Abstract
TMPRSS2 /ERG (T /E) fusjonsgenet er til stede i de fleste av all prostatakreft (PCA). Vi har tidligere vist at NF-kB signale er sterkt aktivert i disse T /E fusjon uttrykke celler via fosforylering av NF-kB p65 Ser536 (p536). Vi har derfor hypotese at målretting NF-kB signale kan være en effektiv metode for undergruppen av PCas som bærer T /E fusjoner. Celastrol er et velkjent NF-kB-inhibitor, og således kan hemme T /E-fusjonsuttrykk PCa cellevekst. Vi vurderte derfor Celastrol effekter
in vitro Hotell og
in vivo
i Vcap celler som uttrykker T /E fusjonsgenet. VCap-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Celastrol og veksthemming og mål-ekspresjon ble evaluert. For å teste sin evne til å hemme veksten
in vivo
, 0,5 mg /kg Celastrol ble brukt til å behandle mus med subkutane Vcap xenografttumorer. Våre resultater viser Celastrol kan hemme veksten av T /E fusjon uttrykker PCA celler både
in vitro Hotell og
in vivo
gjennom målretting tre signalbaner: AR, ERG og NF-kB i disse cellene. Når mus fikk 0,5 mg /kg Celastrol til 4 ganger /uke, ble signifikant vekstinhibering sett med ingen åpenbar toksisitet eller betydelig vekttap. Derfor er Celastrol en lovende kandidat medikament for T /E fusjon uttrykke PCa. Våre funn gir en ny strategi for målrettet behandling som kan være til nytte for mer enn halvparten av PCA pasienter som har T /E fusjon uttrykker PCas
Citation. Shao L, Zhou Z, Cai Y, Castro P, Dakhov O, Shi P, et al. (2013) Celastrol Undertrykker tumorcellevekst gjennom målretting en AR-ERG-NF-kB Pathway i TMPRSS2 /ERG Fusion Gene Uttrykke prostatakreft. PLoS ONE 8 (3): e58391. doi: 10,1371 /journal.pone.0058391
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 5. desember, 2012; Godkjent: 04.02.2013; Publisert: 06.03.2013
Copyright: © 2013 Shao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet Prostate Cancer Research program (DOD W81XWH-08-1-0055, JW) og NCI til Dan L. Duncan Cancer Center menneskelig vev og patologi Kjerne (NCI: P30CA125123). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en heterogen sykdom som fortsatt dårlig forstått. Trasé endret ved høy frekvens i spesielle pasienttumortyper må være bedre definert før utforme individuelt målrettet terapi. Oppmuntrende, i løpet av de siste få år viktig fremskritt har blitt gjort i den underklassifikasjon av PCa, spesielt funnet at det TMPRSS2 /ERG (T /E) fusjonsgenet er til stede i de fleste PCas og er således den mest vanlige genetiske lesjon oppdaget i PCa [1], [2], [3]. Mange studier har konsekvent vist at T /E fusjonsgenet kan fremme PCa invasjon og i mindre grad proliferasjon og differensiering minke [4], [5]. Den høye frekvensen av denne endring og dens viktig rolle i PCa tumorbiologi gjør det til et utmerket terapeutisk mål i PCa. Vi har vist at stabile shRNA uttrykk som er spesielt rettet mot T /E fusion transkripsjoner reduserer tumorvekst betydelig
in vivo
, men de har ikke helt eliminere den [6], indikerer behovet for kombinasjonsterapi som kan overvinne motstand og /eller svak respons på enkelt målrettet behandling. Våre studier viser at NF-kB signalering, spesielt fosforylering av NF-kB p65 Ser536 (p536) er sterkt aktivert i disse T /E fusion uttrykker celler via ERG [7]. NF-kB-signalering er vist tidligere å spille en viktig rolle i PCa vekst, angiogenese, tumorigenese og metastatisk progresjon [8], [9], [10], [11], [12]. Gitt de pleiotrope effekter av NF-kB for tumorprogresjon, hypoteser om vi at målretting NF-kB signalering kan være en effektiv metode for undergruppen av PCas som bærer T /E-fusjoner.
I de senere år er det en økende interesse for identifisering av potente og bioaktive molekyler fra naturlige kilder, inkludert tradisjonell kinesisk medisin [13], [14]. Noen av disse molekylene kan tilby pasientene tryggere langsiktige terapeutiske muligheter [15]. Celastrol, en farmakologisk aktiv forbindelse fra ekstrakt av den kinesiske Thunder Gud Vine som har blitt brukt i Kina i hundrevis av år, har fått stor oppmerksomhet den siste tiden på grunn av sin betydelige anti-inflammatorisk og anti-kreft aktiviteter [16], [17] . Mange studier har vist at Celastrol kan modulere multiple signalbaner som er involvert i sykdoms og derfor oppviser potensiell terapeutisk effekt mot ulike kroniske sykdommer og kreft [16], [17]. Celastrol har vist seg å hemme veksten av mange typer kreftceller og undertrykke tumor initiering, progresjon og metastase i forskjellige dyremodeller
in vivo
, herunder brystkreft [18], lungecancer [19], kreft i bukspyttkjertelen [20], gliom [21], og føflekkreft [19] samt PCa [22], [23], [24], og så langt har blitt rapportert ingen vesentlige bivirkninger. Mange viktige molekylære mål av Celastrol har blitt identifisert, inkludert NF-kB, HSP90, proteasome, VEGFR, AKT /mTOR, c-Jun og andre [16], [18], [22], [25], [26] , [27], men inhibisjon av NF-kB vei synes å redegjøre for mye av sin terapeutiske effekt.
til tross for den høye frekvensen av T /E fusjon påvises ved PCA pasienter, bare en vanlig brukt PCa cellelinje ( Vcap) endogent uttrykker T /E fusjon. Det er en androgen avhengig cellelinje og uttrykker høyt nivå av AR, som kan drive ekspresjon av ERG under kontroll av AR avhenger TMPRSS2 promoter. Det viser også høy grad av p536, sammenlignet med nesten umulig å oppdage ekspresjon i andre vanlig anvendte PCA-cellelinjer, blant annet LNCaP, PC3 og DU145 [7]. Vi har derfor brukt VCap i våre studier. Her viser vi at Celastrol er en potent p536 inhibitor som i betydelig grad kan hemme Vcap cellevekst både
in vitro Hotell og
in vivo
. I tillegg er våre data indikerer en roman signaliserer kaskade av AR-ERG-p536 målrettet av Celastrol. Satsingen på AR-ERG-NF-kB ved Celastrol er romanen og blir sett selv når T /E fusjon uttrykker PCA celler er utsatt for svært lave konsentrasjoner av Celastrol. Under slike forhold, den andre rapporterte store veier forblir upåvirket. Basert på alle bevis og dens potente biologiske effekter, kan Celastrol ha potensial klinikk bruk for pasienter som bærer T /E fusjon i sine PCA svulster.
Materialer og metoder
Cell Culture
VCap-celler ble opprettholdt i DMEM (høy glukose) med 10% føtalt bovint serum (FBS). VCap-Luc-celler som uttrykte luciferase anvendes for levende dyr avbildning ble opprettholdt i DMEM-medium samme, men med 2 ug /ml puromycin [6]. LNCaP, PC3 og DU145 ble dyrket i RPMI med 10% FBS.
Western blotting
ERG anti-kanin antistoff (1:2000) ble hentet fra Epitomics, Inc (Burlingame, CA, USA , katt # 2805-1). AR-V7 (AR3) antistoff ble kjøpt fra A G Precision Antistoff ™ (Columbia, MD, USA, katt # AG10008) og brukes som 1:1000 fortynning. Anti-p65, fosfo-p65 Ser536, AR, IKBα, HSP90, total-AKT og fosfo-AKT Ser473 ble alle erholdt fra Cell Signaling Technology, Inc (Danvers, MA, USA) og ble anvendt ved 1:1000 fortynning for Western blotting ved bruk av prosedyrer som tidligere er beskrevet [28]. Anti-β-actin kontroll ble utført som beskrevet tidligere [28]. Blot signalene ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific, Inc) og eksponert og fremkalt med filmer eller Bio-Rad bildesystem og kvantifisert ved et densitometer hjelp Antall One (versjon 4.5.2, Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA ).
Kvantitativ real-time PCR
T /E fusjon og β-aktin primere ble som tidligere beskrevet [3]. 5 pl av det cDNA templat (1:20 fortynning) ble anvendt i et sluttreaksjonsvolum på 15 ul. The Master mix for sanntids PCR inneholdt 2 mM MgCl2, 0,4 mM hver forover og bakover primere og 7,5 mL av DNA Master SYBR GREEN (2 ×, Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). Sanntids-PCR ble utført ved bruk av ABI instrument fra, etterfulgt av en tre-trinns PCR protokoll med forskjellig glødetemperatur er vist nedenfor. Grunning for AR, AR3, p65 og CCL2 var: AR RTF: 5′-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 «; AR RTR: 5»-GGGCTGACATTCATAGCCTTCAATGTGTGAC-3 «; AR3 RTF: 5»-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 «; AR3 RTR: 5»-TGCCAACCCGGAATTTTTCTCCC-3 «; P65 RTF: 5»-CTGCAGTTTGATGATGAAGA-3 «; P65 RTR: 5»-TAGGCGAGTTATAGCCTCAG-3 «; CCL2 RTF: 5’TCTCAGTGCAGAGGCTCG -3 «; CCL2 RTR: 5’GTTTGGGTTTGCTTGTCCAG -3 «. Den relative ekspresjon ved ΔCt mellom ulike forsøksgrupper ble samlet og normalisert til p-actin-uttrykk.
Proliferation Assay
1 x 10
5-celler ble sådd på 24-brønners plater i triplikat og festede celler ble telt ved anvendelse av en celleteller som tidligere beskrevet [29]. Celastrol ble kjøpt fra Sigma-Aldrich LLC. (Cat # C0869) og oppløst i DMSO som anbefalt. For Vcap celler Celastrol behandling ble startet 48 timer etter seeding. LNCaP, PC3 og DU145 cellene ble behandlet med Celastrol 24 timer etter første seeding. Forskjellige doser av Celastrol ble påført på hver forsøksgruppe. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
VCap-Luc Subkutan Mus Model
Tolv uker gamle nakne mus ble anvendt. 4 x 10
6 VCap-celler som uttrykte luciferase (VCaP- Luc-celler) ble blandet med 100 ul matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) i et totalvolum på 200 ul og injisert subkutant. Tumorvekst ble overvåket ukentlig etter første injeksjon ved hjelp av IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA, USA) [6]. Seksten mus viste en 1 × 10
5 luminans lese en uke etter injeksjon og ble inkludert for behandlingsforsøk. De ble tilfeldig delt inn i 2 eksperimentelle grupper på 8 mus i hver gruppe. Mus i behandlingsgruppen ble injisert intraperitonealt (i.p.) med 200 pl 0,5 mg /kg Celastrol oppløst i 3% DMSO og PBS, mens kontrolldyrene mottok 200 ul av kjøretøyet (3% DMSO og PBS). Behandlingen ble utført 4 ganger per uke i 3 uker. Musevekter ble målt to ganger ukentlig. Mus ble avlivet 24 timer etter den siste injeksjonen og primære tumorer ble skåret ut, veiet, og en porsjon av tumoren ble frosset i flytende nitrogen for molekylær analyse, og en annen del med fast og parafin-innleiret. Obduksjon ble også utført på mus for å utelukke bivirkninger av behandlingen. Forskjeller i gjennomsnittlig tumorstørrelse blir undersøkt ved t-test. Protein og RNA ekstrakter ble forberedt for videre analyse. En vev microarray (TMA) ble fremstilt for IHC analyse. Alle prosedyrer ble godkjent av Baylor College of Medicine Institutional Animal bruk og vedlikehold Committee (IACUC protokollen nummer # AN-4542).
Immunohistochemistry Hotell og analyse av apoptose
Immunohistochemistry (IHC) av VCap subkutane tumorer ble utført ved anvendelse av anti-fosfo-p65-Ser536 og ERG som beskrevet tidligere [7], [29]. En mus monoklonalt anti-AR fra Biocare Medical, Concord, CA, USA (Cat # CM109) ble brukt for IHC å vurdere AR uttrykk i tumordelene med 1:50 fortynning. Lysbilder ble fotografert med et Nikon Eclipse E400 mikroskop koblet med Nuance multispektrale Imaging System 40 × eller 200 × forstørrelser med 3,3 megapikslers oppløsning. For Ki-67 og CD31 IHC og TUNEL, ble bildene lagres som JPEG-filer med 4-6 bildene ble tatt for hvert bilde, som dekker hele svulsten området. Tallverdien for prosent farget (PS) bestemmes ved hjelp av Image J programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/) og sammenlignet ved hjelp av t-tester.
Resultater
Celastrol er en potent p536 Inhibitor
Gitt funn at NF-kB signale er sterkt aktivert i T /E fusjon uttrykke celler, forsøkte vi å teste hypotesen om at målretting NF-kB signalering kan være en levedyktig terapeutisk tilnærming for T /E fusjon uttrykke PCa. Derfor vurderte vi flere kandidat NF-kB-hemmere, inkludert to aktiverings hemmere NF-kB (481407 sammensatte og Celastrol) og MG132, en NF-kB hemmer fungerer på nivå med proteasomhemmingen [9], [30]. Som vist på fig. 1A, kan Celastrol betydelig avskaffe p536 i VCap-celler når de anvendes i en konsentrasjon på 2 uM i 18 timer, mens de andre to NF-kB-inhibitorer 481 407 (2 uM) og MG132 (2,5 uM) [9] viste ingen slik virkning, som gjorde PS1145 (data ikke vist). Inhiberingen av p536 ekspresjon ved Celastrol var tydelig selv med en 2 timers behandling ved 0,05 uM Celastrol som resulterer i en større enn 60% reduksjon av p536 ekspresjon (Fig. 1B), som indikerer Celastrol er en potent inhibitor p536.
(A) VCap-celler ble behandlet med forskjellige NF-kB-inhibitorer i 18 timer. Western blot viser at Celastrol 2 mikrometer for 18 timer behandling i betydelig grad kan hemme p536 uttrykk mens 481 407 (2 mm) og MG132 (2,5 mm) nesten ikke hadde noen innvirkning på p536 uttrykk. I tillegg til p536, dramatisk redusert AR og ERG uttrykk ved protein-nivåer ble sett i Celastrol behandlede gruppe, men de blir ikke redusert med to andre inhibitorer. er vist duplikate brønner for hver gruppe. β-aktin ble benyttet som kontroll. (B) VCap-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av celastrol i 2 timer. Betydelig reduserte p536 ekspresjon ble observert i alle grupper ved western blot, inkludert den laveste konsentrasjon gruppe på 0,05 uM, er sterkt tyder Celastrol en potent inhibitor p536. β-actin var kontrollen.
Det er blitt rapportert at Celastrol kan hemme AR-ekspresjon i LNCaP-celler [22]. Hvis det mål AR i Vcap celler det kan føre downregulated ERG uttrykk som igjen kan føre til redusert p536 uttrykk som tidligere beskrevet av vår gruppe [7]. Som vist på fig. 1A, Celastrol ved 2 uM i 18 timer i betydelig grad kan hemme AR og ERG ekspresjon i tillegg til fullstendig avskaffe p536 ekspresjon i VCap-celler, mens de to andre inhibitorene viste ingen slike effekter.
Ar-ERG-p536, en Novel Signa Cascade Målrettet av Celastrol in vitro
det var mange andre mål for Celastrol rapportert i ulike system /celler, inkludert AKT sti og HSP90. For å påvise inhiberingen av AR-ERG-p536 er unik i T /E-fusjonsuttrykkende celler, behandlet vi VCap-celler med Celastrol i 2 timer og 24 timer ved bruk av forskjellige konsentrasjoner varierende fra 0.05 uM til 2 uM. Som vist på fig. 2A, Celastrol behandling i 2 h kan hemme p536 ekspresjon betydelig selv ved meget lave konsentrasjon av 0,05 mM, men denne konsentrasjonen viste nesten ingen effekt på AR (inkludert AR3, en aktiv isoformen av AR) eller ERG ekspresjon, så vel som andre proteiner, inkludert total p65, IKBα, total-AKT, fosfor-AKT 473 og HSP90. I et 24 timers behandling eksperiment, den lavere konsentrasjon av 0,5-1 uM, Celastrol kan i betydelig grad hemme AR, AR3andERG protein ekspresjon i tillegg til p536 uttrykk, mens p65, IKBα, fosfo-Akt473, total-Akt og HSP90 er nesten ikke påvirket. På grunn av sin pleiotrope biologiske aktiviteter, bør man vise forsiktighet i forhold til dose Celastrol brukes til
in vitro
eller
in vivo
. Ved høyere konsentrasjon, kan flere viktige veier bli påvirket siden 2 mikrometer Celastrol begynner å nedregulere fosfor-AKT473 (Fig. 2B). Vi fant også at bare 0,75 uM Celastrol i 24 timer er nødvendig for å avskaffe p-AKT473, total AKT og total AR-ekspresjon i LNCaP-celler (data ikke vist), mens den tidligere studie benyttet 5 uM for å vise AR undertrykkelse og andre biologiske effekter forårsaket av Celastrol i den samme cellelinjen [22]. Derfor definerer den minste konsentrasjon /dosering er kritisk for å unngå enhver potensiell toksisitet forårsaket av inhibering av multiple berørte veier. Vår
in vitro
data indikerer at Celastrol, når det brukes mellom 0,5 mikrometer til 1fiM kan målrette AR-ERG-p536 signalkaskade nesten utelukkende uten å påvirke andre store veier. Vi testet videre ERG, AR og AR3 ekspresjon på RNA-nivået i disse Celastrol behandlede cellene ved kvantitativ RT-PCR [3]. Som vist på fig. 3, bekreftet vi inhibering av T /E fusjon, AR og AR3 genekspresjon ved Celastrol på RNA-nivå på en doseavhengig måte.
(A) Western blot viser at Celastrol 2 timer treament i betydelig grad kan målrette den p536 uttrykk i Vcap celler. Celastrol konsentrasjoner vises på toppen av hvert kjørefelt. Kort tid behandling av Celastrol påvirker ikke AR, AR3, ERG uttrykk, og total p65, IKBα så vel som andre kjente Celastrol mål, for eksempel total AKT, fosforylert AKT-473 og HSP90. (B) Når Celastrol behandlinger varer i 24 timer, ble p536 signale nesten avskaffet i alle grupper. I grupper hvori Celastrol konsentrasjon er lik eller høyere enn 0,5 uM, betydelig redusert AR og ERG samt AR3 ekspresjon ble observert. Når konsentrasjonen når 2 mikrometer, kan 24 timers behandling påvirke flere signalering slik som fosfor-AKT. β-aktin ble benyttet som kontroll.
Når VCap-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Celastrol i 24 timer, ble inhibering av målrettede gener evaluert ved kvantitativ real-time PCR. β-aktin ble benyttet som kontroll genet. T /E-fusjons uttrykket (A), er AR (B) og AR3 (C) ekspresjon er vist på hver figur. Inhiberingen av disse genene på RNA-nivå ved Celastrol er signifikant i en dose-depedent måte. Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom Celastrol behandlede gruppen og kontrollgruppen ved t-test.
Celastrol kan hemme CCL2 Expression på både RNA og protein nivå
Som vi rapporterte tidligere en kandidat genet, CCL2 er oppregulert i T /E fusjon uttrykker PNT1a celler [7]. Denne oppregulering av CCL2 kan skyldes den forhøyede NF-kB-signal i disse celler ved T /E fusjon. CCL2 (også kalt MCP-1) er et kjemokin som er en potent regulator av PCa cellemigrering og proliferasjon [31], [32], [33]. CCL2 uttrykkes av endotelceller i tumoren mikromiljøet, men kan også bli uttrykt ved tumorceller direkte [31], [32]. Viktigst, frem bevis tyder CCL2 er et direkte mål transkripsjonen av NF-kB [34]. Basert på dette bevis, hypotese vi at Celastrol kan ha en direkte innvirkning på CCL2 uttrykk. Vi behandlet VCap-celler med forskjellige konsentrasjoner av Celastrol i 2 timer eller 24 timer. Som vist på fig. 4A, Celastrol behandling for bare to timer kan betydelig redusere CCL2 mRNA-ekspresjon i VCap-celler som bestemt ved Q-RT-PCR og slik inhibering er doseavhengig. Ved behandling varer i 24 timer, kan til og med 0,05 pM Celastrol betydelig redusere CCL2 mRNA-ekspresjon (Fig. 4B). Av notatet, har andre studier vist CCL2 kan bli utskilt i kulturmediet ved Vcap celler [31]. Vi samlet derfor kulturmediet fra hver Celastrol behandlingsgruppe og test CCL2 konsentrasjon ved hjelp CCL2 Elisa kit fra ebioscience.com. Som vist på fig. 4C, alle Celastrol behandlingsgrupper (24 timers behandling) inkludert den laveste konsentrasjon behandlingsgruppe på 0,05 uM viste signifikant redusert CCL2 i kulturmediet. Derfor har vi ytterligere bevis på at Celastrol, som en potent NF-kB hemmer, kan påvirke nedstrøms målene for NF-kB. Men om fosforylering av ser536 spiller en rolle i regulering CCL2 uttrykk er for tiden ukjent.
(A) VCap-celler ble behandlet med Celastrol i 2 timer, inhibering av CCL2 på RNA-nivået ble vist på en dose depedent måte ved real-time PCR; (B) når Celastrol behandlinger ble gjort for 24 timer, selv 0,05 mikrometer kan dramatisk redusere CCL2 uttrykk; (C) når de utsettes for Celastrol i 24 timer, utskilte CCL2 protein i kulturmediet ved VCap celler blir betydelig redusert. ELISA-data er vist. Hver konsentrasjon ble testet in triplo, og forsøket ble gjentatt tre ganger. Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom Celastrol behandlede gruppen og kontrollgruppen ved t-test.
Celastrol kan hemme T /E Fusion Uttrykke Vcap cellevekst in vitro
Celastrol kan hemme PCa cellevekst
in vitro
inkludert mest brukte PCA cellelinjene LNCaP, PC3 og DU145 [22], [35]. Imidlertid har Celastrol aldri blitt testet på VCap-celler. Siden Celastrol kan målrette AR-ERG-NF-kB, tre store veier i Vcap celler, begrunnet vi at det er sannsynlig vise sterk hemming av Vcap cellevekst. Vi behandlet VCap-celler med forskjellige konsentrasjoner av Celastrol i 24 timer og celletall ble tellet ved anvendelse av en celleteller. Som forventet, kan VCap cellevekst bli vesentlig hemmet ved Celastrol på en doseavhengig måte (fig. 5A). Siden VCap-celler uttrykker høyt nivå av p536 (sammenlignet med nesten umulig å oppdage signalet fra andre PCA-celler), og AR, hypoteser om vi at T /E-fusjonsuttrykk VCap-celler ville være den mest følsomme PCa-cellelinje for å Celastrol behandling mens LNCaP ville være følsomt på grunn til AR uttrykk og AR negative PC3 og DU145 cellene skal være relativt ufølsom. For å teste denne hypotesen, brukte vi 0,5 mikrometer Celastrol, laveste effektive dose som viser betydelig innvirkning på AR, ERG, og p536 uttrykk (se
in vitro
data i Fig. 2B), for å behandle LNCaP, PC3, DU145 og Vcap celler i 24 timer. Under våre eksperimentelle tilstand, celleoverlevelsesforhold er 55%, 72%, 83% og 100% for henholdsvis VCap, LNCaP, PC3 og DU145 (Fig. 5B). Denne informasjonen igjen tyder Celastrol kan være en god kandidat medikament for T /E fusjon uttrykke PCa.
(A) Cells (1 × 10
5) ble sådd i 35 mm skåler i fullstendig medium og behandlet med forskjellig konsentrasjon av Celastrol i 24 timer. Proliferasjon av de 8 gruppene av VCap-celler ble målt ved anvendelse av en Coulter-teller. Cellene ble trypsinisert og tellet i tre eksemplarer. Celleantallet for hver gruppe blir dividert med det totale celletallet i kontrollgruppen uten Celastrol behandling. Forsøket ble gjentatt tre ganger. Mean +/- standardavvik er vist. Stjerner angir statistisk signifikante forskjeller mellom Celastrol behandlede gruppen og kontrollgruppen. (B) 1 x 10
5 av Vcap, LNCaP, PC3 og DU145 ble exposured til 0,5 mikrometer Celastrol for 24 timer, celletall ble regnet for hver gruppe og delt på totalt antall celler i kontrollgrupper for å oppnå overlevelse forholdet sikret forsøket ble gjentatt tre ganger. Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom ulike cellelinjer og Vcap celler.
Celastrol kan hemme T /E Fusion Uttrykke Vcap cellevekst in vivo
Basert på disse
in vitro
resultater, vi flyttet frem til
in vivo
eksperimenter med Celastrol å behandle Vcap svulster i en subkutan svulst modell. En uke etter subkutan injeksjon av 4 × 10
6 luciferase-uttrykke Vcap celler i nakne mus, ble Celastrol behandling startes. Seksten mus viste mer enn 1 x 10
5 luminans lese en uke etter injeksjon og ble inkludert i for forsøkene. Mus i behandlingsgruppen ble injisert med 0,5 mg /kg Celastrol I.P. Behandlingen ble utført 4 ganger per uke i 3 uker. Musene ble veid og luciferase basert tumoravbildning ble utført hver uke. Musene ble avlivet 24 timer etter siste injeksjon og primære svulster skåret, veid og hurtigfrosset for molekylære studier eller ved hjelp av histopatologi og en fullstendig obduksjon utført på mus. Ingen signifikant redusert kroppsvekt ble observert (Fig. 6A). En mus i Celastrol behandlingsgruppen viste peritoneal betennelse, men ingen signifikant toksisitet ble observert i lunge, nyre, lever, milt og hjerte. Vi observerte at noen svulster startet krymper etter 2 uker med Celastrol behandling og ved slutten av forsøkene fire mus viste luminescens lavere enn 1 × 10
5. Luciferaseaktivitet før eutanasi er vist i fig. 6A. Det var en markant hemning av tumorvekst i Celastrol behandlede gruppen, og ved slutten av behandlingen tumor luminescens ble redusert ~70% (p = 0,048, t-test) sammenlignet med kontrollgruppen. Vi var i stand til å samle 5 svulster fra Celastrol behandlede gruppe og 7 tumorer for kontrollgruppen. Endelig tumorvekt i behandlingsgruppe ble redusert til bare ~ 10% av den i ubehandlede gruppe (p = 0,0034, t-test). Således 0,5 mg /kg Celastrol behandling i betydelig grad kan hemme tumorvekst VCap
in vivo
.
(A) Nakne mus ble injisert subkutant med VCap-celler som uttrykker luciferase. Etter en uke ble musene behandlet med 0,5 mg /kg Celastrol eller bærer bare. Luciferase fluks av svulster før avlivning og tumor og kroppsvekt ved avslutning av behandling er vist. Stjerner angir statistisk signifikante forskjeller mellom behandlede gruppen og kontrollgruppen. (B) Hemming av AR, ERG og p536 ved kvantitativ Western blot normalisert p-aktin. Representant Western blot av Vcap tumorekstrakter med antistoffer mot AR, ERG eller p536 vises. I hvert western blot, baner 1-4 er kontroll svulster og baner 5-8 er Celastrol behandlet svulster. β-aktin er en lasting kontroll. (C) Et vev microarray (TMA) ble fremstilt for IHC-analyse for disse musene svulster samlet inn. Representative eksempler er vist. Bilder i venstre etter to paneler er for en kontroll mus svulst og bilder i riktig to paneler er for en Celastrol behandlet mus tumor. H E, AR, ERG og p536 flekker vises både på forstørrelse av 40 × og 100 ×. Dramatisk redusert AR, ERG og p536 uttrykk forårsaket av Celastrol behandling blir sett.
Analyse av svulster samlet inn fra mus behandlet eller ubehandlet med Celastrol ble utført ved hjelp av Ki67 IHC fulgt av kvantitativ bildeanalyse og viste ingen signifikant forskjell . TUNEL farging viste at det var flere apoptotiske celler som finnes i Celastrol behandlede tumorer sammenlignet med ubehandlede tumorer. Forskjellen var signifikant (P 0,05, t-test). Således kan redusert tumorvekst kan tilskrives den økte celledød, noe som er i overensstemmelse med tidligere rapporter [22], [36]. Vi utførte også anti-CD31 IHC å evaluere microvessel tetthet som en markør for angiogenese. Vi observerte ingen signifikant forskjell mellom behandlede og ubehandlede tumorer.
Vi har vist
in vitro Hotell som Celastrol kan målrette AR, ERG og p536. Vi har derfor forsøkt å finne ut om de samme målene ble berørt
in vivo
. På grunn av meget liten tumormassen oppsamlet i Celastrol behandlede gruppe (den gjennomsnittlige vekten av disse 5 tumorene var 0,0345 g), kan vi bare har 4 tumorprøver for Western-analyse. Derfor vi tilfeldig valgte 4 svulster fra kontrollgruppen å sammenligne uttrykket på proteinnivå. Som vist på figur 6B, betydelig redusert AR, ERG og p536 ekspresjon ble observert i Celastrol behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,05, t-test). Vi har også observert noe redusert HSP90-ekspresjon i behandlede tumorer, men forskjellen var ikke signifikant (data ikke vist, p = 0,1, t-test). I tillegg fant vi at Celastrol har ingen innvirkning på total AKT uttrykk. På grunn av svært begrenset tumormasse, var vi ikke i stand til å skaffe AR3 og fosfor-AKT uttrykk i disse tumorprøver.
Totalt sett indikerer data Celastrol kan hemme Vcap cellevekst
in vivo
ved å målrette AR-ERG-NF-kB signal og foreslår Celastrol kan ha terapeutisk potensial for T /E fusjon bærer PCa.
Diskusjoner
Betydelig fremgang har blitt gjort de siste årene når det gjelder underklassifikasjon av PCa basert på den genetiske endringer i tumorcellene, inkludert kromosomale rearrangement som involverer ETS familie transkripsjonsfaktorer eller overekspresjon av SPINK1, et gen som koder for et utskilt serin protease inhibitor. Oppmuntrende Ateeq et al. gitt bevis som støtter en begrunnelse for målretting SPINK1 i SPINK1
+ /ETS
– PCas og vist at kombinert monoklonalt antistoff behandling rettet mot både SPINK1 og epidermal vekstfaktor reseptor kan føre til mer betydelig reduksjon i tumordannelse enn enten monoklonalt antistoff alene , noe som gir et sterkt bevis for målrettet terapi for SPINK1
+ /ETS
– PCas [37]. Virkningen av dette funnet er begrenset av funn som SPINK1 er kun uttrykt i en liten prosentandel av PCas (~ 10%) og er ikke sett i ETS-faktoren uttrykker PCa. Flertallet av ETS-positive PCas bære T /E fusjoner som er til stede i mer enn halvparten av PCas. Dermed er det et presserende behov for å oppdage nye behandlingstilbud for denne store undergruppe av PCas. Vi har tidligere vist at målretting T /E fusion transkripsjoner hjelp shRNA kan betydelig redusere tumorvekst
in vivo product: [6], men de har ikke helt eliminere den. Vi har også vist at NF-kB signalisering, via fosforylering av NF-kB p65 Ser536 er sterkt aktivert i disse T /E-fusjonsuttrykk PCA-celler (mer enn 90% av den totale tilfelle analyserte) og fravær av p536 er forbundet med redusert biokjemisk gjentakelse [7]. Gitt de pleiotrope effekter av NF-kB på tumorprogresjon, disse funnene tyder på at NF-kB signalering, spesielt fosforylering av p65 Ser536, spiller en avgjørende rolle i tumordannelse i PCas bærende T /E fusjoner. Derfor hypoteser vi at en to-trinns tilpasset behandling formasjonen rettet mot både T /E fusjon og NF-kB-signalering, som er lik den tilnærming for SPINK1
+ /ETS
– PCas som beskrevet tidligere [38] kan være en levedyktig metode for denne undergruppen av PCa som bærer T /E fusjon.
i denne studien viser vi at Celastrol, en velkjent NF-kB-inhibitor, kan være en utmerket kandidat medikament for behandling av T /E
+ /p536
+ PCa. Celastrol kan modulere multiple signalbaner som er involvert i kreft, og kan derfor i betydelig grad hemme kreftcellevekst [16], [17]. Flere molekylære mål av Celastrol har blitt identifisert, inkludert AKT, HSP90 og andre [16], [18], [22], [25], [26], [27], [39]. Vi viser først at Celastrol er en potent p536 hemmer både
in vitro Hotell og
in vivo
. Meget lav konsentrasjon på 0,05 uM Celastrol behandling i 2 timer signifikant redusert p536 ekspresjon i VCap-celler. Tilsvarende 0,5 mg /kg Celastrol behandling 4 ganger /uke, den laveste dosen noen gang er rapportert i litteraturen, kan betydelig redusere p536 nivåer i Vcap xenografttumorer. Fosforylering av p65 har blitt vist av mange grupper for å forbedre p65 transkripsjonen aktivitet (se vurderinger [40] og [41]), men den nøyaktige rolle av p536 i PCA-celler, spesielt i T /E-fusjonsuttrykkende celler er ukjent, og genene spesifikt regulert av p536 har aldri blitt undersøkt ved PCA. Våre data viser at ekspresjon av CCL2, et velkjent mål for NF-kB p65 og en potent regulator for PCa cellemigrering og proliferasjon [31], [32], [33], kan bli dramatisk inhiberes av Celastrol både mRNA og
