Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste kreftformen i verden. Risikoen for død er nært korrelert til det stadiet av CRC ved tidspunktet for primær diagnose. Derfor er det et tvingende behov for identifisering av blod biomarkører som kan gjøre tidlig deteksjon av CRC. Vi brukte en kvantitativ proteomikk tilnærming med isobar merking (iTRAQ) for å undersøke endringer i plasma proteomet av 10 pasienter med CRC sammenlignet med friske frivillige. Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay (ELISA) og Western blot ble anvendt for ytterligere bekreftelse. I vår kvantitative proteomikk analyse, vi har oppdaget 75 humane plasmaproteiner med mer enn 95% selvtillit hjelp iTRAQ merking i forbindelse med microQ-TOF MS. 9 oppregulert og 4 nedregulert proteiner ble observert i CRC-gruppen. Den ORM2 nivået i plasma ble bekreftet å være signifikant forhøyet hos pasienter som lider av CRC sammenlignet med kontrollene. ORM2 uttrykk i CRC vev ble betydelig økt sammenlignet med det i tilsvarende tilstøtende normale slimete vev (
P
0,001). ITRAQ sammen med Q-TOF /MS er en følsom og reproduserbar teknikk for kvantitativ proteomikk. Endring i ekspresjon av ORM2 antyder at ORM2 kunne brukes som en potensiell biomarkør for diagnose av CRC
relasjon:. Zhang X, Xiao Z, X Liu, Du L, Wang L, Wang S, et al. (2012) Den potensielle rolle ORM2 i utvikling av tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (2): e31868. doi: 10,1371 /journal.pone.0031868
Redaktør: Anthony W. I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 07.11.2011; Godkjent: 13 januar 2012; Publisert: 21 februar 2012
Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kontrakts tilskudd sponse: National Clinical Key tema~~POS=TRUNC Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i 2009, American Cancer Society estimert totalt 146,970 nye tilfeller og 40% dødsfall i USA kolorektal kreft (CRC). CRC er forventet å være den tredje hyppigste kreft i Amerika. Siden 1975 har det vært en merkbar forbedring i forhold CRC 5-års overlevelse, som et resultat av tidligere diagnose og bedre behandling [1]. Sigmoidoskopi betydelig forbedret deteksjonsraten av CRC. Imidlertid er det et bredt program fortsatt begrenset på grunn av høye kostnader og ulemper. Dermed er spesifikke sera baserte tumor markører for tidlig diagnose og prognose nødvendig.
Plasma /serummarkører (f.eks carcinoembryonic antigen, CEA) er de mest brukte og pålitelige tumor markører for CRC fordi de er lett kvantitativt målt , reproduserbar og kostnadseffektiv. Selv om de gjeldende retningslinjene fra American Society of Clinical Oncology (ASCO) anbefaler at CEA nivåer bør overvåkes hver 2-3 måneder i minst 2 år poste diagnose, er det ingen klar enighet om gyldigheten av CEA overvåking [2]. Flere studier [3] – [5] spørsmål ved verdien av CEA som en markør for CRC tilbakefall, spesielt hos pasienter med normal preoperativ CEA nivåer. På grunn av disse problemene, er nye biomarkører som kreves for å forbedre tidlig oppdagelse og prediksjon av tilbakefall for alle typer CRC. Ulike proteomikk mønstre i serum presentere nye muligheter til å utvikle nye, svært sensitive diagnostiske verktøy for tidlig deteksjon av kreft [6].
I litteraturen, proteomikk teknologi har blitt brukt til å studere CRC serum biomarkører. I disse studiene, proteomics strategier som to-dimensjonale polyakrylamid gelelektroforese (2-D-PAGE), to-dimensjonale fluorescens differensial i gelelektroforese (2-D DIGE), overflate-forbedret laserdesorpsjon /ionisering flukttid massespektrometri (SELDI -TOF MS) teknologi og protein arrays har blitt utnyttet, men ingen kan nøyaktig vurdere nivået på opp- eller nedregulering av de foreslåtte biomarkører. Derfor er det vanskelig å fastslå deres særegenheter og gyldighet i blinde undersøkelser av prøvene [7], [8]. For å avdekke nye plasma biomarkører, en ny tilnærming med isobariske tagger for Relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ) har blitt brukt [9]. Den stabile inkorporering av isotoper til et amin merking reagens er involvert i dette kjemisk merking metoden. Ved hjelp av massespektrometri, kan proteinene bli pålitelig detektert og tillate sammenlignende kvantifisering i en multipleks måte. Kjernen ved denne metoden er en multiplekset sett av isobariske reagenser som gir amin-derivatiserte peptider. De derivatiserte peptider er utvisket i MS, men utviser intens liten masse MS /MS signatur ioner som støtter kvantifisering. Denne fremgangsmåten gir en masse forskjell som grunnlag for kvantitering ved måling av relative topparealene for MS og /eller MS /MS massespektra. I dag kan kommersielt tilgjengelige 4-plex og 8-plex-reagenser kan brukes til å merke proteinprøver av interesse følgende trypsin fordøyelse. Forskjellige isobariske tagger i denne fremgangsmåten tyder på at i en enkelt massespektrometrisk analyse, opp til 4 eller 8 forskjellige prøver, hvorav den ene er en referanse, kan samtidig undersøkes. Gitt denne grunn er det iTRAQ tilnærming foreslått som meget lovende i oppdagelsen av biomarkører i prøver med et bredt spekter av plasma, kroppsvæsker og vev.
I denne studien ble iTRAQ koblet med microQ-TOF /MS å detektere differensial uttrykte proteiner i plasma fra CRC-pasienter og kontroller. Blant de proteinene som ble forhøyet i CRC plasma, ble 9 proteiner oppregulert, og fire ble nedregulert. Vi diskuterte sine mulige funksjoner og verifisert ORM2 som kan være en potensiell serologisk biomarkør for (de) CRC pasienter. Den spesifikke funksjon av dette protein har ennå ikke blitt bestemt; imidlertid synes ORM2 til å fungere i å modulere aktiviteten av immunsystemet i løpet av den akutte fase-reaksjon, som kanskje spiller en mulig rolle i den tidlige utviklingen av CRC. Økende bevis indikerer at tumor-assosiert betennelse kan kjøre svulst utvikling og progresjon, mens svulst utvikling og progresjon kan indusere betennelse, som kan spille en sentral rolle i alle faser av tumorigenesis. Slike inflammatoriske molekyler kan påvises i blodprøver fra pasienter cancaer og kan ha en potensiell rolle i den tidlige oppdagelse av kreft. I denne studien ble oppregulering av ORM2 bekreftet av ELISA i plasma fra pasienter med tarmlidelse.
Resultater
Identifikasjon av kandidat biomarkører ved microQ-TOF MS
for microQ-TOF MS protein profilering, plasmaprøver fra 10 CRC-pasienter og 10 individer i kontrollgruppen ble samlet opp (2 ml plasma fra hver), og deretter blandet for å danne en prøve basseng for ytterligere prøving. 100 ul av samleprøver fra hver gruppe ble immunodepleted av 12 tallrike plasmaproteiner hos immunoaffinitetskolonne teknikk som er beskrevet i Methods.
Immunodepleted plasmaprøver ble fordøyd med trypsin, merket med en unik kode isobar, kombinert og samtidig analysert ved hjelp microQ-TOF MS. CRC gruppe ble merket med iTRAQ-114 og den friske kontrollgruppen ble merket med iTRAQ-117 og deretter separert ved sterk kationbytterkromatografi og C18 fraksjonering. 75 proteiner ble identifisert ved microQ-TOF MS med ≥95% sikkerhet. Blant denne gruppen ble 13 differensielt uttrykte proteiner valgt basert på 1,5 ganger over-ekspresjon og 1,5 ganger under-ekspresjon i CRC-pasienter sammenlignet med friske frivillige. Ni proteiner av de 13 differensielt uttrykte proteiner ble oppregulert (tabell 1). Tre proteiner ble funnet å være signifikant forhøyet i CRC gruppe (med forhold 1,3 til 4,4). Fire proteiner ble nedregulert i CRC-pasienter, og deres ekspresjonsnivåer er vist i tabell 2. Den statistiske variasjonen av tumor sammenlignet med normale forholdstall var innenfor den 95. konfidensnivå (P = 0,05).
Måling av ORM2 i plasmaprøver
Som vist i fig. 1, plasma ORM2 nivåer på en logg skala i boks-og-whisker plott, median plasma ORM2 konsentrasjonene var signifikant høyere i CRC i forhold til normal colorectum, hyperplastic polypp, og adenom (alle på P 0,001, henholdsvis). Plasma ORM2 nivået var statistisk signifikant høyere hos pasienter med IBD enn i normal colorectum, tykktarmshyperplastisk polypp og adenom (alle på P 0,001, henholdsvis), og det var statistisk signifikant høyere hos pasienter med IBD enn i CRC (
P
. 0,05)
Stjernen (stjerner) i figuren betyr et tegn for statistisk analyse. En stjerne betyr at P 0,05 og skiltet med tre stjerner betyr P 0,001. CRC er statistisk forskjellig fra det normale colorectum, hyperplastisk polypp og adenom (alle på P 0,001, henholdsvis); IBD er statistisk forskjellig fra vanlig den colorectum hyperplastisk polypp og adenom (alle på P 0,001, henholdsvis). IBD er statistisk forskjellig fra kolorektal kreft (P 0,05).
Vi har vurdert om plasma ORM2 potensielt kan skille CRC fra godartede kolorektal sykdommer. Vi søkte etter korrelasjon (alder, kjønn, TNM stadium og histologisk grad) mellom plasma ORM2 nivåer og CRC pasientens clinicopathological parametre (Tabell 3). Ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom plasma ORM2 konsentrasjoner og alder, kjønn, TNM stadium eller histologisk grad.
Måling av ORM2 i vevsprøver
Western blot analyse ble brukt for å bestemme uttrykket av ORM2 i vev. Når protein-ekspresjon ble målt ved densitometer, median densitometer verdien av ORM2 i CRC cancervev var signifikant større enn i tilsvarende tilstøtende normale mukøse vev (
P
0,01). (Fig. 2)
Diskusjoner
I de senere årene har proteomikk basert biomarkør funn fra serum /plasma steget. En rekke studier har forsøkt å bruke proteomikk tilnærminger for oppdagelsen av nye biomarkører for CRC pasienter [10] – [14]. Studier av Yong-Sam Kim [10] avslørte 26 kandidat biomarkører for CRC ved kombinert to-DE og nano-LC-FT-ICR /LTQ MS. Ma et al [11] identifiserte 4 proteiner med diagnostiske potensialer ved SELDI undersøker serum proteomet av 62 CRC pasienter og 31 ikke-kreft fag. Imidlertid har problemer angående kompleksiteten og dynamiske området for bestanddeler proteiner gjort det vanskelig å oppnå meningsfylte data for tolkning. Både serum og plasma viser enorm variasjon i enkelte protein overflod. LC-MS /MS tilnærminger for analyse av serum /plasma-prøver ga mye bedre dynamisk rekkevidde evner. I tillegg har iTRAQ reagenser fått interesser på dette området som et nyttig verktøy i protein biomarkører. Det er den første studien som kombinerer iTRAQ med Q-TOF /MS på plasmaprøver av CRC pasienter for å oppdage potensielle biomarkører for CRC. 13 proteiner med ulike uttrykk mønstre i CRC plasma ble vellykket identifisert. Blant disse 13 proteinene, var det flere proteiner av interesse, for eksempel ORM2, Serpin peptidase-inhibitor (clade D), NADH dehydrogenase subenhet 5 (ND5) og retinol-bindingsprotein 4 (RBP4), som ble valgt som fordelaktige kandidater, og kan være ytterligere undersøkt. ORM2 (alfa-1-syre glykoprotein), et medlem av akutt fase-protein familien funnet å være relatert til tarmsystemet sykdom [15] – [18], ble utvalgt for ytterligere verifisering og undersøkelser
It. er kjent at kreften er ledsaget av en rekke systemiske fysiologiske og biokjemiske endringer, inkludert glykosylering som er en av de viktigste post-translasjonelle modifikasjoner av proteiner. Flere og flere oppmerksomhet blir betalt på å studere avvik glykosylering under ulike patofysiologiske tilstander, inkludert betennelse [19], leddgikt [20], [21], og kreft [22], [23]. Under organisering av våre data, fant vi flere serologiske glykosylert proteiner som ORM2, EpCAM endring i nivåene under kreftutvikling. I denne foreløpige undersøkelser, rapporterte vi ORM2 som nytt medlem av disse kreftrelatert glykoproteiner. Wandall [24] brukte en roman O-glycopeptide microarray å skjerme seromic profilering av pasienter med kolorektal cancer.Dai [25] individuelt avbildes endringen i glykoproteiner indirekte. Disse rapportene oppmuntre en annen vinkel for å oppdage kliniske biomarkører for diagnose og prognose
Det er flere rapporter om ORM2 i tarmsystemet sykdom og kreft [15] -. [18], [26]. ORM2 ble ansett for å være relatert til kapillær permeabilitet [15]. Funksjonen til orosomucoid ble rapportert å ha sammenheng med betennelse og kreft. Konsentrasjonen av S-orosomucoid ble funnet å være forhøyet hos pasienter med Crohns sykdom [16]. Sammenligning av blærekreftpasienter med friske kontroller, var det signifikante forskjeller, med mye mer orosomucoid uttrykt i kreftgruppen [17]. Lignende fenomen kan også funnet hos pasienter med bronkial carcinoma [18]. Ved hjelp av 2-D DIGE og ytterligere analysert ved hjelp av MALDI-TOF-massespektrometri hos pasienter med kronisk inflammatorisk demyeliniserende polynevropati, ble betydelig oppregulering av alfa-1-syre glykoprotein en forløper identifisert [26]. Studier har indikert at CEA, i likhet med alfa 1-syre glykoprotein (orosomucoid) i immunologi er foreslått som en biosyntetisk forløper til alfa 1-syre glykoprotein [27].
Dette er den første rapport om en oppregulering av ORM2 i CRC plasma. Videre ble det opp-regulering av ORM2 bekreftet ved hjelp av ELISA i plasma fra pasienter med tarmlidelse. Det ble funnet at ORM2 ble betydelig økt hos pasienter som lider av CRC og IBD sammenlignet med normale individer og pasienter med hyperplastisk polypp og adenom. ORM 2 er en nøkkel akuttfaseplasmaprotein i inflammasjon, slik at dette proteinet er klassifisert som en akutt fase-reaktant. Den spesifikke funksjon av dette protein har ennå ikke blitt fastslått, synes imidlertid ORM2 til å fungere i å modulere aktiviteten av immunsystemet i løpet av den akutte fase-reaksjon. Dette kan fungere som en potensiell formidler av immun flukt i CRC og påvisning av ORM2 kan ha betydning i sært kolorektal kreftutvikling fra IBD.
For å finne kilden til ORM2, CRC svulstvev og tilsvarende tilstøtende normale slimete vev ble undersøkt ved Western blot. Resultatene viste at ekspresjon nivået av ORM2 i CRC kreftvev ble funnet å være høyere enn i normalt vev. Derfor foreslås det at ORM2 kan være involvert i kreftutvikling hos pasienter med CRC kreft.
Denne studien gir også bevis for at ORM2 nivåer i CRC pasienter kan være nyttig som en biomarkør for diagnostisering. Serum CEA analysene er ikke anbefalt for screening asymptomatiske pasienter for kreft. En grunn er at plasma CEA-analysen ikke er diagnostisk nok til å diskriminere mellom lokaliserte ondartede tumorer og godartede lidelser. I vår studie, påvisning av ORM2 hjelp ELISA og Western blot er lovende. Plasma ORM2 konsentrasjoner var signifikant høyere i CRC i forhold til normal colorectum, hyperplastic polypp, og adenom (P 0,001). Derfor bruker ORM2 for å overvåke mulige CRC pasienter kan være en god måte å validere hvorvidt ORM2 kan anvendes for screening av asymptomatiske pasienter. Det er imidlertid viktig for å kunne analysere diagnostisk betydning ORM2 av et stort antall pasienter i flere sentre før endelig klinisk anvendelse for CRC diagnose.
Serpin peptidase-inhibitor, clade D (heparin kofaktor), det kodede produkt heparin kofaktor som deler homologi med antitrombin III og andre medlemmer av alfa 1-antitrypsin super raskt kan hemme trombin i nærvær av heparin. Defekter i SERPIND1 er den viktigste årsaken til heparin kofaktor II-mangel, og heparin kofaktor II-mangel kan føre til økt trombin generasjon og en en-hyperkoagulasjonsreaksjonen tilstand. Dette er ufordelaktig for utvikling av kreft. Det er flere rapporter om clade A og E i kreft [28], [29], men få på clade D. samme protein ble også identifisert som en Alpha-1-antichymotrypsin forløper. Alfa-1-antichymotrypsin tilhører serpin-familien, uttrykkes sterkt i astrocytter og har blitt funnet å spille rolle i patogenesen av klassiske plaques med Alzheimers sykdom. Som en akutt fase-faktor, kan det hemme aktiviteten til makrofaglign ectoenzymes og matriks-metalloproteinase-9 i løpet av hud sårheling [30], men induserer TNF-α produksjon i studiet av mikrogliaceller cellelinjer [31]. Denne type protease inhibitor er blitt rapportert til å danne komplekser med den kallikrein familien såsom HK3 (også kjent som en prostata-spesifikt antigen), hK2 og Ht6, og kan anvendes ved diagnose av prostatakreft [32].
Blant de nedregulert proteiner, ND5, en essensiell komponent subenhet av hele mitokondriell komplekset i [33], [34], spiller en viktig rolle i den oksydative fosforylering prosessen så vel som i karsinogenese. Noen litteratur viste at ND5 kan indusere hepatomas [35]. Mitokondrie-DNA (mtDNA) mutasjoner er blitt rapportert i mange typer kreft. mtDNA gen defekter kan være involvert i de patogenetiske mekanismene for dødelig manifestasjon [36]. Frame-shift mutasjon i ND5 gener har blitt rapportert i leverkreft, og også i preneoplastiske lesjoner i mage-tarmkanalen [37]. I denne studien har vi identifisert ND5 (67 kDa) som en potensiell kandidat, men dens presise rolle i kreftutvikling fortsatt trenger videre etterforskning, spesielt mutasjoner.
RBP4, et cytokin utskilt av fettvev, er en roman adipokin koblet med fedme og insulinresistens i type 2 diabetes. RBP4 har også blitt vist å være involvert, til en viss grad, i utviklingen av betennelse og kreft. For eksempel ble RBP4 metylering undersøkt i esophageal plateepitelkarsinom [38]. I kolorektal karsinom, nivået av RBP minker [39]. I vår studie identifiserte vi RBP4 som en potensiell kandidat, men videre etterforskning av sin funksjon i patogenesen av kreftutvikling er nødvendig.
I denne foreløpige proof-of-prinsippet studier, Tabell 1 og Tabell 2 liste 13 kandidat biomarkører for CRC. De fleste av disse har ikke blitt rapportert som kreft biomarkører, som har vist at iTRAQ sammen med Q-TOF /MS er en sensitiv, reproduserbar, robust teknikk for å identifisere statistisk signifikante forskjeller protein expression betweenCRC pasienter og friske kontrollplasmaprøver. Fra verifisering av ORM2, ble det funnet at ORM2 kan være en potensiell biomarkør for å skille CRC fra IBD. I fremtidige studier, vil større utvalgspopulasjoner være nødvendig for å bekrefte disse potensielle biomarkører. I vår forskning, er ORM2 først identifisert som en annerledes regulert protein i CRC pasienter i forhold til normale kontroller med proteomikk screening. Men det krever mye benk eksperimenter og kliniske tester før ORM2 kan brukes som en pålitelig biomarkør. Vi vil fortsette vår studie på ORM2 i to aspekter. For det første er vi etablere en plattform for å skille og å analysere relevancies av forskjellige nivåer på glycosylgrupper mønster endringer i ulike faser av sykdommer utvikling basert på ORM2. Samtidig er vi også svært interessert i funksjon av ORM2 i tumorprogresjon på grunn av den regulerer lipid homeostase og protein kvalitetskontroll på det endoplasmatiske retikulum membranen.
Metoder
Prøvepreparering
Denne studien ble godkjent og overvåket av etikkomiteen av Qilu Hospital, Shangdong University. Plasmaprøver for proteomforskning fra 10 CRC pasienter gruppe og 10 friske kontrollgruppen ble oppsamlet (tabell 4). For hver person, ble 2 ml blod oppnås ved venepunksjon og samles i et rør med EDTA, og plasma ble fremstilt som anbefalt av HUPO Plasma Proteome prosjektet [40]. Det var totalt 419 fag for ELISA, som ble klassifisert i fem kategorier etter standard klinisk, radiologisk endoskopisk og histologisk kriterier: normal kontroll (n = 65), hyperplastisk polypp (n = 59), inflammatorisk tarmsykdom (IBD) (n = 62), adenom (n = 53) og CRC (n = 180). For Western blot, ble totalt 41 sekvensielle pasienter diagnostisert som CRC vurdert. Vevsprøver og tilsvarende tilstøtende normale slimhinnevevet ( 5 cm fra kanten av svulsten) ble samlet og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Ingen pasienter i denne studyreceived noen form for terapi, for eksempel stråling eller cellegift.
Immunodepletion av høy overflod plasmaproteiner
Plasma prøver fra 10 CRC pasienter og 10 personer i kontrollgruppen gruppe ble samlet opp (2 ml plasma fra hver), og deretter blandet for å danne en prøve basseng for ytterligere prøving. Samlede plasmaprøver ble tømt for de beste 12 mest tallrike proteiner (albumin, IgG, IgA, IgM, transferrin, fibrinogen, α
2-makroglobulin, α
1-antitrypsin, haptoglobin, α
1-Acid glykoprotein, Apolipoprotein AI, og Apolipoprotein A-II) med en ferdigpakket 2-ml Seppro ™ MIXED12 affinitet LC kolonne (Genway Biotech, San Diego, CA) på en Agilent 1100-serien HPLC system (Agilent, Palo Alto, California) i henhold til den anbefalte produsentens prosedyre.
etter utarming, de utfelte proteiner ble oppløst ved lyseringsbuffer (6 M urea og 4% CHAPS, 1 mM PMSF, 2 mM EDTA). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved 2D Quant Kit (GE Healthcare, USA), ved hjelp av albumin som en referansestandard (1 pg /pl-10 ug /ul). Konsentrasjoner ble målt til 4,83 ug /ul (CRC-gruppen) og 2,27 ug /ul (sunn gruppe).
Trypic digeston og iTRAQ reagent merking
Etter reduksjon (10 mM DTT, 100 mM NH4HCO3, 56 ° C, 45 min) og alkyleringen (55 mM IAA 100 mM NH4HCO3, 45 min), hvor hver prøve (100 pg) ble fordøyet med trypsin og merket med iTRAQ reagenser. Disse prøver ble spaltet i dissosiasjon buffer (trypsin:protein = 01:30) over natten ved 37 ° C. Peptider ble merket med iTRAQ reagenser (114 for CRC-gruppe, 117 for den friske gruppe).
Sterk kationebytterkromatografi og C18-kolonne fraksjone
sterk kationbytter-kromatografi ble anvendt for å fjerne den overflødige iTRAQ reagenser og forstyrrende stoffer som kan påvirke MS analyse. De merkede prøvene ble tilsatt til 10 x buffer A (10 mM KH2PO4 i 25% acetonitril, pH 3,0). Høy oppløsning kationbytterkromatografi ble deretter gjennomført for å separere de merkede prøver inn i 10 fraksjoner. Peptidene ble eluert med en lineær gradient av KCl 0~500 mm (25% volum /volum ACN, 10 mm KH2PO4, pH 3) i løpet av 15 minutter ved en strømningshastighet på 1 ml /min, med fraksjoner oppsamlet 1-minutts intervaller. Prøvene ble avsaltet og ytterligere fraksjonert ved anvendelse av en C18-kolonne med nano HPLC (PROXEOME, USA) fulgt av MS-analyse. Stigningen var 5~40% ACN i 70 min.
Matrix assistert laser desorpsjon ionisering-time of flight (MALDI-TOF) /TOF og microQ-TOF analyse
Maskin parametere ble satt som ion kilde 25 kV for positiv matrise faktorisering (PMF) og 8,0 kV for tandem MS /MS reflektor 26,3 kV for PMF og 29,5 kV for tandem MS /MS, linse 9,5 kV for PMF og 3,5 kV for tandem MS /MS, løft 19,0 kV og spektra ble ervervet i refleksjonsmodus i MALDI TOF /TOF med masse utvalg 700~4000. Toppene med et forhold S /N over 5 ble automatisk merket ved FlexAnalysis (Bruker, Tyskland). PMF topper med masse intensitet på mer enn 5000 ble valgt ut for ytterligere MS /MS. Spektrene ble kjøpt i positiv ion modus i microQ-TOF med masse utvalg 50~3000, og tørrgass og forstøver gass ble satt som 3 l /min, og 2 l /min, henholdsvis. Temperaturen i sprøytekammeret var satt som 150 ° C, og styrken av det elektriske felt ble satt til 1400 V, ble kollisjonsenergien angitt som 35% timing for lav ion masse og 65% timing for høy ione masse. Andre parametere ble satt som standard.
Database søk
spektra ble behandlet med microQ-TOF kontroll 3.0 (Bruker, Tyskland) ved hjelp av standardinnstillingene, bortsett fra at parametrene for overføring trakt RF og kollisjon celle RF ble satt som 120 Vpp og 600 Vpp, henholdsvis. Den påfølgende dataanalysen ble utført ved hjelp av dataanalyse 4,0 Biotools 3.0, henholdsvis WARP-LC 2,0 (Bruker, Tyskland), og Mascot 2,2 (Matrix Science, London, Storbritannia), (Bruker, Tyskland). Protein identifikasjon ble utført ved å søke på Swiss-Prot Human2009-12 database med en forløper ion og fragment masse toleranse både angitt som 0,04 Da. Carbamidomethylation av cysteinene ble satt som fast modifikasjon, og oksidasjon av methioniner, iTRAQ 8 Plex modifisering av N-terminal, K og Y ble betraktet som variable modifikasjoner, henholdsvis. En maksimal mis-spalting ble godtatt. Ion poengsum cutoffs ble satt til 25 for peptider og til 68 for proteiner. Peptide identifikasjoner ble akseptert hvis de kunne bli etablert på mer enn 90,0% sannsynlighet som angitt av PeptideProphet algoritmen. Protein identifikasjoner ble akseptert dersom de kunne bli etablert på mer enn 90,0% sannsynlighet eller inneholdt minst 2 identifiserte peptider. Proteiner som inneholdt lignende peptider og kunne ikke bli differensiert basert på MS /MS-analyse alene ble gruppert for å tilfredsstille prinsippene for parsimoni. For klassifisering, ble genet ontologi (GO) symboler av de identifiserte proteinene kuratert med xref database, og spørres mot genet ontologi databasen ved hjelp av GoMiner verktøy (https://discover.nci.nih.gov/gominer/index.jsp ). Prediksjon av opprinnelsen til proteiner med ukjent cellulær lokalisering ble utført ved hjelp av PSORT II (https://www.psort.org/).
Alt protein iTRAQ forhold ble forvandlet til å basere 2 logaritmen verdier. I base 2 logaritmen plass, ble en 2 ganger endring i nivåene rapportert som en eller -1 for oppregulert og nedregulert endringer, henholdsvis.
Elisa for ORM2
ORM2 nivåer i plasma ble kvantifisert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig ELISA kit (grunn Bioteknologi Diagnosticate, San Diego, California), i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blotting for ORM2
tumorvev og tilsvarende tilstøtende normale slimete vev ble resuspendert i iskald radioimmunpresipitasjonsmålinger (RIPA) buffer for lysering. En BCA proteinanalysesett (Beyotime, Biotechnology, Kina) ble brukt for proteinanalyse. Omtrent 25 ug protein av prøvene ble lastet, separert på 9,0% Tris-glycin-SDS polyakrylamidgeler og deretter elektro-overført på polyvinyliden-fluorid-membraner. Etter blokking med 5% fettfri melk, ble membranene inkubert med ORM2 Ab (1:150, Yueyan Bioteknologi, Shanghai, Kina) eller anti-β-aktin monoklonalt antistoff (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) over natten ved 4 ° C. Membranene ble ytterligere inkubert med polyklonalt muse-anti-geit HRP-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller polyklonalt geite-anti-muse-HRP-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 2 timer ved romtemperatur. Bånd ble påvist ved anvendelse av en kjemiluminescens deteksjon kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Intensiteten av hvert bånd ble kvantifisert ved hjelp ImageJ 1,32 programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD) etter densitometrisk skanning av filmene.
Statistisk analyse
Kolmogorov-Smirnov test ble utført for å bestemme fordelingen av prøvene i hver gruppe. Data ble uttrykt som median (inter-kvartil range, 1IQR). En ikke-parametrisk test (Kruskal-Wallis test) ble benyttet for å analysere forskjeller mellom CRC og andre grupper. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk analyse ble utført med SPSS programvareversjoner 13.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago, USA).
Takk
Takk til Dr. Edward C. Mignot, tidligere medlem av Shandong University, for språklige råd .
