Abstract
Bakgrunn
kakeksi, eller vekttap til tross for tilstrekkelig ernæring, svekker betydelig livskvalitet og behandlingsrespons hos kreftpasienter. Hos kreftpasienter, skjelettmuskelsvinn, vekttap og dødelighet er alle positivt assosiert med økte serum cytokiner, spesielt interleukin-6 (IL-6), og tilstedeværelsen av den akutte fase respons. Akuttfaseproteiner, inkludert fibrinogen og serumamyloid A (SAA) syntetiseres ved hepatocytter i respons til IL-6 som en del av den medfødte immunrespons. For å få innsikt i forholdet mellom disse observasjonene, studerte vi mus med moderat og alvorlig Colon-26 (C26) -carcinoma kakeksi.
metodikk /hovedfunnene
Moderat og alvorlig C26 kakeksi var assosiert med høyt serumnivå av IL-6 og IL-6 familien cytokiner og høyt liknende mønstre av skjelettmuskulatur genekspresjon. Den øverste kanoniske trasé oppregulert i begge var komplement /koagulasjonskaskaden, proteasome, MAPK signalering, og IL-6 og Stat3 veier. Kakeksi var assosiert med økt muskel pY705-STAT3 og økt STAT3 lokalisering i myonuclei. Stat3 målgener, inkludert SOCS3 mRNA og akutte fase respons proteiner, ble svært indusert i cachectic muskel. IL-6 behandling og STAT3 aktivisering begge også indusert fibrinogen i dyrkede C2C12 myotubes. Kvantifisering av muskel-versus lever fibrinogen og SAA proteinnivåer indikerer at muskelen bidrar med en stor andel av serumakuttfaseproteiner i kreft.
Konklusjoner /Betydningen
Disse resultater antyder at den STAT3 transkriptomet er en viktig mekanisme for å kaste bort i kreft. Gjennom IL-6 /STAT3 aktivering, er skjelettmuskulatur talt til å syntetisere akuttfaseproteiner, og dermed etablere en molekylær forbindelse mellom observasjoner av høy IL-6, økt akutt fase respons proteiner og muskelsvinn i kreft. Disse resultatene tyder på en mekanisme ved hvilken STAT3 kan kausalt innflytelse muskelsvinn ved å forandre profilen av gener som blir uttrykt og oversatt i muskel slik at aminosyrer frigjort ved økt proteolyse i cachexia blir syntetisert til akuttfaseproteiner og eksportert inn i blodet.
Citation: Bonetto A, Aydogdu T, Kunzevitzky N, Guttridge DC, Khuri S, Koniaris LG, et al. (2011) STAT3 Activation i Skeletal Muscle Linker muskelsvinn og den akutte fasen Response i Cancer kakeksi. PLoS ONE 6 (7): e22538. doi: 10,1371 /journal.pone.0022538
Redaktør: Gianni Parise, McMaster University, Canada
mottatt: 6 mai 2010; Godkjent: 29 juni 2011; Publisert: 20.07.2011
Copyright: © 2011 Bonetto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til TAZ fra National Cancer Institute R01 CA122596 (www.nci.nih.gov), fra Statens institutt for generelle medisinske studier R01 GM092758 (www.nigms.nih.gov), fra American Cancer Society stipendiat Grant TBE-111831 (www .acs.org), etter individuell tildeling fra en ACS Institutional Grant til University of Miami, ved Papanicoulau Corps for Cancer Research (www.papcorps.org), av kvinner Cancer Association of University of Miami (www.wcaofum. org), med Wendy Will sak Cancer Fund (www.wwccf.org), av det amerikanske forsvarsdepartementet Breast Cancer Research Program (BCRP) BC045536 (cdmrp.army.mil), og av Amit familien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kakeksi, eller progressive sløse av fett og muskulatur tross tilstrekkelig ernæring, er en gjennomgripende og ødeleggende komplikasjon av kreft [1], [2], [3]. Kakeksi rammer mer enn halvparten av alle kreftpasienter og resulterer i svakhet, redusert livskvalitet, dårlig respons på behandlingen, og mottakelighet for sykdom. Videre, kakeksi i seg selv er ansvarlig for 25-30% av alle kreftdødsfall [1], [2]. For tiden er det ingen godkjente, effektive behandlinger for muskelsvinn i kreft.
klinisk, er kreft kakeksi defineres som vekttapet av minst 5% i nærvær av en underliggende sykdom forbundet med muskel svakhet, tretthet, anoreksi, lav lean body mass og unormal biokjemi, inkludert økt betennelse, anemi og lav serum albumin. Vekttap på 5%, 10% eller 15% totale kroppsvekt er referert til som mild, moderat eller alvorlig cachexia, henholdsvis, og både vekttap og graden av vekttap korrelerer positivt med dødelighet [4]. Årsakene til kakeksi er flere faktorer. Selv om en undergruppe av pasienter opplever tidlig metthet og anoreksi, har studier vist at næringsinntak hos kakektiske pasienter bør være tilstrekkelig til å opprettholde kroppsvekt, men de mister vekt uavhengig [5]. I tillegg kan cachectic pasientene være hypo, normo-, eller hyper-metabolske forhold til hvile energiforbruk, noe som tyder på at endringer av metabolic rate alene ikke kan være ansvarlig for den observerte tap av kroppsmassen [2]. Videre svulst konkurranse for metabolske drivstoff er en utilfredsstillende forklaring av kakeksi, både fordi presisere svulster kan produsere kakeksi og fordi humane svulster på 500 g eller større ikke nødvendigvis indusere sløse [6].
De systemiske metabolske derangements bemerket i cancer cachexia blir også observert med andre former for systemisk inflammasjon [7]. Cytokiner, inkludert tumornekrosefaktor (TNF) /kakektin, interleukin (IL) -1α, IL-1β, interferon-γ, og IL-6 er implisert i kakeksi både ved eksperimentell manipulasjon i musemodeller og ved assosiasjon av serumnivåer i pasienter med kakeksi [6], [7]. IL-6 er et multifunksjonelt cytokin som er involvert i en rekke vertsforsvaret og patologiske prosesser [8]. Andre, og vi har vist at IL-6 administrasjon til mus er tilstrekkelig til å indusere sløse av muskler og fett butikker og i de mest alvorlige tilfellene, til slutt død [9], [10], [11], [12], [13] , [14]. I tillegg, spiller IL-6 en betydelig rolle i å indusere kakeksi i mus med kolon-26 kreftcellelinje og livmorkreft linje, Yomoto, som administrering av IL-6-blokkerende midler reduserer muskelsvinn i disse modellene [15], [ ,,,0],16], [17], [18]. Serum IL-6 er en følsom indikator av vekttap, blant annet hos pasienter med fremskreden småcellet lungekreft [19] og tykktarmskreft [20]. IL-6 og andre gp130 ligander såsom LIF og CNTF antas å mediere kakeksi gjennom en kombinasjon av anoreksi, lipid katabolisme, insulinresistens, og virkninger på proteinsyntese og degradering. Imidlertid, de molekylære reaksjonsveier er regulert ved hjelp av IL-6 i skjelettmuskel som fører til muskelsvinn er ukjent.
IL-6 virker på celler ved å binde til IL-6 reseptor α-kjede (IL-6Rα), også kjent som gp80, enten i sin membranbundet eller oppløselig form, som induserer dimerisering av gp130 og aktivering av de tilknyttede Janus-kinaser (Jaks), som fosforylerer tyrosin gp130 [21]. Disse begivenhetene fører til aktivering av to hovedsignalveier, STAT3, og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK /ERK) kaskade. STAT3 aktivering av tyrosinfosforylering fører til dimerisering og kjernefysisk translokasjon, DNA-binding og modulering av genekspresjon. I samarbeid med c-Jun og ulike former for transkripsjonsfaktor CAAT enhancer-bindende protein (C /EBP), IL-6 signal gjennom STAT3 opp-regulerer akuttfaserespons-protein-genekspresjon i leveren. Den akutte fasen respons er en generalisert respons av det medfødte immunsystemet, som består av rundt 40 gener oppregulert opp til flere tusen ganger ved stimulering [22].
Tisdale og Fearon med medarbeidere har knyttet kreft kakeksi med vedvarende økning i akutte fase respons proteiner i serum [23], [24], [25]. Omtrent 50% av alle kreftpasienter demonstrere økt serum akutt fase respons proteiner ved tidspunktet for kreftdiagnose, og prosentandelen av kreftpasienter med en forhøyet serumrespons øker akutt fase med sykdomsbyrde og trinn [24], [26]. Forhøyede nivåer av fibrinogen er observert i mange maligniteter, inkludert lunge og melanom, og økt uttrykk korrelerer med en dyster utfall [27], [28]. Dagens modeller posit at tumor og verts avledet faktorer indusere proteolyse for å drivstoff en kronisk lever akutt fase respons. Produksjon av akutt fase respons proteiner i leveren krever nedbrytningen av strukturelle proteiner i skjelettmuskel som en kilde for aminosyrer. På grunn av forskjellene i aminosyresekvensen utnyttelse i muskelproteiner versus akuttfase-reaktanter, opp til 2,6 g av muskelprotein eller 12 g av muskelvev kan være bortkastet å syntetisere en g akuttfaserespons-proteiner [29].
søkt å bestemme mulige sammenhenger mellom forhøyet cytokiner, den akutte fasen respons og sløse i kreft. Her kan vi rapportere karakterisering av serum cytokiner og muskelen transkriptomet i kolon-adenokarsinom 26 modell av kreft kakeksi. Vi gir bevis for STAT3 aktivering, målet genuttrykk og den akutte fasen respons i både lever og skjelettmuskulatur i disse musene, og gir en molekylær forbindelse mellom disse observerte fenomener.
Resultater
Colon26 modell kreft kakeksi
Implantasjon av kolon-26 (C26) adenokarcinomceller inn Balb /c eller CD2F1 mus er en klassisk modell av kreft kakeksi [30], [31]. Som i de fleste kreftpasienter, er inntak av mat ikke redusert i C26 kakeksi og IL-6-nivåer er forhøyet [30]. Intervensjoner som reduserer IL-6 i denne modellen også hemme sløse [15], [16], [17], [18]. I våre hender, CD2F1 hunnmus injisert med C26 celler opplevd progressive nedgang i total kroppsvekt (figur 1A-B). Mus ble ofret på 10% vekttap (19 dager etter injeksjon) og 15% vekttap (24 dager), som reflekterer moderat og alvorlig kakeksi. Nedgangen i total kroppsvekt var ledsaget av en forholdsvis større tap av muskelmasse (figur 1C). Quadriceps vekttap 23,7% (
p
0,001 vs. PBS-injiserte kontroller) i moderat cachectic mus og 24,4% (
p
0,001) hos alvorlig cachectic mus. Tilsvarende gastrocnemius muskelvekt falt 25,2% (
p
0,001) i moderat kakeksi og 30,0% (
p
0,001) i alvorlig kakeksi. Slike reduksjoner i muskelmasse er kjent for å skyldes øket proteinnedbrytning på grunn av en aktivering av den proteolytiske maskineri [32], så vel som tap av enkelte muskelproteiner, så som Myosin Heavy Chain (MyHC) [33]. I samsvar med et tap i muskelprotein, ble løselig quadriceps proteininnhold (som målt i standard proteinekstrakter) redusert i begge sykdomstilstander (Figur 1G). Videre MyHC ble betydelig redusert i både moderat (-69%, p 0,01) og alvorlig (-81%, p 0,01). Kakeksi (figur 1E-F)
A, B, kroppsvekt endringer for kontrollmusene og for mus injisert med C26 tumorceller. Mus avlives på dag 19 hadde mistet ~ 10% av kroppsvekten, vurderes som moderat kakeksi. Mus avlives på dag 24 hadde mistet ~15% av kroppsvekten, anses alvorlig kakeksi. C, betydelig redusert quadriceps og gastrocnemius vekt ble observert med C26 kakeksi. Forskjellene var ikke signifikant i musklene fra moderat versus alvorlig kakeksi. D, levervekt og tumor vekt både økt med alvorlighetsgrad /varighet på kakeksi. E, Representant Western blotting for Myosin Heavy Chain (MyHC) i quadriceps muskel fra både kontroll og svulst bærende mus. F, Densitometrisk kvantifisering av Western blotting for MyHC protein viser en markant reduksjon i både moderat (-69% vs. kontroller) og alvorlig (-81% vs. kontroller) kakeksi. G, totalt proteininnhold i quadriceps muskelen fra kontroll- og tumor-bærende mus. Proteininnholdet er betydelig redusert i både moderat (-7% vs. kontroller) og alvorlig (-13% vs. kontroller). n = 4-5 per gruppe; ** P 0,01, *** P. 0,001
I motsetning til muskelsvinn, total levermasse økte 17,3% (
p
0,01) i moderat kakeksi og 36,4% (
p
0,001) i alvorlig cachexia (figur 1D). Tumorstørrelse også øker med tiden og sløse (figur 1D), det samme gjorde milt størrelse (data ikke vist).
Plasma analytt profilering av både moderat og alvorlig cachectic mus viste at sirkulerende nivåer av IL-6 og andre tre gp130 ligander, IL-11, leukemi-inhiberende faktor (LIF) og Oncostatin M ble signifikant økt i tumorbærende mus (tabell 1). Nivåer av tumornekrosefaktor (TNF), IFN-y og IL-1a, tre andre cytokiner ofte forbundet med kakeksi, ble signifikant forhøyet i tillegg. Serumnivåer av IL-6 som reagerer akutt fase reaktanter fibrinogen, haptoglobin og von Willebrand faktor ble også markert indusert som respons på svulsten. I motsetning til hos mennesker, er C-reaktivt protein (CRP) ikke en akuttfaseprotein hos mus, og ble ikke forhøyet i kakeksi. Denne økning av plasma-IL-6 og de akutte fase respons proteiner, kombinert med økningen i leveren massen er i samsvar med de kjente virkninger av IL-6 i mediering av den hepatiske akutt fase respons [13], [34], [35], [36], [37]. Resultatene i mus med C26 svulster parallelt foreningen av IL-6 og akutt fase respons med muskelsvinn hos kreftpasienter.
transkripsjon profil av C26 modellen av kreft kakeksi
Vi søkte å identifisere endringer i muskel genekspresjon forbundet med å kaste bort. Microarray analyse og data normalisering ble utført på RNA isolert fra quadriceps av mus med moderat eller alvorlig C26 kreftkakeksi og ikke-tumorbærende kontroller. Unsupervised hierarkisk klassifisering av prøvene tydelig atskilt kontroll muskel, moderat bortkastet og sterkt bortkastet prøver (Figur 2A).
A, Heat kartet quadriceps genuttrykk i C26 kakeksi viser tydelig gruppering av gener ved eksperimentelle grupper. Prøvene er normalisert til kontrollene. Blå indikerer nedregulert gener, gule oppregulert gener, og svart ingen endring. Bare gener med
P
0,05 ved enveis ANOVA vises. B, Sammenligning av genuttrykk i moderat og alvorlig C26 cachexia (NextBio).
Statistisk analyse ble utført for å identifisere gener som utviser signifikante endringer i uttrykk under kakeksi. Blant 45,281 transkripsjoner, ble 1607 gener funnet å være forskjellig uttrykt i moderat kakeksi og 1328 i alvorlig avmagring (-2≤ ganger endring ≥2,
p
0,05) (figur 2B). Totalt, 700 gener ble uttrykt i felles i moderat og alvorlig cachexia, hvorav alle unntatt 5 ble regulert i samme retning i begge gruppene (Tabell S2). De 30 beste gener ved sammenleggbar endring reguleres i hver av moderat og alvorlig cachexia er vist i tabellene 2 og 3. Av de resterende 907 var unik til moderat cachexia (tabell S3) og 628 til alvorlig cachexia (tabell S4). Likhet av genuttrykk mellom de to gruppene var statistisk signifikant (
p
= 1,0 e-323). Til tross for mange betydelig endret gener, de fleste gener som vanligvis anses å være «housekeeping» gener og brukes for normaliseringsstrategier var ikke annerledes blant grupper. Nærmere bestemt, gylceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), beta-aktin (ACTB), b-aktin (ACTB), 18S RNA (RN18S), aldolase (ALDOA, ALDOB, ALDOC) og de fleste tubulins (TUBA2, TUBB1, TUBB2a, TUBB2c, TUBB3, TUBB4, TUBG1, TUBG) var uendret.
kjent muskelvekst regulatoriske gener
muskel sløse av praktisk talt alle årsaker er assosiert med økt uttrykk av skjelettmuskulatur ubiquitin E3 ligaser, Trim63 /Murf-en og Fbxo32 /Atrogin-1 [38], [39], [40]. Begge ble markert økt i vår microarray analyse, med en større økning i Trim63 /Murf-en kontra Fbxo32 /Atrogin-en og høyere uttrykk i moderat mot alvorlig avmagring (figur 3). Disse trendene ble bekreftet av kvantitativ real-time RT-PCR. Muskelatrofi er også assosiert med redusert ekspresjon av RNA som koder for strukturelle proteiner. Faktisk, ved microarray og QRT-PCR, hjerte alfa aktin og myosin tung kjede 8 ble nedregulert, mer alvorlig versus moderat sløse. Disse resultatene er i samsvar med rapporter fra andre i C26 kakeksi [33].
En, Expression av ubiquitin ligaser, Fbxo32 /Atrogin-en og Trim63 /MuRF1 induseres av microarray og qPCR analyse. Uttrykk av gener som koder for muskel strukturelle proteiner, inkludert ACTA1 og MHY8 er redusert. B, genuttrykksmønster i C26 kakeksi kartlagt på en skjematisk av muskelvekstregulering veier. Gener med demonstrerte vekstfremmende aktivitet i muskel er vist i grønt, veksthemmende gener i rødt. Tallet til venstre representerer fold-endring i moderat kakeksi og rett i alvorlig kakeksi, med pilen indikerer retningen på endringen. Gener med ingen verdier ble heller ikke endret eller ikke til stede i datasettet.
Pathway analyse
For å identifisere molekylære stier regulert i respons til C26-indusert kakeksi, Gene profiler fra quadriceps for kontroll, moderat og alvorlig cachexia ble analysert ved hjelp av NextBio (figur 4). Av de 20 Broad MSigDB kanoniske trasé oppregulert i både moderat og alvorlig kolon-26 kakeksi, åtte var relatert til betennelse, inkludert komplement og koagulasjon trasé, IL-6, Stat3, JAK-STAT, cytokin og Toll-like receptor trasé. Pathways knyttet til proteosomet, mitogen aktivert proteinkinase (MAPK), cellesyklus, muskelkontraksjon, epidermal vekstfaktor, ErbB og mTOR signale ble også øket.
A. De 20 beste Broad MSigDB kanoniske veier betydelig oppregulert ved moderat og alvorlig kakeksi versus kontroller. Pink barer (øvre akse) representerer betydningen av overlappingen. Trekantene (moderat kreftkakeksi) og sirkler (alvorlig cachexia) (nedre akse) betegne antall gener differensielt uttrykt i den veien. Røde piler indikerer veier relatert til IL-6 /STAT3 /betennelse. B, topp 20 Broad MSigDB kanoniske veier betydelig nedregulert i moderat og alvorlig kakeksi versus kontroller. Grønne felt (øvre) akser representerer betydningen av overlappingen. Trekantene (moderat kreftkakeksi) og sirkler (alvorlig kreftkakeksi) (nedre akse) som ovenfor.
Den øverste kanoniske trasé nedregulert var knyttet til skjelettmuskulatur sammentrekning, peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor-γ coactivator -1α, kalsium regulering, ekstracellulære matrix interaksjoner, skjelett myogenesen, og insulin og WNT signalering, blant andre.
STAT3 aktivering og målet genuttrykk i C26 kakeksi
Gitt prominence av cytokin /IL-6 /Stat3 baner i microarray analyse, forsøkte vi å karakterisere uttrykk for Stat3 samspill gener i vår modell. Genomatix Bibliosphere ble brukt til å generere en liste over de 124 dokumenterte fysiske og funksjonelle interaksjoner med STAT3 i ulike systemer (tabell S5). Av disse 26 gener viste signifikant regulering i de moderate og alvorlig bortkastede prøver (figur 5A)
A:. Heat kartet genuttrykk endringer av Stat3 og co-sitert genprodukter, som er identifisert av Genomatix Bibliosphere. Blå indikerer ned regulerte gener, gul opp regulert, og svart ingen endring. Bare gener med P 0,05 ved enveis ANOVA vises. B: En undergruppe av Stat3 målgener identifisert gjennom litteratur er forskjellig regulert i moderate og alvorlige kakeksi versus kontroller. C: STAT3 og dets målgener SOCS3 og CEBPD er økt på mRNA-nivå ved mikromatriser og qPCR. D: Protein nivåer for p-STAT3 og STAT3 i proteinekstrakter fra quadriceps, gastrocnemius og lever evaluert ved Western blotting-analyse. E: SOCS3 protein nivåer. F: kvantitativ analyse av p-STAT3 /STAT3 og p-STAT3 /GAPDH-forholdet (uttrykt som fold-endring versus kontroller). G: kvantitativ analyse av SOCS3 protein nivåer (uttrykt som fold-endring vs. kontroller). GAPDH ble anvendt som en intern referanse for å bekrefte lik belastning. n = 3-5 per gruppe; * P 0,05, ** P 0,01, *** p 0,001 vs. Controls,
$ P. 0,05 vs. moderat
Vi har også spurt om STAT3 målgener var også indusert. Undersøkelse av litteraturen resulterte i identifikasjon av 186 validerte STAT3 målgener identifisert i flere forskjellige arter og systemer (tabell S6) [41], [42], [43], [44], [45], [46]. Av disse 39 ble uttrykt i enten moderat eller alvorlig kakeksi eller begge (figur 5B).
Blant de kjente Stat3 målene økte i quadriceps i moderat og alvorlig kakeksi var Stat3 selv og transkripsjonsfaktor CCAAT /enhancer-binding protein δ (C /EBP δ) [47]. Begge transkripsjonsfaktorer deltar i induksjon og vedlikehold av akutt fase respons genekspresjon, inkludert fibrinogen, serum amyloid A, haptoglobin, og lipid-bindende protein [47] – [48] [22]. C /EEBPδ har også blitt vist å indusere ekspresjon av myostatin [49], en negativ regulator av muskelmasse [3], [50]. Microarray resultatene ble bekreftet av qPCR og demonstrerte robust induksjon av STAT3, C /EBPδ og akuttfase-responsgener i moderat og alvorlig cachexia. STAT3 også er kjent for å indusere uttrykk for sin egen tilbakemeldinger hemmer, lyddemper cytokin Signa-3 (SOCS3). Faktisk SOCS3 ble økt på mRNA-nivå i kakeksi (figur 5C).
Alt dette robust STAT3 målet genuttrykk antydet at STAT3 aktivitet ble økt i kakeksi. STAT3 aktiveres delvis av fosforylering ved Y705, som induserer dimerisering, nukleær translokasjon og DNA-bindings [51], [52]. Western blotting-analyse av muskelekstrakter viste økt pY705-STAT3 nivåene i både quadriceps og gastrocnemius av mus som bærer C26 tumor, i både moderat og alvorlig cachexia (figur 5 D). Analogt ble det observert en markert økning i pY705-STAT3 nivåer i lever (figur 5 D-F). Interessant nok SOCS3 ble funnet å være bare minimalt opp regulert på proteinnivået i moderat kakeksi i quadriceps og ikke i det hele tatt i quadriceps i alvorlig cachexia, mens den ble nedregulert i gastrocnemius prøver i både moderat og alvorlig cachexia (figur 5 E- G). I motsetning til dette SOCS3 var uforandret i leverprøver fra både kontroll- og kakeksi mus (figur 5 E-G). I samsvar med økt muskel pY705-Stat3 nivåer, generell økt kjernekraft pSTAT3 nivåer og myonuclei lokalisering ble observert i muskel fra mus med C26 kakeksi (Figur 6A-B).
A, p-STAT3 protein nivåer er økt i kjernekraft ekstrakter fremstilt fra quadriceps av alvorlig cachectic C26 tumor-bærende mus sammenlignet med kontroller. n = 5 per gruppe. B, Immunofluorescensanalyse utført avslører økt pSTAT3 lokalisering i myonuclei av gastrocnemius fra alvorlig cachectic C26 tumor ruste mus (grønn). Nuclear farging er vist i blått (DAPI).
Skjelettmuskulatur er en stor bidragsyter for akutt fase respons produksjon
Gitt robust induksjon av akutt fase genet RNA i kakeksi (figur 5 ), forsøkte vi å bekrefte uttrykk på proteinnivå. Ved Western blotting-analyse, ble nivåene av det utskilte proteinet fibrinogen i quadriceps ekstrakter øket 2-12 ganger i mus med C26 kakeksi versus kontrollene, avhengig av hvilken båndet er kvantifisert (figur 7A). I leveren, ble fibrinogen protein nivåer økt 2-5 ganger (figur 7A). Å måle fibrinogen signal mot en standardkurve av renset muse-fibrinogen, normale quadriceps inneholdt ca. 0,9 ng fibrinogen pr ug protein, mens quadriceps i C26 kakeksi inneholdt 1,9 ng /ug (figur 7B), en ~ 2-gangers økning. Normal lever inneholdt 1,8 ng /ug fibrinogen, mens lever i C26 kakeksi inneholdt 5,2 ng /ug fibrinogen, et ~3-dobling. Fibrinogen ekspresjon ble også øket i quadriceps samt leveren som svar på administrering av IL-6 (figur 7B), som tyder på dette kan være en generell reaksjon for betingelser med høy IL-6, og er ikke begrenset til kreft.
EN. Western blotting og kvantifisering av fibrinogen nivåer i kontroll og C26 quadriceps og leveren. Data (gjennomsnitt ± SEM) uttrykkes som relativ densitometry verdi. ** P 0,01, *** P 0,001. B, Western blotting-analyse av fibrinogen standardproteiner og quadriceps og leverekstrakter for kontroll, CHO-IL6 injisert nakne mus og C26 injiseres CD2F1 mus. Kvantifisering ble utført på bandet som indikeres av pilen. Data (betyr ± SEM) er uttrykt som ng fibrinogen /mikrogram protein. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001. C, demonstrerer Western blotting-analyse betydelig økt fibrinogen og SAA1 proteinnivåer i quadriceps og gastrocnemius i moderat og alvorlig C26 kakeksi. * P 0,05, ** P 0,01, *** P . 0,001
Resultatene i figur 7A og 7B viser at omfanget av fibrinogen induksjon og syntese i quadriceps er lik den som er i leveren. Fibrinogen uttrykk ble også økt i gastrocnemius i moderat og alvorlig cachexia (figur 7C), noe som indikerer at fibrinogen er sannsynligvis mye uttrykt i skjelettmuskulatur. Proteinnivåer av SAA1 ble også øket i quadriceps og gastrocnemius ved hjelp av Western blotting-analyse, noe som tyder på at skjelettmuskel kan uttrykke proteiner for de fleste eller alle av de akutte faseresponsgener som induseres på mRNA-nivå.
Dyrkede skjelettmuskelfibre uttrykke akutt fase respons proteiner i respons til IL-6 eller STAT3 aktivering
til tross for induksjon av fibrinogen og SAA mRNA i muskler, protein nivåene av akuttfaseproteiner i skjelettmuskelekstrakter teoretisk kunne være på grunn av forurensende plasma. For ytterligere å teste vår hypotese at fibrinogen er produsert direkte fra skjelettmuskel etter aktivering av IL-6 /STAT3 vei, infisert vi C2C12 murine myotube kulturer med en rekombinant adenovirus som uttrykker et konstitutivt aktivert form av STAT3, cSTAT3 [53], langs med GFP som en markør. Western blotting av C2C12 ekstrakter 48t etter smitte påvist betydelig heving av fibrinogen i Ad-cSTAT3-GFP kulturer versus Ad-GFP kulturer (+ 86% vs. GFP, p 0,01; Figur 8A). For å bestemme hvorvidt fibrinogen ble fremstilt etter IL-6 utfordrende, ble C2C12 myotubes eksponert overfor murine rekombinant IL-6 i opptil 48 timer. Dette resulterte i en generell økning i fibrinogen, både i cellekammeret ved Western blotting (figur 8B) og i kulturmediet ved hjelp av ELISA (figur 8C). Disse forsøk viser at selv i fravær av andre celletyper og vev, skjelettmuskelceller svare til IL-6 og aktivering av STAT3 ved å syntetisere akuttfaseprotein RNA og proteiner til sekresjon.
A, Western blotting-analyse og kvantifisering av fibrinogen i C2C12 myotubes infisert med Ad-cSTAT3-GFP eller Ad-GFP som kontroll. Fibrinogen ekspresjon ble øket i overensstemmelse med økningen i nivåene av STAT3. ** P 0,01, *** P 0,001 vs. GFP. B, Western blotting-analyse og kvantifisering av fibrinogen ekspresjon i C2C12 behandlet med IL-6 (100 ng /ml) i 1, 24, 48 timer. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. Øket ekspresjon av fibrinogen ble observert ved hvert tidspunkt etter IL-6-behandling. Data (betyr ± SEM) uttrykkes som relativ densitometry verdi. *** P 0,001 vs. respektive kontroller. C, fibrinogen nivåer ved ELISA av det kondisjonerte medium av C2C12 eksponert for IL-6 i 30 minutter, 1, 6, 24, 48 timer. Fibrinogen nivåer ble signifikant forhøyet etter 6, 24 og 48 timer av IL-6-behandling. Data (gjennomsnitt ± SEM) er uttrykt som ng /ml. ** P 0,01, *** P. 0,001 vs. kontroller (C)
Diskusjoner
Vi har søkt å etterligne den høye serum IL-6, akutt fase respons og muskelsvinn av pasienter med kreft kakeksi. Vi valgte C26 adenokarsinom, som oppviser øket sirkulerende nivåer av IL-6 som sammenfaller med muskelsvinn [15]. Enkelte kloner av den C26 som ikke forårsaker kakeksi sammentreffet ikke produserer IL-6 [54], [55], [56]. I samsvar med en forårsakende rolle i muskelsvinn hos mennesker, sirkulerende IL-6 er blitt rapportert å være en markør for vekttap hos pasienter som lider av forskjellige former for kreft [19]. Videre direkte administrering av IL-6 til mus induserer systemisk muskelsvinn. Konsistensen av en slik muskelsvinn på tvers av ulike ruter av IL-6 administrasjon, blant annet ved direkte injeksjon av rekombinant IL-6 [11], ved å transgenesis [57], ved implantering av osmotisk pumpe som ga rekombinant IL-6 [13], ved injisering av IL-6-uttrykkende CHO-celler i atymiske nakne mus [12] – [13], og ved transfeksjon av plasmid DNA som koder for IL-6 [14], [58], vitner om styrken av hvilke IL-6 bevirker at cachectic fenotype .
Uansett er IL-6 sannsynlig ikke den eneste cytokin formidling muskelsvinn i kreft eller i C26-modellen. Inhibering av IL-6 bare delvis befrir muskelsvinn i C26-modellen, forårsaker noen til å konkludere med at IL-6 er bare en av flere spillere som er involvert i den C26-modellen og kan ikke i seg selv fremkalle den fulle cachectic syndrom [16]. De andre cytokiner vi observert økt i C26 mus som også kan spille en rolle i muskel sløse inkluderer IL-6-familien ligander som LIF, samt TNF-a, IFN-gamma, som alle kan indusere kakeksi uavhengig. Zhou et al. nylig hypotese IL-6 kan tjene kun en marginal rolle i kakeksi [59]. I overensstemmelse med tidligere studier [60], rapporterte de at myostatin inhibering ved anvendelse av en oppløselig reseptor-fusjonsprotein som er utviklet av Lee et al. [61] redusert muskeltapet i C26-modellen. Serum IL-6 nivåer i slike mus var ikke forskjellig fra kontroll-behandlede C26-mus. I tillegg, forfatterne ikke var i stand til å indusere muskeltapet i mus som fikk rekombinant IL-6 ved osmotisk pumpe. De konkluderer med at muskellaget i kreft kakeksi kan avhenge av myostatin og beslektede ligander i stedet for på pro-inflammatoriske cytokiner alene. En alternativ tolkning av disse data, er imidlertid at myostatin hemming resulterer i muskel hypertrofi, som balanserer IL-6 eller et annet cytokin-indusert muskelsvinn. For det andre er det også sannsynlig at forfatterne ikke oppnådd en tilstrekkelig dose av IL-6 til virkning sløse. De brukte humant IL-6, som har en 5- til 10-ganger lavere aktivitet enn muse-IL-6 på murine celler [62], ved nivåer 40-60 ganger mindre enn de som er rapportert å indusere alvorlig avmagring [13]. (ED
50 for rekombinant, humant IL-6 i T1165.85.2.1 mus plasmacytom-analysen er 0,2-0,8 ng /ml, mens den er 0.02-0.06 ng /ml for rekombinant murint IL-6.) Således kan den overvekt av bevis indikerer at IL-6 kan føre til muskelsvinn. Om effekten er direkte eller indirekte er fortsatt uklart, og hva mekanisme fører til muskelsvinn er fortsatt ukjent.
Her er vi dokumentere at STAT3 pathway er aktivert i skjelettmuskulatur i C26-bærende mus og som uttrykk for STAT3 mål gener, inkludert de akutte fasen responsgener er aktivert.
