Abstract
Eggstokkreft G protein-koblet reseptor 1 (OGR1) stimulering av ekstracellulære protoner fører til aktivering av G-proteiner og påfølgende cellulære funksjoner. Men de fysiologiske og patofysiologiske roller OGR1 i luftveisresponser fortsatt i stor grad ukjent. I denne studien, viser vi at OGR1-mangelfull mus er motstandsdyktig mot hovedsymptomene ved astma, inkludert luftveis eosinofili, luftveiene hyperreaktivitet (AHR), og slimcellemetaplasi, i forbindelse med en bemerkelsesverdig hemming av Th2 cytokin og IgE produksjon, en ovalbumin (OVA) indusert astma modell. Intratrakeal overføring til villtype-mus av OVA-primet benmarg-avledede dendrittceller (DCS) fra OGR1-manglende mus utviklet lavere AHR og eosinofili etter OVA inhalasjon sammenlignet med overføring av de fra villtype-mus. Migrasjon av OVA-pulset DC til peribronchial lymfeknuter ble også hemmet av OGR1 mangel i adopsjons eksperimenter. Tilstedeværelsen av funksjonelle OGR1 i DCs ble bekreftet av uttrykket av OGR1 mRNA og OGR1 følsomme Ca
2 + respons. OVA-indusert ekspresjon av CCR7, en moden DC kjemokinreseptoren og migrering respons på CCR7 ligander i en in vitro Transwell-analyse ble svekket ved OGR1 mangel. Vi konkluderer med at OGR1 på DCs er avgjørende for overgangen til drenering lymfeknuter, som i sin tur stimulerer Th2 fenotype endringer og påfølgende induksjon av luftveisbetennelse og AHR
Citation. Aoki H, Mogi C, Hisada T, Nakakura T, Kamide Y, Ichimonji jeg, et al. (2013) Proton-Sensing Eggstokkreft G protein-koblet reseptor 1 på dendrittiske celler er nødvendig for Airway respons i en Murine Astma Model. PLoS ONE 8 (11): e79985. doi: 10,1371 /journal.pone.0079985
Redaktør: Bernhard Ryffel, Fransk Nasjonalt senter for Scientific Research, Frankrike
mottatt: 20 august 2013; Godkjent: 07.10.2013; Publisert: 11.11.2013
Copyright: © 2013 Aoki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Grant-i-Aid for Scientific Research (B) (til FO), Grant-i-Aid for Utfordrende Utforskende forskning (til FO), Grant-i-Aid for Scientific Research (C) (til TI og CM), og Grant-i-Aid for Unge Forskere (B) (til HA) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP). Dette arbeidet ble også støttet delvis av den felles forskningsprogram ved Institutt for molekylær og cellulær forordning, Gunma University (12023) (til TN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Allergisk astma er en Th2 lymfocyttmediert inflammatorisk luftveissykdom preget av eosinofili, økt slimproduksjon av slimceller, og luftveier hyperreaktivitet (AHR) [1,2]. Disse astmatiske responser mediert av Th2-cytokiner, inkludert IL-4, IL-5 og IL-13; IL-5 spiller viktige roller i differensiering, rekruttering og aktivering av eosinofiler og IL-4 og IL-13 er ansett for å være involvert i driften av IgE-syntese fra B-celler, slimcellemetaplasi og AHR. Makrofager og nøytrofile også akkumuleres i den inflammatoriske lesjon. Dendrittiske celler (DCS) er antigenpresenterende celler og spiller en sentral rolle i adaptive og medfødte immunresponser. Ved antigen eksponering på epitel, DC migrere til drenering lymfeknuter og har vist seg å være nødvendig for induksjon av Th2-responser på mange antigener ved å stimulere naive T-celler i løpet av allergi, så vel som å opprettholde adaptiv Th2-cellerespons [1,2].
Det er velkjent at astma er forbundet med luftveiene surgjøring, og nådde pH 5,2 under strenge astmatiske tilstander [3-5], på grunn av akkumuleringen av inflammatoriske celler i peribronchial og perivaskulær mellomrom, hvor stimulering av glykolyse og respiratorisk burst kan føre til at produksjonen av laktat og protoner [6]. Under en slik alvorlig sur pH, proton-sensing capsaicin-sensitive TRPV1 kanal og /eller syre sensing ionekanaler i sensoriske nerver har blitt foreslått å være involvert i initiering og utvikling av astmatiske symptomer [4,7].
Nyere studier har vist at OGR1-familien G protein-koblede reseptorer (GPCR), inkludert OGR1, G protein-koplede receptor4 (GPR4), og T-celledød forbundet genet 8 (TDAG8), som tidligere var foreslått som reseptorer for lysolipids, såsom sphingosylphosphorylcholine (SPC), avføle ekstracellulær surgjøring gjennom histidin-rest [8-10], noe som resulterer i stimulering av en rekke intracellulære signalveier via heterotrimeric G-proteiner [11-13]. OGR1 blir koblet med fosfolipase C og Ca
2 + signalveier og medierer en rekke sure pH-indusert handlinger i luftveiene glatte muskelceller [14-16] og andre celletyper [17,18]. Videre OGR1 er blitt vist å bli uttrykt i epitelceller [19], [20] makrofager og neutrofiler [21]. Således er OGR1 potensielt er involvert i patogenesen av astmatiske responser. Men rollene OGR1 i induksjon av kardinal reaksjoner i luftveisbetennelse har ennå ikke blitt rapportert in vivo. I den foreliggende undersøkelse, viser vi at OGR1-manglende mus er resistente mot luftveiene eosinofil inflammasjon og AHR i forhold til villtype (WT) mus i det minste delvis gjennom endringen i DC migrasjonsaktivitet.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til retningslinjene fra Animal Care og eksperimentering Komiteen Gunma University, og alle dyrene ble oppdrettet i Institute of Animal Experience Forskning fra Gunma University. Protokollen ble godkjent av Animal Care og eksperimentering komité Gunma University (Permit Number: 11-019). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Mus
Vi har nylig generert OGR1-mangel C57BL /6 mus [22]. Hunnmus med en målrettet forstyrrelse av OGR1 (
OGR1
– /-
mus) ble backcrossed i ti generasjoner mot en BALB /c genetisk bakgrunn. BALB /c
OGR1
– /-
mus og deres kullsøsken (
OGR1
+ /+
eller WT) ble brukt ved 5-6 ukers alder. Musene ble holdt under patogenfrie forhold og vedlikeholdes på en OVA-diett.
Allergi og luftveis Challenge
OGR1
– /- Hotell og
OGR1
+ /+ plakater (eller WT) mus ble tildelt følgende to grupper: PBS /PBS gruppe eller kontrollgruppen, intraperitoneal sensibilisering med PBS og luftveier duell med PBS, og OVA sensibilisering /utfordring gruppe, intraperitoneal sensibilisering med OVA og luftveier duell med OVA. Sensibilisering og utfordringen med OVA ble utført som beskrevet [23]. I korte trekk ble mus sensitivert ved injeksjoner av 10 ug OVA (grad V) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), sammen med 1 mg aluminiumhydroksid (Alu-Gel-S; Serva, Heidelberg, Tyskland) anvendt som et hjelpestoff i 0,2 ml, på dagene 0 og 14. Musene ble deretter utfordret via luftveiene ved inhalasjon eksponering mot aerosoler av OVA (1% i PBS) i 20 minutter på dagene 28, 29 og 30. på dag 32, luftveisresponser ble evaluert.
AHR
AHR ble målt ved både indirekte invasiv og direkte invasive metoder i mus 48 timer etter den siste OVA utfordring. I indirekte invasiv metode [24], ble reaktivitet til methacholine vurderes i hele kroppen plethysmograph (Buxco Electronics, Inc, Troy, NY). I korte trekk, ble saltløsning eller metakolin gitt av aerosol gjennom et innløp til kammeret i 3 min. Avlesninger ble initiert ved 3 minutter og fortsatte i 10 min. Toppverdier av 5-min gjennomsnitt forbedret pause (Penh) ble bestemt. Penh er definert som en evaluering av endringer i form av luftstrømmen mønster går inn og en hel-kropp flyt plethysmograph som et dyr puster. Data er uttrykt som prosent endring fra baseline verdier oppnådd etter inhalasjon av saltvann. Det var ingen signifikante forskjeller i utgangsverdier mellom de ulike gruppene. For invasiv måling av lunge motstand, ble musene bedøvet, trakeostomerte, og mekanisk ventilasjon. AHR ble vurdert ved å måle forandringer i lungeresistens (RL) som reaksjon på inhalert metakolin, som tidligere beskrevet [25]. Data er uttrykt som prosent endring fra baseline RL verdier oppnådd etter inhalasjon av saltvann. Det var ingen signifikante forskjeller i utgangsverdier mellom de ulike gruppene i begge metoder.
Bronchoalveolar lavage (BAL)
Mus ble gitt en dødelig dose av pentobarbital (60 mg /kg ip) og lungene ble lavaged med 1 ml alikvoter av Hanks «balanserte saltløsning (HBSS) gjennom trakeotomi. Den vaskevæske ble sentrifugert (300 x g i 10 minutter ved 4 ° C), og det BAL fluid supernatanten ble lagret ved -80 ° C før etterfølgende analyse. Cellepelleten ble resuspendert i 1 ml HBSS. Totale celletellinger ble utført ved å tilsette 50 ul av cellesuspensjonen til 50 ul av Kimura flekken, og cellene ble tellet i et Neubauer kammer i henhold til lysmikroskopi. Differensielle celletellinger ble gjort på Cytospin preparater, fremstilt ved sentrifugering ved 500 rpm i 5 minutter og farving med May-Grünwald-Giemsa beis. Cellene ble identifisert som makrofager, neutrofiler, eosinofiler, og lymfocytter i henhold til standard morfologi. Tre hundre celler ble tellet under × 400 forstørrelse, og den prosentvise og absolutte antall av hver celletype ble beregnet.
histologiske undersøkelser
Lung seksjoner fra ulike eksperimentelle grupper av mus ble utarbeidet og analysert som beskrevet tidligere [26]. Kort fortalt ble forlatt lungene fiksert i 4% paraformaldehyde og dyppet i parafin. Seksjonene (4 mikrometer) ble farget med periodisk syre-Schiff (PAS) for identifisering av slim-sekresjon celler (slimceller) i luftveiene og kontra med hematoksylin. De fargede slimceller ble regnet opp i stort kaliber preterminal bronkiene minst tre lungeseksjoner erholdt fra hvert dyr. Lengden på basal lamina av tilsvarende bronkie ble målt av Image J (National Institutes of Health). Dataene ble uttrykt som gjennomsnittet av PAS-positiv slimceller i bronkier per millimeter av basalmembran. Graden av peribronchial og perivaskulær inflammasjon (betennelse score) ble evaluert på en subjektiv skala fra 0 til 3, slik som beskrevet [27]. Tre uavhengige anonymiserte etterforskere gradert betennelse poengsum. En verdi på 0 ble tildelt da ingen betennelse var synlig, var en verdi av en tildelt for sporadisk cuffing med betennelsesceller, ble en verdi på 2 tildelt for de fleste bronkiene eller fartøy omgitt av et tynt lag (ett til fem celler tykt) av inflammatorisk celler, og en verdi på 3 ble gitt når de bronkiene eller fartøyer var omgitt av et tykt lag (mer enn fem celler tykk) av inflammatoriske celler.
Generering av Bone Marrow-Avledet DC (BMDCs)
DC ble samlet inn beinmargceller hos WT eller
OGR1
– /-
mus i henhold til metoden tidligere beskrevet [28]. I korte trekk, ble benmargsceller erholdt fra lårben og tibias av mus anbragt i RPMI 1640-medium (pH 7,4) inneholdende 10% FBS med rekombinant mus GM-CSF (10 ng /ml; R Men, oppdaget vi at effekten av OVA puls på uttrykk for CCR7 er svekket. Vi har derfor brukt kommersielt tilgjengelige RPMI 1640 medium uten ytterligere buffer-midler i in vitro-forsøk, bortsett fra kortvarig Ca
2+ reaksjon som er vist nedenfor. Når pH i mediet ble endret, ble HCl eller NaOH tilsettes til kulturmediet.
Adopsjon Eksperimenter med BMDCs
Dette ble utført som beskrevet [30]. I korte trekk, ble BMDCs fremstilt fra WT eller OGR1-mangelfull mus sensitivisert med OVA eller sitt kjøretøy (PBS) 24 timer før adopsjonen eksperimenter. OVA-pulserende BMDCs (1 x 10
6 celler i 40 mL PBS) ble innpodet i WT mus gjennom luftrøret. Ti dager senere ble musene utsatt for aerosolisert OVA (1% i PBS) i 20 minutter /dag i tre påfølgende dager; 48 timer etter den siste utfordringen, ble AHR vurdert og BAL væske ble oppnådd. Dermed blir innføringen eksperiment lov til å detektere signifikante astmatiske responser på 14 dager, noe som er mye kortere enn tiden (32 dager) som er nødvendig for påvisning av luftveisresponser ved den vanlige in vivo OVA sensibilisering /utfordring protokollen. Dette kan være på grunn av in vitro effektiv sensibilisering av DC med OVA i DC adopsjon eksperimenter.
BMDC Migration analysen in vivo
For å studere fordelingen av injisert BMDCs, celler ble fremstilt fra WT eller OGR1-manglende mus og pulset med PBS eller OVA som beskrevet ovenfor. Cellene ble merket med 10 ug /ml karboksyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) i 10 minutter ved 37 ° C i RPMI 1640 inneholdende 0,5% BSA (fraksjon V) (Sigma-Aldrich) . Fire grupper av merkede celler (PBS-behandlede WT DC, PBS-behandlede OGR1-mangel DC, OVA-behandlet WT DC, og OVA-behandlet OGR-en mangel DC) ble innpodet intratrakealt inn tre naive WT mus per hver gruppe. De peribronchial lymfeknuter fra 3 mus ble samlet for hver gruppe og CFSE
+ DC migrerer i de peribronchial lymfeknutene i løpet av 96 timer ble analysert ved hjelp av strømningscytometri, som beskrevet tidligere [30]. Lignende eksperimenter ble utført 3 ganger. Migrasjon aktivitet ble uttrykt som prosentandel av CFSE
+ DC (CFSE
+ CD11c
+) per totale celler anvendt.
DC migrering aktivitet ble ytterligere evaluert ved en fotpute assay, hvor OVA-pulserte BMDCs ble merket med CFSE som beskrevet, og cellene ble injisert subkutant i poten til WT mus. Vandringen av de celler i knehasen lymfeknuter ble analysert ved hjelp av strømningscytometri 24 timer etter injeksjon av cellene.
Måling av cytokiner og IgE
Cytokin nivåer i BAL væske ble målt ved Bio-Plex Suspension Array System (Nippon Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan) for IFN-γ, IL- 4 og IL-5, og ved hjelp av ELISA-sett (eBioscience, San Diego, CA) for IL-13, i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmanivåer av OVA-spesifikk IgE ble målt ved hjelp av DS mus IgE ELISA (OVA) kit (DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan), som beskrevet tidligere [23].
Måling av mRNA
Total RNA ble isolert og revers-transkribert ved hjelp av tilfeldig priming og Multiscribe revers transkriptase (Applied Biosystems, Foster City, California). De mRNA ble målt ved en kvantitativ real-time TaqMan PCR med Mx3000P Real-time PCR System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ved hjelp av spesifikke prober for OGR1 (Mm01335272), TDAG8 (Mm00433695), GPR4 (Mm00558777), G2A (Mm00490809 ), CCR7 (Mm01301785), og GAPDH (4352932E), som beskrevet tidligere [14].
Måling av intracellulær Ca
2+ konsentrasjon
De ikke-pulserende BMDCs ble høstet fra 10-cm retter med 4 mM EDTA /PBS og merket med fura2 /AM. Intracellulær Ca
2+ konsentrasjon ([Ca
2 +]
i) ble målt i celle-suspensjon under forsiktig omrøring tilstand i HEPES-bufret medium basert på endringer av Fura-2 fluorescens som tidligere beskrevet [14 ]. Den HEPES-bufret medium besto av 20 mM HEPES (pH 7,4), 134 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH
2PO
4, 1,2 mM MgSO
4, 2 mM CaCl
2 , 2,5 mM NaHCO
3, 5 mM glukose og 0,1% BSA. PH i mediet ble justert ved tilsetning av en passende mengde av HCl.
flowcytometri
BMDCs ble farget med PE-konjugerte monoklonale antistoffer (mAbs) fortynnet i PBS inneholdende 1% BSA ( FACS buffer). PE-konjugerte Ab’er, inkludert anti-CD11c og anti-CCR7, og isotype kontroll ble oppnådd fra BD Biosciences, San Diego, CA. Etter inkubasjon med Abs i 10 min ved 4 ° C, ble cellene vasket to ganger med FACS buffer og analysert ved ®FACScan strømningscytometer hjelp Cellquest-programvare (Becton Dickinson, Mountain View, California).
In vitro Migration analysen
På dag 7, WT eller
OGR1
– /-
BMDCs ble inkubert med eller uten OVA (100 ug /ml) som beskrevet ovenfor. Etter 24 timer, ble dyrkede celler høstet og resuspendert i RPMI 1640-medium ved pH 7,4 med 0,1% BSA. -Celler (4 x 10
5) ble lagt på toppen av en Transwell kulturinnsats med en diameter på 8 mm og 5-um porestørrelse chemotaxicell (Kurabo, Osaka, Japan). Testmidler ble tilsatt til det nedre rom av 24-brønners plater. Antall celler migrert til den nedre kammer i 2,5 timer ble bestemt ved fluorescens forandring med CyQUANT GR Dye (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) etter lysis av cellene.
Statistical Analysis
Alle forsøk ble utført i duplikat eller triplikat. Resultatene fra flere observasjoner er presentert som gjennomsnitt + SEM eller som representative resultater fra mer enn tre ulike grupper av celler, med mindre annet er angitt. In vivo eksperimenter, vi vanligvis utført fire til seks mus per gruppe i hvert forsøk og gjennomførte to eller tre ganger de samme eksperimentene. For presentasjon av resultatene av in vivo studier, vi vanligvis kombinert alle resultatene, med mindre annet er angitt. Alle statistiske beregninger ble utført med GraphPad Prism 5 (La Jolla, California). ANOVA ble anvendt for å bestemme nivåene av forskjellen mellom alle grupper. Sammenligninger for alle parene ble utført av uparede Student
t
test. En verdi på
p
0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Generering av OGR1
– /- BALB /c mus
For å forstå hvilken rolle OGR1 i astmaluftveisbetennelse, vi skapte OGR1-mangel BALB /c-mus. OGR1 mRNA uttrykket er observert i lungene fra WT mus, selv om uttrykket nivåer er ikke så høy som for andre proton-sensing GPCRs (figur 1). I bronkial astma modellen ble mus sensitivert ved intraperitoneal injeksjon av OVA i alun adjuvant to ganger og utfordret med OVA aerosol tre ganger (se figur 2A), som resulterer i 2,5 ganger økning i OGR1 mRNA-ekspresjon i lungene (figur 1). En slik betydelig økning i mRNA uttrykket ble ikke observert i andre proton-sensing GPCR. Som forventet ble det OGR1 mRNA uttrykket helt tapt, mens andre OGR1 familie GPCR mRNA uttrykk var uendret, i lungene til
OGR1
– /-.
Mus uavhengig av OVA behandling (figur 1)
WT og
OGR1
– /-
mus ble sensibilisert av OVA /alun og utfordret av OVA. For å nonsensitized mus, ble PBS injisert og innånding. Lung mRNA uttrykk for OGR1 og andre proton-sensing GPCRs ble målt 48 timer etter siste antigen utfordring. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM av 9 bestemmelser fra tre separate eksperimenter. * Effekten av OVA-priming (WT-PBS vs. WT-OVA) var signifikant.
§The uttrykk for OGR1 mRNA var umulig å oppdage.
(A) OVA sensibilisering og utfordring protokollen. WT og
OGR1
– /-
mus ble sensibilisert ved i.p. injeksjon av OVA /alun og utfordret av OVA aerosol (trekant). For å nonsensitized mus, ble PBS injisert og inhalerte (sirkel). AHR til den inhalerte metakolin ble fastslått ved forandringer i ikke-invasiv Penh (B) og dynamisk motstand (C) 48 timer etter den siste eksponering antigenet. Data er gjennomsnitts + SEM av
n
= 13-16 per gruppe. *
p
0.05 (WT-OVA vs. OGR1
– /- OVA).
OGR1 mangel Demper AHR og Airway Betennelse i OVA-sensibiliserte Mus
De patofysiologiske roller OGR1 i bronkial astma ble karakterisert ved hjelp av OVA astma modellen (figur 2A). Vi først vurderes en økning i forbedret pause (Penh) ved hjelp av barometrisk helkropps plethysmography som en indeks for luftveistrekningen som svar på økende doser av metakolin (figur 2B). Inhalert aerosolized metakolin er kjent for å indusere bronkokonstriksjon. OVA sensibilisering /utfordring klart økt Penh i respons til metakolin i WT mus; imidlertid AHR til OVA sensibilisering /utfordring ble betydelig svekket i OGR1-manglende mus til nivået av den i mus sensitivert og utfordret med PBS alene (figur 2B). Siden målingen av Penh som AHR er kontroversielt [31-33], målte vi lungeresistens med en direkte invasiv metode i tillegg. Anvendes i overensstemmelse med resultatene av Penh, OVA allergi /utfordring økte lungeresistens som reaksjon på metakolin i WT mus og OGR1 mangel dempes den OVA-indusert økning i lungeresistens til nivået av den for kontrollmusene sensitivert og utfordret med PBS (figur 2C ).
OVA allergi /utfordring forårsaket tett peribronchial og perivaskulær opphopning av betennelsesceller samt metaplasi og slim hyperproduction av luftveisveggene i WT mus (figur 3A og B). Disse endringene var minimal i OGR1-mangelfull mus med OVA allergi /utfordring (figur 3A). Graden av slimcellemetaplasi og slim hyperproduction ble vurdert av PAS flekker, som ble kvantifisert som PAS-farget celleantall pr lengde på basal lamina (mm) (Figur 3C). Stimulert PAS farging av OVA sensibilisering /utfordring ble betydelig hemmet av OGR1 mangel. Som for peribronchial og perivaskulær inflammasjon, ble graden av akkumuleringen av inflammatoriske celler bedømmes til betennelse stillingen (figur 3D og E), som viste at OGR1-mangel inhiberte signifikant OVA-sensibilisering /challenge-indusert inflammatorisk celle-akkumulering. Disse resultatene tyder på at OGR1 er involvert i slimcellehyperplasi og peribronchial og perivaskulær betennelse.
Mus ble sensibilisert og utfordret med OVA eller PBS, som beskrevet i figur 2. (A) Histologisk analyse av lungeseksjoner ble utført 48 timer etter siste antigen eksponering. De hematoxylin og PAS-farget seksjoner som vises er representative for tre lunge snitt per mus fra 5 til 6 mus i hver gruppe. Scale bar, 200 mikrometer. (B) Den høyere forstørrelse av plassen i WT-OVA vises. (C) slimcellehyperplasi ble kvantifisert som en PAS-farging celle nummer (C), og graden av peribronchial betennelse (D) og perivaskulær betennelse (E) ble evaluert på en subjektiv skala fra 0 til 3 som provoserende score, i å bruke samme delene som de som er brukt i (A). Kolonnen utforming som angir hver gruppe i (D) og (E) er de samme som i (C). Effekter av OGR1 mangel (WT-OVA vs. OGR1
– /- OVA) var signifikant (*
p
0,05) i hele figuren
Vi har analysert. antall og populasjon av celler i BAL væsker (figur 4A og B). De økte totale antall celler i mus med OVA allergi /utfordring ble betydelig redusert i OGR1 mus som mangler i forhold til WT mus. Differensiallegemer avslørte fremtredende rekruttering av eosinofile i BAL væske i WT mus med OVA sensibilisering /utfordring, som ble betydelig redusert i OGR1-mangelfull mus med de samme behandlingene. Innholdet av lymfocytter i BAL væsker ble også signifikant redusert ved OGR1 mangel. Det var ingen signifikant effekt av OGR1 mangel på antall makrofager og nøytrofiler.
Mus ble sensibilisert og utfordret med OVA eller PBS, som beskrevet i figur 2. BAL-fluid ble analysert 48 timer etter den siste eksponering for antigenet totale celleantallet og profil av celletyper. Representative bilder av betennelsesceller (A) og differensialceller (B) i BAL væsker. Pilspisser og piler representerer makrofager og eosinofile, henholdsvis. Scale bar, 200 mikrometer. Mac, makrofag; Lym, lymfocytter; Eos, eosinofiler; og Neu, nøytrofile. Data er gjennomsnitts + SEM av
n
= 10-12 per gruppe. De samme BAL væsker ble anvendt for å måle IL-4, IL-5, IL-13 og IFN-γ (C). Data er gjennomsnitts + SEM av
n
= 10-12 per gruppe. Plasma ble samlet for måling av OVA-spesifikk IgE-nivåer etter BAL væskeansamling (D). Data er gjennomsnitts + SEM av
n
= 6-15 per gruppe. Kolonnen utforming som angir hver gruppe i (C) og (D) er de samme som i (B). Virkningene av OGR1 mangel (WT-OVA vs. OGR1
– /- OVA) var signifikant (*
p
0,05) i hele figuren
Å. vurdere mekanismene for reduserte AHR, eosinofili, og slimcellemetaplasi ble Th1 /Th2-cytokiner i BAL væsker målt med ELISA (Figur 4C). OVA sensibilisering /utfordring induserte betydelige økninger i Th2-cytokiner, inkludert IL-4, IL-5 og IL-13, og Th1 cytokin IFN-γ i WT mus. Th2 cytokin innhold i BAL væsker var betydelig lavere i OGR1-mangelfull mus enn i WT mus. På den annen side ble det OVA allergi /challenge-indusert økning av IFN-γ produksjon påvirkes ikke av OGR1 mangel (figur 4C). Plasmanivået av IgE som er spesifikke for OVA ble også hemmet av OGR1 mangel på OVA sensibilisering /utfordret mus (Figur 4D).
DC Express Funksjonell OGR1
in vivo resultater er beskrevet ovenfor tyder på at OGR1 spiller en rolle i prosessen eller oppstrøms prosess med induksjon av Th2-respons i patogenesen av astma luftveiene. Vi spekulerer i at DC funksjoner er regulert av OGR1. Det har ikke vært tidligere rapport om OGR1 uttrykk og dens funksjoner i DC. Fordi antistoffer som er spesifikke for OGR1 ikke var tilgjengelig, ble det OGR1 ekspresjonsnivået evaluert ved måling av mRNA (figur 5A). Vi bekreftet OGR1 mRNA uttrykk vurdert av real-time TaqMan PCR i umodne BMDCs av WT mus. Interessant, mRNA uttrykk for OGR1 var litt, men betydelig økt med OVA sensibilisering (figur 5A). Som ventet ble OGR1 mRNA uttrykk helt borte i DCs uavhengig av OVA sensibilisering i
OGR1
– /-
mus (figur 5A). Vi målte også uttrykk for mRNA andre proton-sensing GPCR i DC. I motsetning til lungeprøver (figur 1), GPR4 ekspresjon var meget lav i DC uavhengig av OVA puls (fig S1). På den annen side, på samme måte som OGR1, TDAG8 og G2A mRNA-ekspresjon ble betydelig økt med OVA sensibilisering (figur S1).
DC uttrykke OGR1 mRNA og funksjonell OGR1 aktivitet. Uttrykk av OGR1 mRNA i DC og dens økning av OVA-priming (A). Ekspresjon av OGR1 mRNA ble bestemt ved kvantitativ sanntids TaqMan PCR. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av 9 bestemmelser fra tre separate eksperimenter. Effekt av OVA-priming (WT-PBS vs. WT-OVA) var signifikant (*
p
0,05).
§The uttrykk for OGR1 mRNA var umulig å oppdage. Forsuring induserer [Ca
2 +]
jeg øker gjennom OGR1 /G
q /11-protein i DC (B og C). DC ble fremstilt fra WT og
OGR1
– /-
mus og inkuberes å overvåke [Ca
2 +]
i evaluert av endring i Fura-2 fluorescens. Cellene ble preinkubert i suspensjon ved pH 7,4 og ved pilen, ble HCI (endelig pH-verdi på 7,0) eller ATP (100 uM) tilsatt. For å vurdere rollen til G
q /11-protein, ble cellesuspensjonen ble behandlet med YM-254890 (100 nM) (eller DMSO som bærer). En representant spor av [Ca
2 +]
i endringen ble vist (B). Netto [Ca
2 +]
jeg endrer (toppverdi – basal verdi) ble evaluert (C). Basal verdi av [Ca
2 +]
i ved pH 7,4 var 125 ± 12 nM, og verdien ble ikke nevneverdig påvirket av OGR1 mangel. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av 8 bestemmelser fra fire separate forsøk. Effekt av OGR1 mangel (WT vs. OGR1
– /-) var signifikant (*
p
0,05).
For ytterligere å bekrefte den funksjonelle OGR1 uttrykk i DC, Ca
2 + respons til ekstracellulære protoner ble undersøkt fordi OGR1 er kjent for å være sammen med G
q /11 protein /fosfolipase C /Ca
2 + signalveier i ulike typer celler [8,13-19]. Surgjøring av det ekstracellulære mediet til pH 7,0 tydelig økt intracellulær Ca
2+ konsentrasjon ([Ca
2 +]
i), som var nesten fullstendig inhibert ved OGR1 mangel og YM-254 890, er en spesifikk hemmer for G
Q /11 proteiner (Figur 5B og C). Den [Ca
2 +]
i respons til ATP, en ligand for G
Q /11 protein-koblede P2Y-type purinergiske reseptorer, ble ikke påvirket av OGR1 mangel (figur 5B og C). Dermed
OGR1
– /-
mus viste ikke en generell mangel på G
q /11 protein signalering. Vurderes samlet, disse resultatene tyder på at DC uttrykke funksjonell OGR1 kobling til G
q /11 proteiner.
intratrakeal Overføring av OGR1-Mangel DC Utvikler Nedre AHR og Eosinofili Sammenlignet med den av WT DC
For å vurdere den kritiske rollen OGR1 på DC i patogenesen av astma, adoptiv OVA-pulset DC overførings eksperimenter ble utført. De OVA-pulserende eller ikke-pulserende DC ble intratrakealt overført til WT mus, som ble etterfulgt av OVA innånding 10 dager etter DC administrasjon (Figur 6A). AHR målt som økning i Penh til inhalert methacholine var signifikant høyere i intratrakeal overføring av OVA-pulset DC enn for ikke-pulserende DC når DC ble fremstilt fra WT mus (Figur 6b). I motsetning til mus som fikk OVA-pulset OGR1-mangel DC utviklet lavere økninger i Penh sammenlignet med de som fikk OVA-pulset WT DC.
(A) Protokoll fra DC adopsjon eksperiment. OVA eller PBS-pulserende BMDCs ble fremstilt fra WT og
OGR1
– /-
mus og administrert intratrakealt til WT mus. Ti dager senere ble mus utfordret med OVA innånding i 20 min på tre påfølgende dager. Førti-åtte timer etter siste OVA-utfordring, ble AHR til metakolin målt som Penh aktiviteter (B). Etter måling av luftveis-reaksjons, ble BAL væsker samlet og analysert for telling av totale celler og differensierte celler (C). Data er gjennomsnitts + SEM av
n
= 10-12 per gruppe.
#
p
0,05 (DC (WT) -PBS vs DC (WT) -OVA) og *
p
0,05 (DC (WT) -OVA vs DC (
– /-) – OVA)
Vi målte også antall og typer av betennelsesceller i BAL væske av mus som overføres med DC. (figur 6C). Antallet eosinofiler og lymfocytter i BAL væsker av mus som fikk OVA-pulset OGR1-mangel DC var betydelig lavere enn de av musene som fikk OVA-pulset WT DC. Disse resultater indikerer at den endring av DC-funksjoner kan forklare, i det minste delvis, den reduserte AHR og luftveisinflammasjon i
OGR1
– /-
mus.
