rødt. (B) Western Blot (WB) av forbigående uttrykk av variantene i HeLa-celler. Antistoff C20 gjenkjenner eksogent protein og en endogen band på ~44 kd tilsvarende i størrelse til Δ4 varianter. Antistoff C17 fortrinnsvis gjenkjenner eksogene ERG band. (C) Mutasjoner som uavhengig eliminere 3 i-ramme ATGs i ekson 4 ble innført i cDNA av T1: E4 og analysert som ovenfor. (D) På lignende måte mutasjoner ble introdusert for å eliminere ATGs i ekson 3 (ERG-1b) eller i exon 1c (ERG-1c) alene eller i kombinasjon med mutasjoner i den første i leseramme ATG (M4A) i exon 4 (ERG-1b og ERG-1c)
Siden T1. E4 mangler den anslåtte innvielses kodon fra både Tmprss2 og ERG transkripsjoner, en alternativ indre ATG innenfra ERG åpen leseramme må brukes til å uttrykke en ERG-relaterte produkt fra fusjons mRNA, sannsynligvis fra ekson 4. for å identifisere T1: E4 startkodon, en serie av metionin-til-alanin punktmutasjoner ble samlet for de tre in-frame ATG-kodoner er tilstede i ERG ekson 4 ( fig. 3A). Mutasjon ved nukleotider 79 (M4A), men ikke 121 (M4B) og 184 (M4C) i exon 4 avskaffet T1: E4 uttrykket (figur 3C), noe som indikerer at fusjons transkripsjon benytter den første i ramme ATG for ekspresjon av ERG peptid .
For å kartlegge start ATGs fra de innfødte ERG isoformene lignende mutasjoner der også innført alene eller i kombinasjon i de første i-frame ATGs i ekson 3, 1c og 4 (figur 3D). Mutasjon av ATG i ekson 3 (M3) ikke hadde noen effekt på ekspresjonen av det ~ 50 kDa produkt (figur 3d, baner 2 vs 4), mens mutasjonen av det neste ATG i exon 4 (M4A) opphevet den både i vekt og M3 kontekst (figur 3D, sporene 3 og 5), som indikerer at ERG-1b (og ERG-1a) ikke bruker sin første i leseramme ATG, som ville forutsies ved en 5’cap avhengig skanning modell av oversettelse initiering [29]. I stedet bruk av følgende ATG i exon 4 genererer et peptid som er identisk med den som kodes av T1: E4 fusjon. Tvert imot, når startkodonet i ekson 1c er mutert (M1c), er ERG-1c mobilitet reduseres fra ~54 KDa til ~ 50 kDa (figur 3D, kolonnene 6 vs 8), som T1: E4 og ERG-1b (kolonne 1 og 2), i samsvar med en bryter til den M4A ATG. Faktisk mutasjon av denne ATG resultater i opphør av ~ 50 kDa produkt i favør av et fortsatt mindre produkt.
Biologisk karakterisering av ERG isoformer
For å vurdere om strukturelle N-terminal forskjeller mellom kreftassosiert ERG-1b /T 1: E4 og den normale ERG-1c påvirke egen deres biologiske aktivitet, vi innledningsvis stabilt uttrykt deres korresponderende cDNA’er i NIH-3T3-celler (figur 4A) og utvalgte kloner med sterk ekspresjon. Etter avtale med tidligere rapporter, observerte vi fremme celle invasjon og migrasjon av både ERG varianter, som analysert ved trans-vel migrasjon gjennom matrigel (figur 4B) og ripe såret analysen (figur 4C-D). Graden av virkningen på migrasjon /invasjon var sammenlignbare i ERG-1b og ERG-1c viser at de er like aktive, i det minste i noen grunnleggende aspekter av deres biologi.
(A) NIH-3T3-celler som stabilt uttrykker høyt nivå av ERG-1b og ERG-1c ble analysert som i figur 3. (B-C) Etter narkotika utvalg, ERG-overekspresjon kloner (1b og 1c), tom-vektorkontroll (pLPC) og ubehandlet NIH-3T3 -celler (NT) ble analysert for deres invasjon potensial ved hjelp av en matrigel invasjon assay (B), og i en standard sår ripe assay for å måle deres motilitet (C). (D) Kvantifisering av (C), ved hjelp av ImageJ programvare. Linjene indikerer standardavvik. (E) Vekstkurve av NIH-3T3-stabile kloner. Etter valg ble cellene fiksert ved 48 timers intervaller i løpet av en periode på 8 dager, og farget med krystallfiolett. (F) Etter medikamentseleksjon, NIH-3T3 stabile kloner ble platet og serum-sultet, og celledød ble målt ved hjelp av trypanblått-metoden. (G) 5 dager etter medikamentseleksjon NIH-3T3 stabile kloner ble farget for SA-β-galaktosidase. (H) Vekstkurve av IMR90-celler som stabilt uttrykker høyt nivå av ERG1b /T 1: E4 eller tom vektor. Etter medikamentseleksjon ble cellene fiksert ved 48 timers intervaller i løpet av en periode på 8 dager, og farget med krystallfiolett. (I) 5 dager etter medikamentseleksjon IMR90 stabile kloner ble farget for SA-β-galaktosidase. Røde piler indikerer bi-kjerneholdige celler. Representative bilder er vist i B, C, G og I.
Overraskende ekspresjon av ERG varianter i denne sammenheng førte til nedsatt cellulær proliferasjon (figur 4E). Dette var ikke assosiert med celledød. Tvert imot, ekspresjon av ERG-1b og spesielt ERG-1c resulterte i beskyttelse mot celledød følgende serum sult (figur 4F). Denne virkemåten kan reflektere aktivering av et onkogen-avhengig senescens lignende tilstand ved ERG uttrykk som tidligere er beskrevet for andre onkogener [30]. Faktisk ERG-uttrykke celler, men ikke kontroller, farget positivt for senescence biomarkør (beta) galaktosidase (figur 4G). Fascinert av disse resultatene vi senere stabilt overuttrykt ERG-1b /T1: E4 isoform og den tilsvarende tom vektor i normal human fibroblast cellelinje IMR90, en godt karakterisert cellemodellsystem for mobilnettet senescence. Som med NIH-3T3-celler, over-ekspresjon av ERG-1b /T 1: E4 isoform resulterte i øket cellemigrering og celle invasjon, (figur S2). Videre IMR90-celler overuttrykkende ERG-1b /T 1: E4 isoform viste senescence-lignende fenotyper som en inhibering av cellulær proliferasjon (figur 4H), akkumulering av bi-kjerneinneholdende celler og forhøyet SA-β-gal-aktivitet, et klassisk biomarkør av senescens (figur 4I).
Dette resultat er spesielt spennende i lys av det faktum at aldringsprosessen programmet blir aktivert når en celle har avfølt et kritisk nivå av skade eller dysfunksjon, som peker til en kritisk rolle for ERG -1b /T1: E4 overekspresjon som en innledende hendelse som fører til PCa. Videre er det viktig å merke seg at celle senescens kan oppdages på et tidlig stadium i humane PCA prøver og kan utløses av akutt tap av PTEN i et p53-avhengig måte i mus PCA-modell [31], som tyder på at ERG aktiveringen kan resultere i en innledende senescent fenotype som krever etterfølgende miljømessige eller genetiske endringer for å gå videre til malignitet.
ATG kontekst og uORFs påvirke ERG Oversettelse Effektivitet og funksjoner
effektivt oversatt eukaryote mRNA krever en optimal sammenheng rundt startkodonet, for å hjelpe til dens gjenkjennelse av ribosomet (Kozak sekvens: GCCRCCATGG) [32]. Dette er imidlertid ikke alltid tilstrekkelig for å forklare oversettelse effektivitet. For eksempel, selv om ERG-1 a /b og T1: E4 dele den samme ATG i exon 4 (M4A) for å initiere oversettelse, deres ekspresjonsnivåer er forskjellige (figur 3B kolonnene 2,3 og 5), noe som tyder på en rolle for deres ulike 5 « UTR. Faktisk, substitusjon av de naturlige 5 «UTR med en som inneholder en konsensus Kozak (figur 5A-B) førte til aktivering av ekspresjon fra M3 ATG i ERG-1b variant, med syntese av den tidligere antatt 55 kDa peptid (figur 5C baner 1-2). Dette bekrefter at elementer inne i 5 «UTR av ERG-1b hemme oversettelsen og det utelukker at den lave ERG-1b (M3) overflod skyldes en iboende ustabilitet av dets N-terminale domene.
( A) den opprinnelige 5 «UTR av ERG-1b, 1c og ERG-T1: E4 ble erstattet med en vanlig én fra ekspresjonsvektoren (oransje), og en optimalisert Kozak-sekvens. De erstattet ATGs er i ekson 3 (M3), 1c (M1c) og 4 (M4A) (B) Kontekst av flere i-frame ATG brukt som startkodonene i ulike ERG og Tmprss2: ERG varianter. Sekvensen rundt den ATG er justert til en konsensus Kozak-sekvens, med den viktige konserverte posisjonene -3 (R) og 4 (g) merket med rødt (telle A som 1). Sammenheng vurderes som «sterk» (S) hvis begge posisjoner er konservert, og «svak» (W) hvis de ikke er det. En utvidet analyse av ATGs i 5’UTR regionen ERG og Tmprss2: ERG er rapportert i tabell S1. (C) WB analyse av varianter og mutanter som er representert i (A). Forbedre M3 sammenheng favoriserer bruk på utgiftene til M4A ATG. (D) uORFs som kan påvirke oversettelse effektiviteten av ERG varianter i de 5 «UTR av ERG-1b og flere felles Tmprss2: ERG varianter. Røde flått indikere ATGs, boksene nedenfor viser den antatte uORF generert og deres omtrentlige lengden (tegning ikke i målestokk). Røde bokser indikerer sterke ATG sammenhenger og grønne svake (som definert i (B)). Flere detaljer om uORFs er oppført i tabell S1. (E) Effekt av uavhengig mutere uORFs «ATG i ERG-1b: mutasjon av den første ATG i ekson 2 utgivelser undertrykkelse av oversettelse og øker nivåene av ERG fra ATG i ekson 4. (F) Uttrykk for ERG og Tmprss2: ERG varianter . Full-lengde cDNA for variantene, inkludert deres hele 5 «UTR, ble uttrykt og lysatene fra forbigående transfekterte HeLa-celler ble analysert ved western blot.
Upstream åpne leserammer (uORFs) er vanligvis korte ORF at start i den 5 «UTR er ute av ramme med i hoved nedstrøms kodende sekvensen og kan redusere dets ekspresjon [33], [34]. Selv om ingen uORFs er til stede i ERG-1c eller i T1: E4, tre uORFs eksisterer i ERG-1b 5’UTR (figur 5D, øverst), som kan forstyrre anerkjennelse av den anslåtte ATG av ERG-1b (tabell S1) . Oppheving av den uORF starter på uM2a ved mutasjon av ATG til GCG ført til økt ERG-1b uttrykket (figur 5E, spor 2), som indikerer at inngrepet mellom skanning ribosomet ved den første oppstått ATG, for å generere en kort 29 aa uM2a peptid, er en begrensende faktor i ERG-1b ekspresjon fra nedstrøms ATG
tilstedeværelsen av uORFs kan også på lignende måte påvirke nivåene av ekspresjon av de forskjellige androgen-drevet Tmprss2:. ERG-fusjonsproteiner, og prognostisk implikasjon, siden 5 «heterogenitet i fusjon er assosiert med forskjellige kliniske resultater [19], [20]. De forskjellige patologiske profilene kan skyldes forandringer i biologisk aktivitet, avhengig av den primære proteinsekvens, eller til forskjeller i dens overflod,
via
modulering av oversettelse. Slike variasjoner kan forklare hvordan for eksempel T2: er E4 fusjon forbundet med en mer aggressiv fenotype [19], [20]
For å undersøke hvorvidt oversettelse effektivitet spiller en rolle i aktiviteten av fusjons varianter.
