Abstract
Innledning
Bio-repositories er uvurderlige ressurser for å gjennomføre translasjonell kreftforskning og kliniske programmer. De representerer en av de mest kraftige verktøy for biomolekylære studier av klinisk kommenterte kohorter, men høy kvalitet prøver er nødvendig for å generere pålitelige molekylære avlesninger og funksjonelle studier. Målet med studien var å definere virkningen av kreft vevsischemi tid på RNA og DNA-kvalitet, og for generering av pasient-avledet xenotransplantater (PDXs).
Metoder
Ett hundre trettifem lungekreftprøver ble valgt blant våre institusjonelle
biobank
prøver. Sammenhenger mellom ulike varm (kirurgisk) og kalde (ex-vivo) iskemi tidsintervaller og RNA kvalitet eller PDXs engraftment priser ble vurdert. RNA kvalitet ble bestemt av RNA integritet nummer (Rins) verdier. Ferske levedyktig vev fragmenter ble implantert subkutant i NSG mus og serielt transplantert
Resultater
RNA med en RIN . 7 ble påvist i 51% av utvalget (70/135), med verdier på RIN betydelig lavere (OR 0,08, P = 0,01) i prøver bevares i mer enn 3 timer før nedfrysing. Høyere kvalitet DNA-prøver hadde en samtidig høy RIN. Seksti-tre primære tumorer (41 adenokarsinom) ble implantert med en samlet engraftment rate på 33%. Både langvarig varme ( 2 timer) og ex-vivo iskemi tid ( 10 timer). Var forbundet til en lavere engraftment rate (OR 0,09 P = 0,01 og OR 0,04 P = 0,008, henholdsvis)
Konklusjon
RNA kvalitet og PDXs engraftment hastighet ble negativt påvirket av langvarig iskemi ganger. Riktig vev innsamling og behandling redusere strykprosent. Samlet sett representerer NSCLC biobanker en innovativ modalitet, som med hell kan utføres i rutinemessige kliniske settinger, når strenge Standard Operating Procedures er vedtatt
Citation. Guerrera F, Tabbò F, Bessone L, Maletta F, Gaudiano M, Ercole E, et al. (2016) The Influence of Tissue iskemitid på RNA Integrity og Pasient Avledet xenografter (PDX) engraftment Rate i en ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) Biobank. PLoS ONE 11 (1): e0145100. doi: 10,1371 /journal.pone.0145100
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, ITALIA
mottatt: 04.07.2015; Godkjent: 28 november 2015; Publisert: 05.01.2016
Copyright: © 2016 Guerrera et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall [1]. Ikke småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste undertype, og den kliniske-patologiske oppsetningen er regnet som gullstandarden for å definere pasientenes prognose. Ikke desto mindre er fortsatt problematisk korrekt definisjon av klinisk resultat i hver enkelt pasient [2]. Selv om det i det siste tiåret nye terapeutiske tilnærminger, inkludert molekylær terapi, har blitt introdusert, en omfattende molekylær-klinisk karakterisering for den enkelte fortsatt gjelder bare for en brøkdel av pasientene og begrenset til helseforsikring leverandør politikk. Til slutt, selv i de beste innstillingene, resultatene er fortsatt svært dystre.
Det er en overveldende enighet om at å fremme vår kliniske suksess, er helt nødvendig et detaljert kart over de patogenetiske mekanismene som driver lungekrefttilfellene. For å få pasienten spesifikke og omfattende fingeravtrykk integrering av flere analytiske modaliteter (f.eks genomisk, transcriptomic, proteomikk) og hensiktsmessige prøver (f.eks vevsprøver, plasma) [3] er påkrevd. Til syvende og sist er den kunnskap som vil dukke opp forventes å bli raskt oversatt til personlige behandlingsprotokoller. Offentlige bio-repositories av molekylært karakteriserte og klinisk kommenterte prøvene antas å representere et svært verdifullt verktøy for utforming og gjennomføring av nyskapende og mer vellykkede behandlinger.
Når bio-repository innsats er knyttet til pasient Avledet xenografter, sine verdier øker enormt. Faktisk PDX modellene representerer cutting edge i translasjonell forskning [4] og når tilknyttet Neste generasjons sekvensering (NGS) analyser gir en enestående verktøy. Siden frekvensen av PDX innpoding er knyttet til flere variabler, inkludert arten av tumorer, stadium av sykdommen og kvalitet av vev prøvetaking, er helt avgjørende for en hurtig vev anskaffelse og en korrekt behandling av ferske prøver.
Toward dette formål, overføring av kirurgiske prøver fra operasjonsstuen (OR) til kirurgisk patologi teater krever en skarp organisasjon, i stand til å gjennomføre strengere Standard Operating Procedure (SOP) innenfor et integrert tverrfaglig nettverk [5]. Siden en betimelig overføring begrenser ex-vivo iskemi tid, bør betydelig innsats være viet til å forbedre denne kritiske trinnet favoriserer den beste bevaring av de patologiske prøven. Vårt formål var å definere virkningen av kreft vevsischemi tid på kvaliteten av lungekreft prøver lagret i vår bio-depot og hvordan dette kan påvirke molekyl høy gjennomstrømming analyser og utvikling av nye prekliniske in vivo-modeller.
Her beskriver vi en protokoll for vev samlingen som forestiller den umiddelbare bevaring av de kirurgiske prøven ved hjelp av en vakuumtettende metode innenfor OR anlegget, etterfulgt av prøvetransport ved 4 ° C for å kirurgisk patologi.
Methods
A. Pasient Cohort Beskrivelse
Vi retrospektivt analysert lungekreft prøver innsamlet fra 135 pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon 2010-2012 med innledende kurativ hensikt. Pasienter som behandles med preoperative protokoller (
i
.
e
. Kjemoterapi, strålebehandling) ble inkludert. Innenfor biorepository matchet normalt lungevev, perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble serum og spyttprøver ervervet.
B. Informert Samtykke
En dedikert informert samtykke, om oppbevaring av humane prøver, ble generell bruk i forskning og molekylære analyser utviklet. Særlig vekt har blitt gitt til følgende problemer:
Formål med studien
Frivillig deltakelse
Innsamling av kliniske og demografiske data
Personvern og konfidensialitet
Fordeler og risiko for deltakelse
Re-kontakt for oppfølging informasjon og forskningsresultater tilbake
Tilbakekall av samtykke
Sekundær forskningsprosjekt
Prøve eierskap og intellektuell eiendom
Bio-prøver og bio-væske lagring
For hver pasient innrullert i biobanker protokollen, skriftlig informert samtykke ble samlet i preoperativ innstillingen av behandlende kirurg for Thoracic Surgery Institutt og pasienten ble registrert i Biobankregisteret. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board av Azienda Ospedaliera Universitaria, Citta «della Salute e della Scienza di Torino.
C.
spyttprøver Collection Protocol
ble samlet preoperativt med Oragene • DNA (OG-500) for langtidslagring. Blodprøver (10 cc) var perioperativt kjøpt i BD Vacutainer-rør (2 heparinisert og 2 ikke-heparinisert rør) og behandlet. PBMC, plasma og serum, ble høstet og lagret på riktig måte. Vevet bank laget ble varslet dagen før operasjonen.
Prøvene ble bevart og overført til patologi laboratorium ved hjelp av vakuumpakking og kjøling (VPAC) prosedyre [6, 7]. Kort, i OR, eksplantert kirurgiske prøver ble umiddelbart plassert i beta-ray sterilisert plastposer og vakuum-forseglet med TissueSAFE maskin (Mod VAC 10, av Milestone, Bergamo, Italia;. Www.milestonemedsrl.com), som standard prosedyre i vår institusjon [8]. Prøvene ble deretter bevart og brakt til patologilaboratorier, i kjølt (ved 4 ° C) plastboks, og videre lagret ved 4 ° C før behandling.
Rutine Histo-patologisk prosedyrer ble integrert med biobanker protokollen (S1 fig). Hver prøve ble orientert, målt, og er beskrevet, å være klar over at samlingen ikke vil påvirke den patologiske diagnose. Deretter ble tumormasser skåret ut og samplet. På samme tid, ble normalt lungevev tatt fra et fjerntliggende område affisert (fig S2). Vev fragmenter ble lagret i ulike medier: i oktober (Sukura Finetek, Torrance, CA) for frossent vev skjæring, RNA
senere
® Stabilisering Solution (Life Technologies) for RNA-ekstraksjon og hurtigfrosset og deretter oppbevares i -80 ° kjøleskap. Til slutt, ble små vevsfragmenter (2x2x2 mm) plassert i et frysemedium (59% RPMI, 30% FBS, 10% DMSO, 1% PEN-STREP) og deretter lagret i flytende nitrogen. Representative diagnostiske prøver gikk rutine histopatologiske behandlingsprosedyrer. Relaterte pasient informasjon (lagring og nedfrysing ganger og kliniske, demografi og histopatologiske data) ble lagret i Biobankregisteret.
D. DNA /RNA Utvinning og kvalitetsvurdering
Genomisk DNA ble ekstrahert med standard fenol-kloroform ekstraksjon metoden [9].
Vevsprøver ble homogenisert i TRIzol og RNA ble ekstrahert som for produsentens instruksjoner. For å eliminere en hvilken som helst genomisk DNA-forurensning når det er tilstede, ble RNA prøver underkastet deoksyribonuklease-behandling og ekstraheres på nytt ved hjelp av fenol-kloroform-metoden [10].
Det totale DNA og RNA ble kvantifisert med Nanodrop 2000c (Thermoscientific) instrument og absorbansen forholdstall på 260 nm /280 nm og 260 nm /230 nm ble registrert. Totalt RNA (1 mL) ble analysert i en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) ved hjelp av RNA Nano LabChips (Sylinder Technologies Corporation, Hopkinton, MA). RNA integritet nummer (RIN) verdier ble etablert som empiriske målinger av RNA integritet.
E. cDNA syntese og QRT-PCR
Total RNA ble revers-transkribert før real-time PCR forsterkning. 1 ng av total RNA ble behandlet med DNaseI rekombinant, RNase-fri (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og revers-transkribert ved hjelp av Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Invitrogen Life Technologies) ifølge produsentens instruksjoner. RT-qPCR ble utført med en termisk iCycler (Bio-Rad) ved hjelp av iQ SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR-sykling Betingelsene var som følger: 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 10 sekunder og 60 ° C eller 62 ° C i 30 sekunder. For å bekrefte spesifisiteten amplifikasjon ble PCR-produktene underkastet analyse av smeltekurve, linearitet, og hellingen av standardkurve ved bruk av CFX programvare (Bio-Rad). Alle PCR-analyser ble utført i tre eksemplarer
mRNA uttrykk nivåer ble evaluert i 3 forskjellige husholdningsgener:. GAPDH, ACTIN og HUPO. Primersett ble utformet ved hjelp Primer3 (S1 tabell).
F. Multipleks PCR
DNA integritet ble estimert ved en multipleks PCR med et sett av 5 par oligoprimers er utformet for å forsterke forskjellige DNA-mål (100, 200, 300, 400 og 600 bp) (S2 Table) [11]. Primere ble tilsatt i 1: 1: 1: 2-forhold for å oppnå PCR-produkter med lik intensitet etter agarose-gel-separasjon. DNA-amplifikasjon ble utført som følgende: preaktivering 7 min ved 95 ° C (1 syklus), etterfulgt av 40 sykluser: denaturering 45 sek ved 95 ° C, gløding 50 sek ved 60 ° C, forlengelse 1,30 minutter ved 72 ° C med endelig forlengelse syklusen i 15 min ved 72 ° C. PCR-produktene ble separert ved agarose gelelektroforese (2% agarose i TBE-buffer 1%).
G. Pasient Avledet xenografter (PDX)
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ (NSG) mus ble vennlig levert av L. Shultz fra The Jackson Laboratory og oppvokst i molekylær bioteknologi Senter (MBC) Animal Resource, under streng spesifikke og opportunistisk patogen gratis (SOPF) betingelser.
dyret protokoll for denne studien ble gjennomgått og godkjent av Animal Utvalget ved Universitetet i Torino.
Kort oppsummering PDXs ble etablert med ferske eller frosne patologisk vev fragmenter, bare når tilstrekkelig materiale var tilgjengelig for rutinemessige diagnostiske og molekylære analyser. Tumor-pode prøvene ble kuttet i flere 2x2x2 mm biter (flere deler /prøve) i fullstendig media. Seks til åtte uker gamle NSG ble først bedøvet (Rompun 0.05μl /g e Zoletil 1.6μg /g i.m.), og deres dorsale regionen ble sterilisert (70% etanol). En hud snitt (0,3 cm) ble senere gjort langs rygglinjen retronuchal regionen og en liten lomme ble skapt av stump disseksjon. Flere tumor-podede vev fragmenter (2-4) ble overført til hver enkelt subkutan lomme ved hjelp av butt-endete tang. De kuttet kantene ble forseglet med et enkelt metallklips. Musene ble regelmessig kontrollert før de ble våkenatt. Implantert dyr ble plassert i samme kjønn grupper. Implant vekst ble vurdert ved palpasjon og da kreves tumormasser ble høstet ( 1,5 cm
3). Mottaker dyrene ble kontrollert regelmessig og ofret på tidlige tegn på nød. Ved høsting, ble musene avlivet i et CO2 kammer og tumorgrafts ble samlet for histologisk vurdering, molekylære studier, re-pode, eller snap-frosset i flytende nitrogen.
H. Studie Resultater og statistiske analyser
Kategoriske data presenteres som antall (prosent,%), er kontinuerlige data presentert av deres median (interkvartilt område, IQR).
RIN ble beregnet i alle prøvene som surrogat for vev bevaring. En RIN av ≥7 ble satt som en cutoff å utføre RNA microarray uttrykk arrays og RNAseq analyser.
PDX engraftment ble ansett vellykket når tumormasser ble generert etter minst to passeringer og deres patologiske funksjoner ble bekreftet ved histologi og immunhistokjemi. Pearson chi-kvadrat test og Fishers eksakte test, når det er hensiktsmessig, ble brukt til å vurdere forskjellene i innpodet og ikke-innpodet grupper: tumor dimensjon, histologi, tumor gradering, patologisk TNM stadium, reseksjon status, tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) , tilstedeværelse av mikrovaskulær invasjon og kirurgisk varighet ble bestemt.
påvirkningen av vev iskemi ganger på RIN kvalitet og PDX engraftment suksess var de primære endepunktene i studien.
varm iskemi tid
var ment som den totale operasjonsvarighet og
ex-vivo (kald) iskemi tid
ble definert som tidsrommet mellom kjøpet av prøvene i den kirurgiske teater og tidspunktet for deres cryopreservation
Som andre endepunkt, vi evaluert RNA uttrykk nivåer og genomisk DNA integritet i en tilfeldig valgt undergruppe av prøver (
prøve
kommandoen i Stata). vi valgte 3 prøver med lav kvalitet RIN og tre med høy kvalitet RIN blant hver iskemitid klasser. Gene-uttrykk Resultatene ble evaluert som absolutte uttrykk i form av Kvantifisering sykluser (Cq mener). Forskjeller mellom gruppene ble undersøkt av Wilcoxon-Mann-Whitney test. Året for anskaffelser ble også analysert
For hensikten med forskningen vår, vi gruppert tilfeller i fire klasser i henhold til ex-vivo iskemi ganger:. ≤1 timer, 1-2 timer, 3-5 timer, 6 -9 timer og ≥10 timer.
Sammenhengen mellom RNA kvalitet (RIN av ≥7) eller PDX engraftment priser og individuated gruppene ble vurdert ved hjelp av logistisk regresjonsmodell. For å unngå mulige konfunderende påvirkninger, ble en justert multivariate logistisk regresjonsmodell inkludert følgende kirurgiske og patologiske variabler utført: histologiske undergrupper (adenokarsinom som referanse), tumor gradering (G1 som referanse), patologisk TNM stadium (stadium I som referanse) og kirurgi varighet (timer, som kontinuerlig).
Odds ratio (OR) og tilsvarende 95% konfidensintervall (95% cIS) ble gitt for hver modell. Alle statistiske analyser ble vurdert ved hjelp av Stata (versjon 12.1).
Resultater
A. Kliniske og patologisk Funksjoner
En totalt 135 lungekreft prøvene ble undersøkt. Tabell 1 oppsummerer sine kliniske, kirurgiske og patologiske egenskaper. Median alder ved kirurgi var 69 år (IQR 64-75), ble pasientene oftere menn (92, 68%) og røykere (106, 81%). Median kirurgisk varighet (IQR 1-3) og median ex-vivo iskemi tid (IQR 1-6) var begge av 2 timer. Median tumorstørrelse var 3 cm (IQR 2-5) og tumor patologisk TNM trinn var som følger: stadium IA 32 (23%) IB 13 (10%), IIA 21 (15%), IIB 13 (10%), IIIA 37 (27%) IIIB 1 (1%), IV 18 (13%). Adenokarsinom var den vanligste histologisk subtype (89, 66%), etterfulgt av squamous cell carcinoma (31, 23%), storcelle karsinom (7, 5%), karsinoid (4, 3%), sarcomatoid (2, 2%) , adenosquamous (1, 1%) og små-celle (1, 1%). I henhold til Travis adenokarsinom klassifiseringen [12], ble det observert 44 (55%) acinar adenokarsinom, 21 (26%) faststoff, 10 papillær, 3 mucinous, 2 lepidic og 9 NOS. Ninety-fem (70%) pasienter ble sendt til lobektomi, 14 (10%) til bilobectomy, 13 (10%) til pneumonectomy og 13 til sub-lobar reseksjon; positive reseksjonskanten ble observert i 13 tilfeller (10%, 10 R1 og tre R2).
B. RIN Kvalitet
A RIN ≥7 ble observert i 51% av prøven (70/135): andelen av prøver med høy RNA-kvalitet i henhold til den annen ex vivo iskemi tid er vist på fig 1A. Representative electropherograms viser RNA integritet tiltak av 12 representative prøver (figur 2, nedre panel) hentet fra banked ferske frosne lungekreftprøver.
A- Andel prøver egnet for genuttrykk arrays (RNA integritet nummer [RIN ] av ≥7) på forskjellige ex-vivo innkjøps ganger (tid fra kirurgisk fjerning til nedfrysing) for ≤1 timer, 1-2 timer, 3-4 timer, 5-9 timer og ≥10 timer. B- Forholdet mellom ex-vivo anskaffelser ganger ( 1 og 1-2 timer, fra excision til nedfrysing) og egnethet for genuttrykk arrays (RNA integritet nummer [RIN] av ≥7) og tidsperioder 2010, 2011 og 2012 .
representative electropherograms (Agilent 2100 Bioanalyzer) viser RNA integritet målt ved RNA integritet nummer (RIN) av 12 representative prøver (nederst).
ved hjelp av en multivariat justert modell vi viste at prøver lagret etter ulike intervaller vise en nedgang på RIN verdi snart etter 2 timer med ex-vivo iskemi tid (kald iskemi): 3-4 timer (OR 0,08, P = 0,044), 5-9 timer (OR 0,15, P = 0,011) og ≥ 10 timer (OR 0,25, P = 0,022) (tabell 2). Omvendt, kirurgisk tid (varm iskemi) ikke påvirke RNA kvalitet.
Multivariat logistisk regresjonsanalyse på 135 NSCLC prøvene.
Ingen forskjell i andelen av prøver med høy kvalitet RNA ble demonstrert i henhold til års lagring, histologi og svulst klasse: fig 1B viser prosentandelen av vevsprøver med RIN av ≥7 og ex-vivo innkjøp tid, ifølge biobanking anskaffelser. Omvendt, ble en høy pTNM scenen forbundet med lave RIN verdier ( 7, P 0,05).
C. mRNA uttrykk nivå
Twenty-åtte saker ble tilfeldig valgt å vurdere mRNA kvalitet ved å evaluere uttrykk nivåer av husholdningsgener. Som vist i figur 3A, CQ oppnådde verdier er mellom 18 og 37. Cq med mer enn 25 sykluser har blitt observert i prøver med RIN 4, mens det i prøver med RIN verdier innen 4-10, kan disse genene effektivt påvist med mindre sykluser (20 til 25 sykluser). Prøver med lavere uttrykk ble fortrinnsvis observert i gruppen med ≥ 3 timer med ex-vivo iskemi tid.
A- CQ uttrykk nivåer av rengjøring gener i tilfeldig valgt 28 prøvene er representative for alle tidskategorier. B- Gel elektroforese av 28 genomisk DNA forsterket med multipleks PCR forsterkende ved forskjellige antall basis paires (100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 600 bp).
D. Med høy molekylvekt (HMW) Genomisk DNA Integritet
De samme 28 prøver som brukes for RNA-bestemmelse ble også evaluert for deres integritet genomisk DNA (figur 3B). Nærværet av bånd ved hver størrelse ble anvendt som et surrogat for kvaliteten av DNA, med tanke på forsterkning gjennom 600 bp som den høyeste kvalitet DNA-verdi. Prøver med lavere RIN for hver tidsramme gruppene hadde også dårlig DNA kvalitet. Observert DNA kvalitet synes å være lik i alle deler av ex-vivo iskemi tid.
E. PDX engraftment
Sixty-tre primære svulster (41 adenokarsinom, 18 plateepitelkarsinom, tre store cellekreft og en sarcomatoid carcinoma) ble implantert, med en samlet total engraftment sats på 33% (21/63).
Svulster med større dimensjoner ( 3 cm, 23/25 vs 16/38, p 0,001) og en høyere patologisk stadium (III-IV, 15/25 vs 13/38, p = 0,048) var oftere implantert. Plateepitelkarsinom (12/25 vs 6/38, p = 0,017) og tumor med reseksjonskanten engasjement (R1-R2; 4/25 vs 1/38, p = 0,064) også oftere innpodet. Blant adenokarsinom, ble solid histologi assosiert med vellykket engraftment (6/11 vs 7/27, p = 0,09). Omvendt, høy tumor gradering (G3; 12/25 vs 15/38), positiv TIL (16/17 vs 30/34) og tilstedeværelse av mikrovaskulær invasjon (4/23 vs. 13/38) hadde tilsvarende frekvens i innpodet og ikke-innpodet grupper.
Multivariate justerte modellen viste sammenhengen mellom både langvarig ex-vivo iskemi (kald iskemi lenger enn 10 timer), utvidet kirurgisk tid (varm iskemi lenger enn 2 timer) med en lavere engraftment rate (P = 0,047 og p = 0,008 henholdsvis tabell 3)
Multivariat logistisk regresjonsanalyse på 63 NSCLC tilfeller
Omvendt, plateepitelhistologi (OR 8,55;.. P = M 0,01) og høy tumorstadium ble forbundet med engraftment suksess (OR 8,06; P = 0,053)
Vi undersøkte frosne tumorprøver PDX engraftment hastigheten ytterligere.. Av de 21 PDX linjene generert, vi valgte 8 svulster og vi implantert de tilsvarende primære frosne prøvene høstet ved kirurgi tid. Fire av de åtte prøvene (50%) effektivt vokste, genererer en PDX tråd sammenlignbar med den friske-avledet en.
Diskusjoner
Målet med vår studie var å evaluere den generelle vev kvaliteten på lungekreft prøver lagret i vår bio-depotet. Vi har også som mål å avgrense påvirkning av iskemi tid på lungekreft prøver og hvordan iskemi kan påvirke molekylær høy gjennomstrømming analyser og realisering av prekliniske in vivo-modeller.
Resultatene fra vår studie tyder på at (1) RIN verdien er betydelig påvirket av ex-vivo iskemi tid, tumor gradering og pTNM scenen; (2) Pasient-avledet xenotransplantater innpoding-hastighet suksess er også forbundet med lav ex-vivo iskemi-tid, lav kirurgisk varighet (varm ischemi tid) og squamous celle histologi; (3) mRNA housekeeping gener uttrykk nivåer og høy molekylvekt (HMV) genomisk DNA integritet er i slekt med RIN score og kan brukes som reproduserbare biomarkører for vev bevaring.
Ved å implementere standard operasjonsprosedyrer (SOP) vi var i stand til å fryse ned 135 primære lungekreft prøver med mål om å generere et stort av høy kvalitet biorepository, og uten at det går histopatologisk diagnose. Hvert trinn i denne prosessen er avgjørende: dette belyse rollen som spilles av en organisert team og en riktig triage evaluering av prøven i patologi rommet. Den VPAC system, allerede vist seg å bevare eksemplarer integritet, ble vedtatt som gull standard prosedyre for å få levedyktige vev [6-8]. Imidlertid, mens det i brystkreft vev RNA, DNA og proteiner optimalt kan bevares for 24 [7, 13], vi her viste at lungevev er mye mer fornuftig å nå. . Dette kan tyde på at ex-vivo iskemi kan påvirke cellenes levedyktighet og molekylære resultater avhengig av opprinnelsen av vev
Det er en generell aksept på viktigheten av å bruke intakt RNA i genuttrykk analyse og RIN av 7 anses som akseptabel som cut-off verdi for prøver egnethet [14,15]. I vår depotet, 51% av prøvene viste RIN 7, med en positiv utvikling i løpet av årene. Dette resultat ligger i mellom de som er rapportert for prostatakreft (60-81% [16]), tarmkreft (80% [17]), og de som er beskrevet i kreft i bukspyttkjertelen (40% [14]). Mulige forklaringer på disse forskjellene kan skyldes heterogenitet av celleinnholdet, ulik nedbrytningen av forskjellige vev, interoperatør-variabilitet, etc. Selv om flere faktorer kan påvirke forsterket degradering av RNA, under forutsetning av at ex vivo iskemi-tid er strengt forbundet med grad av RNA degradering ser ut til å være rimelig. Her ble en nedgang i RNA kvalitet observert fra 3 timer etter kirurgisk reseksjon. Dette resultatet er i tråd med en tidligere rapport om kurs degradering i lungevev: forfatterne funnet redusert nukleinsyre stabilitet fra 5 timer etter operasjonen [18]. På samme måte, begrenset ex vivo iskemi tid syntes å korrelere med optimal RNA integritet i tykktarmskreft (6-16 timer) [17], brystkreft (3 timer) [19], prostatakreft (2 timer) [16, 20] og i bukspyttkjertelen kreft vev. Long kirurgisk tid ikke påvirke RNA integritet, som ville være forventet hvis vevet iskemi var den eneste forklaringen på RIN nedgang. Videre mRNA uttrykk nivåer og HMV genomisk DNA integritet syntes å være delvis forbundet med RIN score, men viste mindre kvalitet reduksjon når korrelert med ex-vivo iskemi tid. Dette kan redde en stor fraksjon av 49% av prøvene med lavere RIN ( 7%), siden de kan bli brukt for klassiske molekylære teknikker. I vår studie var høy pTNM etapper også assosiert med redusert RIN poengsum. En mulig forklaring kan være kirurgisk manipulering og den påfølgende RNase utgivelsen som postulert skjema Bertilsson og Harveer om prostatakreft [20].
Pasient-avledet xenopatients anses nå til dags, pålitelige prekliniske musemodeller. Etableringen av dette verktøyet krever sofistikerte forskningsfasiliteter og introduserer tekniske og logistiske utfordringer, og har nylig blitt evaluert som en grunnleggende kilde til biologisk materiale og terapeutisk relevante opplysninger [21, 22]. Bruken av ferske og frosne primær tumorprøver som stammer fra en
Biobank
ressurs demonstrert muligheten for denne tilnærmingen, særlig når ulike tiltak er satt sammen i en godt integrert nettverk. Vår gruppe utnytter direkte implantering i mus, subkutant, av friske eller frosne vev fragmenter som stammer fra kirurgisk resected pasienter. Engraftment sats på 33%, selv vesentlig sammenlignes med de som allerede er attestert (25% -35%) av andre grupper i en subkutan innstillingen [23-25], resulterte litt lavere enn forventet vurderer større tilbøyelighet til NSG modell til engraftment. Men vi har observert en ganske høy prosentandel (29%) av innpodet adenokarsinomer som resulterer vanligvis mindre utsatt for implantasjon i forhold til squamos celletumorer. Iskemi tid innflytelse på innpoding hastighet viste at en forlenget kirurgisk (varm) iskemi periode er negativt forbundet med suksess for innpoding [25] i stedet for total (varm og kald) tid. Andre kjennetegn påvirke engraftment rate: tumor dimensjon ( 3 cm), patologisk stadium (III-IV) og plateepitelhistologi ha en innvirkning på engraftment rate, noe som tyder på at også iboende biologiske egenskaper svulsten spille roller i å bestemme PDX vellykket generasjon. Det samme gjelder for PDX generasjon fra frosne vevsprøver. Evnen til å re-generere 50% av PDX linje fra cryopreserved materiale antyder at ulike elementer kan påvirke vev biologi; imidlertid fremheve muligheten til å gå tilbake i ettertid i vevet biobank og plukke spesifikke molekylære definert svulster for å generere passende PDX linjen nyttig for
ad hoc
prekliniske screenings.
I dag finnes ikke studier har blitt gjennomført sammenligne ulike vev bevare metoder. Men vurderer sin evne til å bevare cellulær morfologi, epitop integritet og nukleinsyrer stabilitet, brukte vi VPAC system for vev lagring, spekulerer en positiv innvirkning også på PDX engraftment rate.
Til sammen disse dataene indikerer at den generasjonen av en lungekreft biorepository er en mulig tilnærming og krever komplekse nettverks innsats integrere ulike bio-medisinsk kompetanse. Dermed godt utformet protokoller er grunnleggende for riktig og effektiv
biobank
. Patologer, onkologer, thorax kirurger, sykepleiere, biologer, teknikere, epidemiologer og medisinske statistikere må samarbeide i en felles operativ arbeidsflyt for å sikre ikke bare høy kvalitet eksemplarer, men også riktig behandling protokollen, riktig oppbevaring, innsamling av data, epidemiologiske analyser i effektivt koordinerte prosjekter .
Vår tilnærming gir biorepository av en dyrebar samling av prøver for omfattende etterforskning på NSCLC. Spesielt kan høy kvalitet RNA og DNA anvendes for neste generasjon Sekvense teknikker, for eksempel RNAseq, Whole Exome Sequencing og Whole Genom-, men også nukleinsyrer med lavere kvalitet kan reddes for standard genekspresjon teknikker (dvs. kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaksjoner). Til slutt, tilgjengeligheten av fersk og frossen tumorprøver representerer en uvurderlig ressurs for å generere Pasient Avledet xenografter (PDX) linjer [26].
Konklusjon
Den molekylære lagdeling av NSCLC i siste æra av «presisjon medisin» har understreket betydningen av å opprettholde serie av høykvalitets prøver integrert med klinisk-patologiske data. Disse depotene kan bli etterforsket av Next-Generation Sequencing og er obligatorisk for generering av stabile prekliniske modeller.
Her kan vi rapportere en reproduserbar og pålitelig tilnærming til å generere en vev bank for NSCLC, og vi gir bevis på den kritiske verdien av prøver «kvalitet for senere studier. Faktisk RNA kvalitet og PDX engraftment hastighet ble negativt påvirket av langvarig iskemi tid, og dermed en korrekt, overvåket og velorganisert vev samling kan redusere strykprosent.
Samlet sett representerer NSCLC biobanker en innovativ modalitet som kan hell henrettet i en rutinemessig klinisk setting i alle institusjonene, men krever validert standard operasjonsprosedyrer.
