Abstract
Overuttrykte ribonukleotidreduktase subenheten M2 (RRM2), er involvert i deoksyribonukleotidsubstratet syntese, driver chemoresistance for kreft i bukspyttkjertelen til nukleosidanaloger (f.eks gemcitabin). Mens stanse RRM2 av syntetiske midler har vist lovende i å redusere chemoresistance, målretting endogene molekyler, spesielt microRNAs (mirnas), for å avansere kjemoterapeutiske utfall har vært dårlig utforsket. Basert på beregnings spådommer, vi hypotese at
la-7
tumorsupressorproteinene mirnas vil hemme RRM2-mediert gemcitabin chemoresistance i bukspyttkjertelkreft. Redusert uttrykk for flertallet av
la-7
mirnas med et omvendt forhold til RRM2 uttrykk ble identifisert i medfødt gemcitabin-resistente bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Direkte binding av
la-7
mirnas til 3 «UTR av RRM2 transkripsjoner identifisert post-transcriptional regulering av RRM2 påvirke gemcitabin kjemosensitivitet. Forbløffende overekspresjon av human precursor-
la-7
mirnas ført til forskjells RRM2 uttrykk og kjemosensitivitet responser i et dårlig differensiert kreft i bukspyttkjertelen cellelinje, MIA PACA-2. Defekt behandling av
la-7a
forløpere til modne former, delvis forklarte avvik observert med
la-7a
uttrykks utfall. Konsekvent, til prosenter av modne forløper
la-7a
ble gradvis redusert i gemcitabin-sensitive L3.6pl og CAPAN-1 cellelinjer overtalt til å kjøpe gemcitabin motstand. Foruten kjente regulatorer av
la-7
biogenesis (f.eks LIN-28), kort hårnål RNA bibliotek screening identifisert flere nye RNA bindende proteiner, inkludert SET oncoproteinet, til forskjellig innvirkning
la-7
biogenesis og kjemosensitivitet i gemcitabin-sensitive versus -resistente kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre LIN-28 og SET knockdown i cellene førte til dyptgripende reduksjoner i celleproliferasjon og koloni-formasjon kapasiteter. Endelig defekt behandling av
la-7a
forløpere med en positiv korrelasjon til RRM2 overekspresjon ble identifisert i pasient avledet bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDAC) vev. Disse dataene viser en intrikat post-transcriptional regulering av RRM2 og kjemosensitivitet av
la-7a Hotell og at manipulering av regulatoriske proteiner involvert i
la-7a
transkripsjon /behandling kan gi en mekanisme for å bedre kjemoterapeutiske og /eller tumorvekst kontroll responser i bukspyttkjertelkreft
Citation:. Bhutia YD, Hung SW, Krentz M, Patel D, Lovin D, Manoharan R, et al. (2013) Differential Behandling av
la-7
en Forløpere Påvirker RRM2 Expression og kjemosensitivitet i bukspyttkjertelkreft: Role of LIN-28 og SET oncoprotein. PLoS ONE 8 (1): e53436. doi: 10,1371 /journal.pone.0053436
Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense University, Spania
mottatt: 14. september 2012; Godkjent: 28 november 2012; Publisert: 15 januar 2013
Copyright: © 2013 Bhutia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NCI-5-P50-CA128613-SPORE (RG), NCI-1R03CA161832-01 (RG), Georgia Cancer Coalition-Georgia Forskning Alliance (RG), og ved Avdeling for farmasøytisk og Biomedical Sciences, University of Georgia , Athens, GA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ribonukleotidreduktase (RR) er et hastighetsbegrensende enzym for cellereplikasjon som katalyserer reduksjonen av ribonukleotider til deoksyribonukleotider i løpet av DNA-syntese. Det er overuttrykt i mange faste tumorer inkludert pankreatisk [1]. Akkumulerende bevis tyder på at RR fungerer som en positiv determinant for tumorcelle-proliferasjon og metastase så vel som utviklingen av chemoresistance for nukleosid-analoger som brukes for behandling av kreft i bukspyttkjertelen (f.eks gemcitabin, capecitabin, 5-fluoruracil) [2] – [6]. RR aktivitet er regulert i S-fasen av cellesyklusen primært ved transkripsjonen aktivering av en av de ikke-identiske subenheter, kalt RRM2 [7], [8]. RRM2 uttrykk er blitt vist å bli indusert i kjemoresistent celler ved genamplifikasjon, transkripsjonelle aktivering, og kanskje andre uidentifiserte mekanismer [5], [9]. Nyere studier har vist at eksogene manipulasjoner av RRM2 uttrykk av siRNA eller antisensoligonukleotider forbedre kjemosensitivitet i bukspyttkjertelkreft [10], [11].
Selv om downmodulation av RRM2 av syntetiske midler (f.eks siRNA) har vist potensial i redusere tumorvekst og gemcitabin chemoresistance, har mulighetene for å manipulere endogene molekyler for å forbedre gemcitabin svar og kanskje bedre terapeutisk utfall i kreft i bukspyttkjertelen aldri blitt utforsket. MicroRNAs (mirnas), endogent uttrykt ~22-nt lange RNA i stand til å etter transcriptionally stanse mål genekspresjon, tilbyr flere fordeler i denne forbindelse. For eksempel kan det store antall mirnas i det humane genom og deres ulike mål [12] tillate valg av miRNA (e) ikke bare å forbedre chemosensitization men også gunstig innvirkning på mange gennettverk involvert i forhold som tumorvekst, invasjon, kreft stilk celleoverlevelse, etc. [13], [14]. Videre, siden mirnas er ofte nedregulert i kreft [15], [16], reetablere deres uttrykk er sannsynlig å legge til rette for synergi vekst-kontroll svar med kjemoterapeutika. I tillegg vil utvide forståelsen av miRNA genregule gi muligheter for å manipulere sine uttrykk med små molekyler uten kompleksiteten av syntetiske oligonukleotid levering i svulstene.
Under leting etter mulige miRNA hemmere av RRM2 av beregnings miRNA mål prediksjon algoritmer vi fant
la-7
familie av tumor suppressor mirnas å ha et frø kamp for baseparring med 3 «UTR av RRM2 (kontekstrille persentil: 94; TargetScanHuman 5.1). Konsekvent, har tidligere studier innblandet en årsakssammenheng mellom
la-7 Hotell og RRM2, identifisere nedregulering av mange
la-7
familiemedlemmer i RRM2-overekspresjon, gemcitabin-resistente kreft i bukspyttkjertelen celler eller en reduksjon i RRM2 uttrykk etter
la-7
overekspresjon [17], [18]. Videre overekspresjon av
la-7
ble funnet å øke bestrålingssensibilisering av pankreatiske tumorceller [19], mens hemming av RRM2 ble identifisert til å sensibilisere pankreastumorer til ultraviolent stråling [20], [21]. Nylig tvunget uttrykk for
la-7
mirnas ble vist å hemme kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon
in vitro
men ikke tumorvekst
in vivo
tyder tilstedeværelsen av komplekse funksjonelle konsekvenser [22]. Derfor, for å utrede mulighetene for samspill mellom
la-7 Hotell og RRM2 og for ytterligere å utforske muligheten for å benytte
la-7
for kreft i bukspyttkjertelen therapeutics, vi søkt å fastslå den direkte effekten av menneskelig
la-7
familien på RRM2-mediert iboende gemcitabin motstand. Her rapporterer vi en intrikat regulering av RRM2 uttrykk og gemcitabin chemosensitization av
la
-7
en
forløpere og identifisere at miRNA transkripsjonen /behandling maskineri involvert i moden
la-7a
biogenesis er sannsynlig å fungere som en avgjørende faktor når de vurderer
la
-7a-basert terapi for kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Tumor RNA og vev
Total RNA fra 10 PDAC vev og 2 normal pankreas vev ble anskaffet fra Asterand (Detroit, MI). Den demografiske og klinisk informasjon med RNA prøver er vist i
Tabell S1
. Seks PDAC vevsprøver sammen med matchet normale tilstøtende vev ble anskaffet fra National Disease Forskning Interchange (Philadelphia, Pennsylvania) [23]. NDRI innhenter skriftlige samtykke fra kildene. Innkjøp og bruk av disse menneskelige vev for denne forskningen ble gjort i henhold til University of Georgia Institutional Review Board. Styret har bestemt at bruk av humant biologisk vev i denne forskningen ikke oppfyller kriteriene for forskning som omfatter mennesker per 45 CFR 46,102, og derfor ikke krever menneske godkjennes av styret.
Reagenser
gemcitabin ble hentet fra ChemieTek (Indianapolis, IN). Føtalt bovint serum (FBS) var fra PAA Laboratories, Inc. (Ontario, Canada). 4 «, 6»-diamidino-2-fenylindol (DAPI), dimetylsulfoksyd (DMSO), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), propidiumjodid, etylenglykol bis (2-aminoetyleter) tetraeddiksyre (EGTA), fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), N-etylmaleimid (NEM), natrium ortovanadat (Na
2VO
4), og jodacetamid ble oppnådd fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Den bicinchoninic syre (BCA) protein assay reagens og West Pico Chemiluminiscent underlaget var fra Pierce Chemical (Rockford, IL). Fluorescent anti-fade montering reagent og Vybrant DyeCycle grønn ble oppnådd fra Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, California). Plast for cellekultur ble oppnådd fra Corning (Corning, NY). Alle cellekulturmedier ble innkjøpt fra Mediatech (Manassas, VA), bortsett fra human keratinocytt basal medium som ble anskaffet fra Molecular Probes.
Antistoffer
anti-humant polyklonalt geit RRM1 (T- 16), RRM2 (E-16), dCK (L-19), hCNT3 (C-15), og SET /I2PP2A (E-15) antistoffer samt (4B10) antistoff monoklonalt hnRNP-A1 ble oppnådd fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Detaljene i hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2, og p-aktin-antistoffer ble beskrevet tidligere [23], [24]. Den anti-humant polyklonalt kanin CDA (ab56053) og anti-human mus-monoklonale antistoffer KHSRP ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). Den anti-human kanin polyklonalt LIN-28-antistoff ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).
Konstruksjoner
RRM2 cDNA uten 3′-UTR region ble konstruert fra RRM2 truclone (RRM2 (NM_001165931) Menneskelig cDNA Clone; Produkt-ID: SC326997; Origene, MD) ved hjelp av PCR-baserte metoder. Den pmiRGLO-G-FUD konstruksjonen ble opprinnelig oppnådd fra Promega (Madison, WI) og modifisert for å inneholde GFP smeltet sammen med ildflue luciferase-genet, noe som gjør det til en dual reporter assay. Promotoren ble også fjernet og byttet ut med CMV-promoteren. Som en reporter for behandling, konstruksjoner som inneholdt -50 basepar oppstrøms og nedstrøms for
la-7a-en product: (pmirGLO-GFP /luc-pre-
la-7a-en
) og
la-7b plakater (pmiR-glo-GFP /luc-pre-
la-7b
) microRNAs ble gjort og klonet nedstrøms av GFP-Luc 3 «UTR. Når riktig behandlet, spalting av mikroRNA destabiliserer GFP /Luc mRNA fører til en reduksjon i både proteiner.
Cell Culture, immunocytochemistry, MTT cytotoksisitet flowcytometri, kolonidannelse, og Real-time PCR-analyser
Disse prosedyrer ble utført som beskrevet tidligere [23], [24]. TAQMAN primere og prober for RRM2 (Hs00357251_g1) ble oppnådd fra Applied Biosystems (Foster City, CA).
miRNA Detection
Total RNA isolering og cDNA syntese ble utført ved hjelp av
mir
Vana miRNA Isolation Kit og TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), henholdsvis, i henhold til produsentens instruksjoner. Relativ kvantifisering av RNA-transkripter ble utført som beskrevet tidligere [23], [24]. Validerte TAQMAN primere og prober for
la-7a plakater (hsa000377),
la-7b plakater (hsa002619),
la-7c plakater (hsa000379),
brev 7d product: (hsa002283),
la-7e plakater (hsa002406),
la-7F plakater (hsa000382),
la-7g plakater (hsa002282),
la-7i plakater (hsa002221), først og
la-7a-en product: (Hs03302533_pri), først og
la-7a-to plakater (Hs03302539_pri), og først og
la-7a-tre plakater (Hs03302546_pri) kjøpt fra Applied Biosystems ble brukt.
Generering av gemcitabin-resistente bukspyttkjertelen tumorceller
Celler ble utsatt for økende konsentrasjoner (5-20 nm) av gemcitabin i 5-6 uker per konsentrasjon.
Western blotting
Western blotting-analyse ble utført som beskrevet tidligere [23], [24] bortsett fra følgende modifikasjoner. Totale cellelysater ble fremstilt i lyseringsbuffer inneholdende 10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM natriumfluorid, 10 mM NEM, 10 mM Na
2VO
4, 10 mM jodacetamid, 0,5% Triton-X- 100, og en protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). PH-verdien i lyseringsbuffer ble holdt ved 7,4. Etter å ha vurdert proteininnhold med BCA Protein Assay Kit, ble 50 ug /kjørefelt lastet og elektroforetisk separert på 10% polyakrylamid natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) geler og overført ved 150 V i 1 time eller 20 V over natten til et polyvinylidenfluorid ( PVDF) membran (Millipore, Billerica, MA). Antistoffer mot enzymer (RRM1, RRM2, dCK, CDA) og nukleosid transportører (hCNT1, hCNT3, ENT1, ent2) [24] ble brukt i 1:500-1000 fortynninger. Densitometriske analysene ble utført som beskrevet tidligere [23].
Generering av MIA Paca-2 Stabile Cells overekspresjon Pre-
la-7 Medlemmer Medlemmer
FIV-la-7 konstruksjoner (
la-7a-2
,
la-7a-3
,
la-7b
,
la-7c
,
brev 7e
,
la-7F-1
,
la-7F-2
,
la-7g
, og
la-7i
) fra GeneCopoeia (Rockville, MD) og HIV-la-7 konstruksjoner (la-7a-en og la 7d) fra System biovitenskap (Mountain View, CA) ble brukt. Lentivirale emballasje-celler (293Ta; GeneCopoeia) ble sådd ut i en tetthet på 1,3-1,5 x 10
6 i 10 cm skåler inneholdende 10 ml av DMEM supplert med 10% varme-inaktivert FBS. Celler ble tillatt å nå 70-80% konfluens på tidspunktet for transfeksjon av de ovenfor nevnte konstruksjoner. Virusinfeksjoner ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble 2,5 ug av uttrykket DNA-klon og 5 pl (0,5 pg /ul) av Lenti-Pac FIV /HIV blanding fortynnet i 200 ul Opti-MEM (Invitrogen). I en separat slange, ble 15 ul EndoFectin Lenti også fortynnet i 200 ul Opti-MEM. Den fortynnede EndoFectin Lenti reagens ble deretter tilsatt dråpevis til DNA-oppløsningen og virvles. Blandingen ble deretter inkubert i 10-25 minutter ved romtemperatur for å tillate DNA-Endofectin komplekset å dannes. DNA-Endofectin Lenti kompleks var direkte lagt til hver rett av 293Ta celler. Rettene ble forsiktig rundt for å fordele komplekse og deretter inkubert over natten i en CO
2 inkubator ved 37 ° C. Cellene ble erstattet med friskt DMEM-medium etter 24 timer, og lentivirus ble høstet og filtrert ved 24-48 timer etter transfeksjon. For transduksjon av pakkede lentiviral uttrykk kloner, ble MIA PACA-2 celler seeded i 10 cm retter 24 timer før virusinfeksjon. De ble deretter infisert med 3 ml av virussuspensjonen i oppløsning med 8 ug /ml polybrene. Cellene ble deretter inkubert over natten i en CO
2 inkubator ved 37 ° C hvoretter de ble supplert med friskt medium. Etter en 24 timers periode med vekst, kulturer infisert med zeocin bestandig gener (PMIF-EGFP-Zeo) ble valgt med 400 mikrogram /ml Zeocin (Invitrogen), og de som er smittet med puromycin-resistente gener (pEZX-MR04) ble valgt med 10 ug /ml puromycin.
shRNA-basert screening for Antatte RNA Processing Proteiner
96 shRNA konstruerer fra Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Huntsville, AL) ble innhentet fra genome Sciences Resource ved Vanderbilt Universitet. Den lentiviral pakkingscellelinje (Phoenix) ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
6 i 6 cm skåler inneholdende 5 ml av DMEM supplert med 10% varme-inaktivert FBS. Celler ble dyrket til 70-80% konfluens ved transfeksjon med shRNA konstruksjoner. Virusinfeksjoner ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 1 ug av uttrykket DNA-klon, 0,75 ug av emballasje vektor (pCMV~DR7.74psPAX2) og 0,3 ug av konvolutten vektor (pMD2.G) ble blandet og tilsatt til et rør inneholdende 200 ul Opti-MEM ( Invitrogen) og 6 ul av Fugene 6 (Roche). Blandingen ble deretter inkubert i 25 minutter ved romtemperatur, hvoretter den ble direkte tilsatt til hver skål med Phoenix celler. Rettene ble forsiktig rundt for å fordele komplekse og deretter inkubert over natten i en CO
2 inkubator ved 37 ° C. Cellene ble erstattet med friskt DMEM-medium etter 24 timer, og lentivirus ble høstet og filtrert ved 24-48 timer etter transfeksjon. For transduksjon av pakkede lentiviral uttrykk kloner, ble MIA PACA-2 og L3.6pl celler sådd i 6-brønns klynger 24 timer før virusinfeksjon. De ble deretter infisert med 1 ml av virussuspensjonen i oppløsning med 4 ug /ml polybrene. Cellene ble deretter inkubert over natten i en CO
2 inkubator ved 37 ° C hvoretter de ble supplert med friskt medium. Etter en 24 timers vekstperiode ble cellene valgt med 0,5 og 0,1 ug /ml puromycin for MIA PACA-2 og L3.6pl, respektivt. Flere stabile kloner ble screenet ved mikroskopi for GFP koekspresjon.
Mål
In Vitro
Reporter analysen
For luciferasepreparater bindingsanalyser, 293Ta celler ble sådd på en 24-brønns klynge ( 5 x 10
3 celler /brønn) og transdusert med forskjellige la-7-forløpere ved hjelp av lentiviral genet overføringsmetoden (som beskrevet tidligere). Tjuefire timer etter såing, ble cellene etterfylles med nye medier og transfektert med en mikrogram av kontrollen eller RRM2 3 «UTR mål vektor (ID: HmiT053958; GeneCopoeia), 100 ul Opti-MEM (Invitrogen) og 3 pl FuGeneHD transfeksjon reagens (Roche) i henhold til produsentens protokoll. Trettiseks timer etter transfeksjon, ble cellene lysert ved passiv lyseprosedyren og behandlet som beskrevet i nevnte dobbeltport-Luciferase Assay Kit (Promega). Cellelysatene ble sentrifugert ved 10000 rpm i 30 s, og luciferase-assay ble utført med den klare supernatanten overført til en sort 96-brønners mikrotiterplate (Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA). Tyve pl av cellelysat ble blandet med 100 ul LARII løsning for å starte reaksjonen, og 100 ul stopp og Glo reagens ble brukt for samtidig å slukke luciferase og starte Renilla reaksjonen. Luciferase og Renilla luminescens ble kvantifisert ved 100 nm, og hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Statistical Analysis
students t test ble benyttet for å identifisere signifikante forskjeller, og hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Med mindre annet er angitt,
p
0,05,
p
0,01, og
p
0,001 sammenlignet med kontrollforhold ble representert av en, to og tre stjernene, henholdsvis.
Resultater
RRM2 og
la-7
er omvendt Uttrykt i Human kreft i bukspyttkjertelen celler
Vi først bekreftet RRM2 uttrykk i bukspyttkjertelkreft cellelinjer som ble kategorisert tidligere som iboende gemcitabin-sensitive eller motstandsdyktig [23]. QRT-PCR (
Fig. 1A
) og Western blotting (
Fig. 1B
) analyser som viste signifikant høyere RRM2 mRNA (2-3 ganger) og protein (5-6 ganger) uttrykk, henholdsvis i to ut av de 3 gemcitabin-resistente cellelinjer undersøkt (MIA PACA-2 og PANC-1) som bedømt ved sammenligning med en normal human pankreatisk duktus epitelial (HPDE) cellelinje. Motsatt var sammenlign RRM2 uttrykk identifisert mellom de fleste gemcitabin-sensitive cellelinjer (L3.6pl og CAPAN-1) og HPDE (
Fig. 1A-B
). Disse resultatene tyder på at en overekspresjon av RRM2 er sannsynlig å spille en rolle i gemcitabin chemoresistance i de fleste bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, om ikke alle.
A, etter RRM2 mRNA uttrykk i bukspyttkjertelkreft cellelinjer i forhold til uttrykk identifisert i HPDE.
Columns, etter at over tre eksemplarer;
barer, etter SD. n = 3.
B, etter Western blotting-analyse av RRM2 (~45 kDa) og β-aktin (45 kDa) i helcellelysater av HPDE og bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
C, etter Uttrykk for
brev 7
familiemedlemmer i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer i forhold til uttrykk i HPDE.
Kolonner
, mener av tre eksemplarer;
barer
, SD. n = 3; *
P
0,05.
D,
RRM2 er et direkte mål for
la-7
. 293TA og MIA PACA-2-celler ble virusinfiserte for uttrykk av forløperne til
la-7a-en
,
la-7a-2
,
la-7a-3
la-7b
, og MIR-214 (
negativ kontroll
) og deretter transfektert med en RRM2 3 «UTR luciferase reporter konstruere. Luciferasepreparater aktiviteter målt 36 timer etter transfeksjon (normalisert forhold til Renilla aktivitet) ble plottet.
Kolonner
, mener av tre eksemplarer;
barer
, SD. n = 3. *
p
0,05, **
p
. 0,01
For å vurdere
la-7
kontroll av RRM2 uttrykk, vi senere profilert nevnte cellelinjer for relativ uttrykk for alle
la-7
familiemedlemmer av QRT-PCR. Interessant, betydelig lavere uttrykk for det meste av
la-7 ble observert
mirnas bare i cellelinjer med relativt større RRM2 uttrykk. MIA PACA-2 viste redusert uttrykk for
la-7a
,
la-7b
,
la-7c
,
la-7e
,
la-7F
, og
la-7g
, PANC-en viste redusert uttrykk for
la-7b
,
la-7c
,
la -7d
,
la-7g
,
la-7H
, og
la-7i
, og BxPC-3 utviste redusert uttrykk for
brev 7b
,
la-7c
,
la-7d
,
la-7F
, og
la-7i product: (
fig . 1C
). Ingen til bare noen få
la
-7 medlemmer hadde betydelig redusert uttrykk i de resterende cellelinjer som uttrykte lignende nivåer av RRM2 protein som HPDE (dvs. L3.6pl: none; ASPC-en:
la 7C
, CAPAN-en:
la-7c
,
la-7F
) (
fig 1C
).. Disse resultatene støtter en invers sammenheng mellom RRM2 og
la-7
uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Vi testet den direkte interaksjonen mellom
la-7
med RRM2 ved trans en luciferase-ekspresjonskonstrukt fusjonert til 3′-UTR av RRM2 inn i 293Ta (ATCC CRL-9078-) [23] og MIA PACA-2 transient overuttrykker
la-7
medlemmer. Mens alle
la-7
medlemmer betydelig redusert luciferaseekspresjon i 239Ta celler, mange
brev
7 medlemmer brakte en betydelig reduksjon i luciferase uttrykk i MIA PACA-2 celler i tillegg (
fig. 1D
), noe som tyder på at den direkte binding av
la-7
til RRM2 3 «UTR fører RRM2 undertrykkelse. Til slutt, siden
la-7
overekspresjon øker G2 /M brøkdel av fibroblaster [25] og RRM2 uttrykk er spesifikk for S-fase celler, vurderte vi rollen som
la-7
i reduserende RRM2 ekspresjon ved å redusere andelen av MIA PACA-2 i S-fasen. Under disse forholdene, men ingen fremtredende reduksjoner i S-fase celler ble observert i noen av pre-
la-7
overekspresjon MIA Paca-2 (
Fig. S1
). Samlet utgjør disse dataene sannsynlig tyder på at
la-7
medlemmer kan endogent hemme RRM2 uttrykk ved direkte post-transcriptional undertrykkelse i MIA PACA-2.
Menneske
la-7
forløpere Forskjellig Endre RRM2 Expression og Gemcitabine Chemosensitization i MIA Paca-2
siden forsøkt å generere stabile kloner av MIA Paca-2 som overuttrykker en av ti mennesker
la-7
forløpere [27 ] for å studere deres virkninger på RRM2 protein og kjemosensitivitet. Vi valgte MIA PACA-2 cellelinje for disse undersøkelsene fordi den viser lav sensitivitet overfor gemcitabin, spesielt på sub-konfluente forhold, men uttrykker høye nivåer av RRM2 (
Fig. 1B
) [23]. I tillegg MIA Paca-2 er en dårlig differensiert kreft i bukspyttkjertelen celle modell [23] og
la-7
spiller viktige roller i celledifferensiering. MIA PACA-2 som stabilt uttrykker pre-
la-7a-en
, pre-
la-7a-
2, pre-
la-7a-3
, pre-
la-7b
, pre-
la-7d
, pre-
la-7e
, pre-
la-7F-1, etter pre-
la-7F-2
, og pre-
la-7i
ble generert hell av lentiviral genoverføring; Men gjentatte forsøk på å stabilt transduce pre-
la-7c Hotell og pre-
la-7g
mislyktes på grunn av mangel på overlevende kolonier. Interessant, viste Western blotting-analyse betydelige reduksjoner i RRM2 protein uttrykk bare i MIA Paca-2 som stabilt uttrykker pre
-La-7a-3
, pre
-La-7e
, pre
-La-7F-1
, og pre
-La-7i
men bare minimalt i MIA PACA-2-celler uttrykker pre
-La-7b
, pre
-La -7d
, og pre
-La-7-f-2
celler (
fig. 2A
). Overraskende, nivået av RRM2 protein økt i MIA Paca-2 uttrykker pre-
la-7a-en product: (
Fig. 2A
). Immunocytokjemisk analyse av disse stabile kloner for RRM2 uttrykk [26] bekreftet disse resultatene (
Fig. 2B
). Disse dataene identifisere at RRM2 uttrykks utfall signifikant forskjellig med overekspresjon av spesifikke pre-
la-7
subtyper i kreft i bukspyttkjertelen celler.
En
, Western blotting analyse av RRM2 (~45 kDa) og β-aktin (45 kDA) i helcellelysater av MIA Paca-2 overekspresjon forløpere for
la-7
familiemedlemmer. Prosenter av RRM2 p-aktin bandet intensiteter (normalisert til kontroll) fra tre eksperimentene er indikert (
toppen
). Stjernene viser betydelige reduksjoner (
p
0,05) i RRM2 nivåer sammenlignet med kontroll.
B
, immunocytokjemisk påvisning av RRM2 i eksponentielt voksende MIA Paca-2 overekspresjon pre-
la-7
familiemedlemmer. Original forstørrelse, x20.
C
, MIA Paca-2-celler som stabilt overekspresjon pre-
la-7
familiemedlemmer (
rød
) eller vektor alene (
Blå
) var behandlet med gemcitabin (0,1 nM til 100 uM), og prosent inhibering av cellulær proliferasjon ble målt ved anvendelse av et MTT-assay.
poeng
, mener av tre eksemplarer;
barer
, SE. n = 3. gemcitabin IC
50 estimater angitt (
parenteser
).
Siden de fleste
la-7
medlemmer [27] syntes å ha negativ innflytelse RRM2 uttrykk, vi videre undersøkt om pre-
la-7
kunne utfylle kjemosensitivitet av MIA PACA-2 til gemcitabin. Interessant, betydelige reduksjoner i gemcitabin cytotoksiske IC
50 overslag ble identifisert i nesten alle forhånds
la-7
-expressing MIA PACA-2 stabile kloner generert med det eneste unntaket er pre-
brev 7a-en
som innføring brakte ingen forskjeller (
fig. 2C
). For å teste om
la-7
-mediert økning i gemcitabin cytotoksisitet ble tilrettelagt av RRM2 undertrykkelse, vi overexpressed RRM2 cDNA med eller uten de 3 «UTR regioner i MIA Paca-2 uttrykker pre-
la-7a-3
. Våre resultater identifisert nedre gemcitabin cytotoksisitet IC
50 i celler som uttrykker RRM2 med 3 «UTR (69,34 ± 3,4 nM) sammenliknet med de uten 3» UTR (383,4 ± 20,3 nM). Disse resultater antyder at reduksjonen i RRM2 protein som et resultat av pre-
la-7a-3
overekspresjon ble forenklet ved post-transkripsjonell undertrykkelse av RRM2, selv om RRM2 uavhengige mekanismer vil kunne spille dominerende rolle i annen pre-
la-7
-overexpressing celler (f.eks pre-
la-7F-2
).
Defekt Behandling av pre-
la-7a- 1
i MIA Paca-2
Selv om vi brukte pre-
la-7
medlemmer for å generere alle stabile MIA PACA-2 kloner, funksjonell RNA interferens var ventet å være mediert av moden
la-7
mirnas generert etter en rekke intracellulære RNA prosessering hendelser. På grunn av forskjeller i RRM2 uttrykk og gemcitabin chemosensitization ved overekspresjon av pre
-La-7
medlemmer, vi mistenkte at noen av disse forløperne unnlot å behandle i moden
la-7
former i MIA Paca -2. Derfor, vi kvantifisert relativ moden
la-7
nivåer ved QRT-PCR i ulike pre-
la-7-
uttrykke MIA Paca-2 kloner og sammenlignet dem med mock-transduced MIA PaCa- 2. Interessant, betydelige økninger (gjennomsnitt varierer 2-5 ganger) i modne
la-7
former ble identifisert i alt pre-
la-7
-overexpressing celler testet, med unntak av pre-
la-7-en-en
-overexpressing celler som viste ingen endring i moden
la-7a
nivåer (
fig. 3A
).
En
, Relativ uttrykk for modne former for
la-7
i MIA Paca-2 som stabilt uttrykker pre-
la-7
familiemedlemmer.
Columns, etter at over tre eksemplarer;
barer, etter SD. n = 3.
B, etter Relativ uttrykk for forløperen (
fylte søyler
;
høyre akse
) og Eldre (
åpne barer
;
venstre akse
)
la-7
former i kreft i bukspyttkjertelen celler forbigående uttrykker
la-7a forløpere
.
Columns, etter at over tre eksemplarer;
barer, etter SD. n = 3.
C, etter Skjematisk fremstilling av strukturene i pre-
la-7a-1 Hotell og pre-
la-7a-3
. Sekvenser av modne og passasjer
la-7a
tråder innenfor forløpere er innrammet i kontinuerlige eller stiplede linjer, henholdsvis.
D, etter Mangel på fullstendig spalting av pre-
la-7a-en
-GFP mRNA i MIA PACA-2 celler. MIA PACA-2-celler ble transient transfektert med enten pmirGLO-G-FUD (kontroll), pmirGLO-GFP-pre-
la-7a-en
, eller pre-pmirGLO-GFP-pre-
la -7b
konstruerer, og GFP fluorescens ble tatt til fange. Original forstørrelse, x20. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
. 0,001
Siden defekt miRNA behandling maskineri kunne downmodulate modne mirnas [16], vi neste undersøkt om en slik defekt særlig påvirker
la-7a
biogenesis i bukspyttkjertelkreft. Som vi ikke observere en overekspresjon i moden
la-7a
i MIA Paca-2 (
Fig. 3A
), valgte vi å undersøke, i detalj, uttrykket /behandling av alle tre
la-7a
forløper former (pre-
la-7a-en
, pre-
la-7a-2
, og pre-
la-7a- 3
) som er utledet fra tre separate gener (kromosomale steder 9q22.32, 11q24.1 og 22q13.31, henholdsvis) [27]. Bruke QRT-PCR og primere som enten flankerer hele stammen-løkke struktur (som oppdager miRNA forløpere) eller den modne sekvens (som oppdager modent miRNA), vi kvantifisert intracellulære nivåer av alle tre
la-7a
forløpere samt modne
la-7a
i ulike kreft i bukspyttkjertelen celler forbigående overekspresjon pre-
la-7a-en
, pre-
la-7a-2
, eller pre -.
la-7a-3
Mens forløper skjemaene ble sterkt uttrykt i alle tre tilfeller (3-38 ganger økning), modne
la-7a
var bare konsekvent økt i pre-
la-7a-3
-expressing celler, men ikke i de uttrykker pre-
la-7a-en product: (L3.6pl, MIA Paca-2) (
fig. 3B
). Celler som uttrykker pre-
la-7a-2
viste middels nivå (
Fig. 3B
).
