Abstract
Bakgrunn
Desmocollin 3 (DSC3), et medlem av cadherin genet super, er assosiert med patogenesen av enkelte krefttyper, men dens rolle i prostatakreft (PCA) er fortsatt i stor grad ukjent.
Metoder
DSC3 genuttrykk nivå i tilgjengelig PCa microarray datasettet ble undersøkt ved hjelp av Oncomine database. DSC3 transkripsjon uttrykk i prostata cellelinje panel og en kohort uavhengig vev (n = 52) ble anslått av kvantitativ PCR (Q-PCR). Epigenetisk status for DSC3 genet promoter ved PCA ble undersøkt ved å laste opp tre datasett (kode infinium 450K array-data og to metylering sekvensering) i UCSC genom nettleser. Mens pyrosekvensering analyse måles promoter DNA metylering, ble Q-PCR estimater innhentet for DSC3 avskrift re-uttrykk etter 5-Aza-deoksycytidin (5-Aza) behandling. Klinisk relevans av DSC3 uttrykk ble studert av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Til slutt ble funksjonelle studier overvåking celleproliferasjon, migrasjon og invasjon utført i prostata cellelinjer etter siRNA mediert DSC3 knockdown eller etter 5-Aza indusert re-uttrykk. EMT markører vimentin og E-cadherin uttrykk ble målt ved Western Blot.
Resultater
Microarray dataanalysene viste en signifikant reduksjon i DSC3 transkripsjon uttrykk i PCA forhold til godartede prøver. Q-PCR-analyse av en uavhengig kohort avdekket DSC3 transkriptet ned-regulering, både i PCA-cellelinjer og tumorvev, men ikke i sin godartet motstykke. Undersøkelse av tilgjengelige NGS og infinium data identifisert en rolle for epigenetisk regulering DSC3 mRNA reduksjon ved PCA. Pyrosekvensering bekreftet økt DSC3 arrangøren metylering i kreftcellelinjer og restaurering av transkripsjon uttrykk på 5-Aza behandling ytterligere bekreftet dette epigenetisk stillemekanisme. Viktigere Kaplan-Meier analyse av et utfall kohort viste en sammenheng mellom tap av DSC3 uttrykk og betydelig økt risiko for biokjemisk tilbakefall. Funksjonelle studier indikerer en rolle for epitelial-mesenkymale overgang i DSC3 regulert celle migrasjon /invasjon.
Konklusjon
Til sammen tyder våre data på at DNA-metylering bidrar til nedregulering av DSC3 i prostata cancer og tap av DSC3 spår dårlig klinisk utfall
Citation. Pan J, Chen Y, Mo C, Wang D, Chen J, Mao X, et al. (2014) Association of DSC3 mRNA nedregulering i prostatakreft med arrangøren Hypermethylation og dårlig prognose. PLoS ONE 9 (3): e92815. doi: 10,1371 /journal.pone.0092815
Redaktør: Robert Dante, Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE, Frankrike
mottatt: 13 november 2013; Godkjent: 26 februar 2014; Publisert: 24 mars 2014
Copyright: © 2014 Pan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra China National Natural Science Foundation (81272809); Vitenskap og teknologi Planning Project of Guangdong (2011B050400021) og Guangdong Key Laboratory of Urology, The First Affiliated Hospital i Guangzhou Medical University (2010A060801016). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostatakreft er den nest vanligste kreftformen blant menn over hele verden og mer enn 900.000 mennesker er diagnostisert med prostatakreft hvert år [1]. Selv om PSA blir klinisk anvendt som et screening-test med en sensitivitet på 80%, er dens nytte begrenset på grunn av dets lave spesifisitet (20%), noe som kan føre til unødvendige biopsier og overbehandling [2]. Til tross for den store innsats i å søke etter biomarkører, forblir prostatakreft kliniske behandlingen fortsatt en utfordring, på grunn av suboptimal ytelse av eksisterende diagnostiske og prognostiske verktøy [3].
Studier som identifiserer og karakteriserer kreft bestemte avvikende molekylære hendelser også avsløre kandidater med potensial biomarkør verktøy [4]. Differensiell DNA-metylering er vanlig i prostata cancer som resulterer i hypermethylation ved promotoren av tumorsuppressorgener, hypometylering ved promoterene fra onkogener, og global hypometylering fører til genomisk instabilitet på senere stadier av prostatakreft [5], [6]. Noen av de vanligste rapporterte hypermethylated gener i prostatakreft omfatter GSTP1, RASSF1A, og APC, som har hjulpet i prostata kreft diagnose og prognose [7]. Prostatakreft er en heterogen sykdom, stiger antallet hypermethylated gener som prostata cancer skrider [8], [9]. Viktigere molekylære hendelser i PCa, for eksempel genfusjoner har nylig vist seg å bibringe differensiell DNA-metylering mønstre [5], [9]. Dette innebærer at PCa sykdom heterogeniteten kan bli bedre reflektert av differensial epigenetiske signaturer. Dermed karakterisering av forskjellig denaturert regioner (DMRs) har en høy sannsynlighet for å gi potensielle biomarkører med klinisk bruk for prostatakreft.
Medlemmer av desmosomal cadherin familien, inkludert desmocollins og desmogleins, finnes hovedsakelig i epitelceller der de utgjør de adhesive proteiner av desmosom celle-celle kryss og er nødvendig for celleadhesjon og desmosom formasjon [10], [11]. Nedsatt desmosomal protein funksjon er assosiert med multiple sykdommer [12]. En av de interessante funksjon er deres evne til å inhibere celle-motilitet, et fenomen av betydning i kreft [10]. Desmocollin 3 (DSC3), et medlem av superfamilien cadherin, bidrar til desmosom mediert celle-celle adhesjon [11]. Nyere studier har observert tap av DSC3 i flere krefttyper, som lymfeknutemetastaser av muntlig plateepitelkarsinom, brystkreft og tykktarmskreft, hvor redusert nivåer forbundet med kreft progresjon ble regulert av epigenetisk modifikasjon [13], [14], [15]. Men lite er kjent om uttrykket og reguleringsmekanismer av DSC3 i prostatakreft.
I denne studien analyserte vi uttrykket og metylering mønstre av DSC3 i prostata kreft, og enda viktigere utforsket den funksjonelle rollen DSC3 og dens potensielle klinisk prediksjon verdi.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og Vevsprøver
Alle prostata cellelinjer hentet fra American Type Culture Collection og prostata primære celler prec kjøpt fra Lonza ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2-cellekulturinkubator. Prostatakreft-cellelinjer ble holdt i DMEM (Invitrogen) (Du145) og RPMI (LNCaP, 22RV1) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Den normale prostata-cellelinjen ble opprettholdt i RWPE KSF media (Invitrogen) pluss 10 ng /ml EGF (Sigma) og bovint hypofyse-ekstrakt (BPE) og de primære prostataceller Prec ble dyrket i media PrEGM (Lonza). Prostata vevsprøver inkludert benign prostata (n = 18), prostatakreft (n = 34) ble hentet fra First Affiliated Hospital of the Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina). Vevsprøvene ble flash-frosset i flytende nitrogen på tidspunktet for innsamling og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter til å tillate bruk av prøver og kliniske data for undersøkelse. Denne studien omfatter mennesker ble godkjent av Etisk Råd Sun Yat-Sen University.
RNA ekstraksjon og kvantitativ RT-PCR
Total RNA isolert ved hjelp TRIzol (Invitrogen) ble benyttet i cDNA syntese (Superscript III, Invitrogen) i nærvær av vilkårlige primere (Invitrogen). Kvantitativ Real-time PCR (Q-PCR) ble utført ved hjelp av Power SYBR Grønn MasterMix (Applied Biosystems) på en Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System. Alle oligonukleotidprimere ble oppnådd fra Invitrogen og er oppført i tabell S1. GAPDH amplifisering ble benyttet som intern kontroll. MRNA uttrykk nivå ble bestemt som tidligere beskrevet, ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden [16].
KODE datasett og Methylplex NGS sequencing data analyse
infinium 450K Bead Array og Redusert representasjon Bisulfite Sekvense DNA metylering data fra KODE konsortium tilgjengelig som bruker spor i UCSC genom nettleser ble benyttet i denne studien [17]. De Methylplex NGS sequencing data tilpassede spor av benign cellelinje PREC og PCa cellelinjen LNCaP, prostata normal, godartet tilstøtende, lokalisert PCA og metastatisk PCA vev fra en nylig publisert studie av Kim et al. (Genome Res 2011) ble også lastet opp som spor i UCSC genom nettleser og visualisert [9]. Denne dype-sekvensering av data fra en tidligere utgitt datasett er deponert i NCBI GEO under tilgjengelighetsNummer: GSE27619.The DSC3 genomisk region «Chr18: 28,570,052-28,622,781» (Hg19) (inkludert både arrangøren og koding region) ble inspisert for differensial DNA metylering .
genomisk DNA, bisulfite konvertering og pyrosekvensering
genomisk DNA ekstrahert med QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) var bisulfite omregnes EZ DNA metylering gull kit (Zymo Research) og brukes som mal for PCR reaksjoner. DSC3 metylering ble estimert ved hjelp av PyroMark DSC3 metylering analyse (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble bisulfitt konverterte DNA, DSC3 primere, og Hotstart Master Mix (Qiagen) anvendt i en PCR-reaksjon for å amplifisere DSC3 genomiske regioner interesse fra prøven. Amplifikasjonen ble oppnådd fra 45 sykluser med 30 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 50 ° C og 40 sek ved 72 ° C, etter en innledende enzymaktivering i 15 minutter ved 95 ° C, og endelig forlengelse på 7 minutter ved 72 ° C. PCR-produktene ble fanget opp på streptavidin Sepharose-kuler (GE Healthcare), denaturert for å produsere enkelttråder, vasket og glødet til sekvense primer, og sekvensen ble bestemt ved anvendelse av PyroMark Q24 systemet (Qiagen). Den midlere metylering av tre enkeltposisjoner er vurdert i denne testen. Primer sekvenser er showet i tabell S1. Metylering nivåer individuelt for hvert CpG nettstedet og dets beregnede gjennomsnittsverdier er showet i tabell S2.
5-Aza-Deoxycytidine behandling
LNCaP celler seeded i seks-brønns plater ble behandlet på neste dag med indikerte konsentrasjoner av 5-Aza-deoksycytidin (Sigma) eller et tilsvarende volum av bærer (DMSO) i fem påfølgende dager. Vekstmedium inneholdende enten 5-Aza-deoksycytidin eller bærer ble byttet hver 24. time. Ved slutten av behandlingsperioden, ble total RNA isolert for å evaluere angitt transkripsjonen ekspresjon av Real Time RT-PCR.
Western Blot analyse
Protein fra cellelysatene ble isolert, og proteinkonsentrasjoner ble bestemmes av BCA kit. 20 ug protein ble separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (GE Healthcare). Membranen ble inkubert i en halv time i blokkeringsbuffer inneholdende 5% melk, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer, som omfatter E-cadherin antistoff (1:1000,3195S, Cell Signaling); Vimentin antistoff (1:1000,5741S, Cell Signaling) eller GAPDH antistoff (1:2000,5174, Cell Signaling). Etter flere vaskinger med Tris-buffret saltvann inneholdende Tween-20 (TBS-T), ble blottet inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Signalene ble visualisert ved forbedret chemiluminescence system som per produsentens protokoll (GE Healthcare).
RNA interferens
Celler ble sådd ut i 6-brønners plater på et ønsket tall og transfektert med DSC3 siRNA (Dharmacon ) eller ikke-måls siRNA to ganger. Transfeksjoner ble utført med OptiMem (Invitrogen) og oligofectamine (Invitrogen) i henhold til standard protokoller. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene trypsinert og sådd ut i triplikat ved 8000 celler per brønn i 24-brønners plater. Knockdown effektivitet ble bestemt av Q-PCR.
Cell Proliferation /Migration /Invasion analysen
Celleproliferering analysen ble gjennomført ved bruk av WST-1 Kit i henhold til produsentens instruksjoner (Clontech Laboratories). For Migration /Invasion ble cellene transfektert eller behandlet. Etter 24 timer ble cellene sådd på 8 mikrometer innsatser (BD Falcon) belagt med Matrigel (for invasjon analyser) eller ubestrøket (for motilitet analyser) i en 24-brønners kulturplater. Føtalt bovint serum ble tilsatt til det nedre kammer som et lokkemiddel chemo. Etter 72 timer, ble ikke-invaderende celler forsiktig fjernet av bomullspinne. Invaderende celler på den nedre side av kammeret ble farget med krystallfiolett og lufttørket. Relativ invasjonen ble kvantifisert ved oppløsning av krystallfiolett farge og måling av absorbans ved 560 nm.
Oncomine Expression og Outcome analyse
DSC3 uttrykk fra uavhengige publisert microarray studier ble hentet fra Oncomine database. Datasettene kan også fås fra NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) under deponerings tall, GSE35988 (Grasso et al,.); PMID: 19737960, (Arredouani et al,.) GSE3325 (Varambally et al,.); GSE3933 (Lapointe et al,.); og GSE21032 (Taylor et al.,). For Kaplan-Meier-analysen av Taylor et al., (Cancer Cell 2010) datasett [18], ble biokjemisk tilbakefall definert som en 0,2 ng /ml økning i PSA eller tilbakefall av sykdommen etter prostatektomi, som for eksempel utvikling av metastatisk kreft, hvis biokjemisk tilbakefall informasjon ikke var tilgjengelig. DSC3 uttrykk verdier ble kategorisert i lave og høye grupper i henhold til median cutoff.
Statistical Analysis
All statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism programmet. For kvantitative data, ble grupper rapportert som gjennomsnitt ± SEM og sammenlignet under anvendelse av uparede Students t-test eller enveis ANOVA test. For Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, ble log-rank test benyttet. Statistisk signifikans ble etablert på P . 0,05
Resultater
DSC3 uttrykk undertrykkes i prostatakreft
For å utforske uttrykk for DSC3 avskrift i prostatakreft og godartet vev, vi brukte Oncomine verktøy for å analysere flere publiserte microarray genuttrykkstudier. Vår analyse viste en sterk reduksjon i DSC3 mRNA uttrykk i prostata kreft vev sammenlignet med godartede prøver. Figur 1A viser nivåene av DSC3 transkripsjoner over fire uavhengige publiserte microarray studier [19], [20], [21], [22]. For å eksperimentelt bekrefte denne observasjonen, testet vi et panel av prostata cellelinjer inkludert LNCaP, DU145, 22RV1, godartede celler nemlig RWPE og PREC ved Q-PCR. I et mønster forenlig med microarray data godartet cellene viste høyere transkripsjoner uttrykk sammenlignet med kreft cellelinjer (Figur 1b). Lignende uttrykk mønsteret ble observert for GSTP1, en velkjent metylert genet i prostata cancer som vi anvendt som en positiv kontroll (figur 1C).
(A) fremstilling av boksplott DSC3 mRNA-ekspresjon i fire uavhengige prostata cancer microarray datasett, B = Benign, T = Tumor. Første forfatter og statistisk signifikans er angitt. (B) Q-PCR-analyse av DSC3 og (C) GSTP1 ekspresjon i et panel av prostatacellelinjer; Prec-prostata normale epitelceller, RWPE-godartet prostatacellelinje, LNCaP, Du145, 22RV1 er metastatisk prostatakreft cellelinjer.
DSC3 nedregulering ved PCA er mediert av arrangøren metylering
en detaljert undersøkelse av DSC3 genomisk organisering bruker UCSC genom nettleser avslørte tilstedeværelsen av et CpG øy i DSC3 genet regulatoriske region «Chr18: 28,570,052-28,622,781» (Hg19) rundt transkripsjon start stedet. Analyse av DNA-metylering i denne regionen i KODE Methyl 450K Bead Arrays og redusert representasjon Bisulfite Sequencing (RRBS) datasett [17] viste at DSC3 genpromoteren er hypermethylated i LNCaP sammenlignet med benigne cellelinjen Prec (figur 2A). I tillegg analyse av en uavhengig prostatakreft DNA metylering datasett [9] generert av Methylplex Next Generation Sequencing (M-NGS) avslørte også DSC3 promoter metylering i LNCaP og ikke i prec. I tillegg viste disse dataene også økt metylering i lokaliserte og metastatisk prostatakreft prøvene, og ikke i godartede eller normal prostata prøver (figur 2B). Både celle linje fra KODE [17] og cellelinje /vev datasettet fra M-NGS studie av Kim et al. [9], avslørte DNA-metylering var i en meget overlappende region innenfor DSC3 promoteren. Den basepar oppløsning på disse datasettene, tillot oss å nøyaktig hjem på kromosom regionen målrettet av DNA metylering. Ved hjelp av ovennevnte opplysninger vi neste eksperimentelt undersøkt kromosomale regionen i DSC3 promoter for metylering endring av pyrosekvensering analyse i et panel av prostata cellelinjer. Støtte trenden observert med offentlig tilgjengelige data pyrosekvensering analyse viste hyppig hypermethylation av DSC3 promoter i kreftcellelinjer (3/3) sammenlignet med godartede cellelinjer (0/2) (10% metylering som en cutoff) (figur 3B). For å teste hvorvidt DSC3 er epigenetiske til taushet ved metylering i prostata cancer, behandlet vi LNCaP-celler med et DNA-metylering inhibitor, 5-Aza-deoksycytidin (5-Aza). Transkriptet ekspresjon analyser av Q-PCR av både DSC3 og GSTP1, den sistnevnte anvendt som en positiv kontroll viste induksjon av begge disse mRNA ved 5-Aza behandling, og pyrosekvensering viste at en reduksjon av DNA-metylering av den DSC3 promotorområdet på 5- aza behandling (figur 3C KODE infinium 450K, oransje = metylert (poengsum ≥600), lys blå = unmethylated (0 poengsum ≤200). LNCaP (1): LNCaP-celler ble behandlet med androgen; LNCaP (2): LnCap data fra Duke University; LNCaP (3): LnCap data fra University of Washington. (B) Representasjon av MethylPlex NGS sekvense data (PREC, LNCaP, prostata normal, godartet tilstøtende, lokalisert PCA og metastatisk PCA vev) for DSC3. Denaturert regioner observert i de tilsvarende utvalgsgrupper er avbildet som topper og tall i y-aksen betegner topphøyder
(A) Sekvens av DSC3 promoter (Chr18: 28622751-28622860). Og region analysert med pyrosekvensering er gitt i blått (Chr18: 28622791-28622820) og CG posisjoner overvåke innenfor er angitt i rødt. CGI, CpG island. (B) Bar plottet viser gjennomsnittet av prosent metylering i de tre CG stillinger i prostata cellelinjer. Blue-prosent unmethylation; Orange-prosent metylering; Bi-sulfitt omdannes universelt metylert gDNA og føtal-DNA ble anvendt som positive og negative kontroller respektivt. (C) DSC3 uttrykk som bestemt ved Q-PCR i LNCaP-celler ble behandlet med 5-Aza-deoksycytidin (5-Aza), GSTP1 ble inkludert som en positiv kontroll. (D) Bar plottet viser gjennomsnittet av prosent metylering i de tre CG stillinger i LNCaP behandlet med 5-Aza.
DSC3 er nedregulert ved PCA og spår dårlig klinisk utfall
for å utforske uttrykk for DSC3 i prostata kreft vev, utførte vi Q-PCR på et panel av prostata vev inkludert benign prostata (n = 18), prostatakreft (n = 34). DSC3 uttrykk ble bemerkelsesverdig redusert i prostatakreft (2,4 ± 1,2) sammenlignet med godartede vev (21,8 ± 16,3) (4A B). Omtrent 25-40% av pasientene som ble behandlet ved radikal prostatektomi for klinisk prostatakreft vil oppleve tilbakefall av sykdommen, først angitt med en økning i serumnivået av PSA (biokjemisk tilbakefall) [23]. Dermed neste søkte vi å finne ut om DSC3 inaktive status ble assosiert med biokjemisk tilbakefall etter kirurgisk reseksjon. Mot dette har vi undersøkt Taylor et al. (Cancer Cell 2010) genuttrykk datasett [18], som karakteriserte svulster fra 140 pasienter som har tilbakefall informasjon (med 36 gjentakelser). Prøvene ble delt inn i høy og lav DSC3 grupper basert på DSC3 median uttrykk verdi. Kaplan-Meier analyse viste at lav DSC3 gruppe pasienter hadde en betydelig høyere risiko for tilbakefall enn de høye DSC3 gruppe pasienter (Hazard ratio: 2,352, 95% KI: 1,198 til 4,446, log rank p = 0,0125) (Figur 4C). Dette tyder på at DSC3 transkripsjon tap i prostata kreft kan forutsi dårlig klinisk utfall. Samlet tyder disse dataene DSC3, kanskje et medlem av cadherin super være å spille en viktig rolle i prostatakreft progresjon som fører til dårlig klinisk utfall.
(A) Q-PCR for DSC3 transkripsjon i en kohort av benign prostata ( n = 18) og prostatakreft (n = 34) vev. (B) Et sammendrag histogram av uttrykket verdiene av DSC3 i prostata godartede og tumorprøver. (C) Kaplan-Meier analyse viste at lav DSC3 gruppe pasienter hadde en betydelig økt risiko for tilbakefall enn de høye DSC3 gruppe pasienter (p = 0,0125).
Effekter av DSC3 på migrasjon /invasjonen potensial av prostata-celler
DSC3 er en av de adhesive proteiner av desmosom celle-celle kryss og er nødvendig for celleadhesjon. For å studere rollen DSC3 i prostata, transfektert vi godartede RWPE celler med enten kontroll eller DSC3 siRNA og utført spredning, migrasjon og invasjon analyser. Forbigående knockdown av DSC3 i RWPE resulterte i øket cellemigrering og invasjon (figur 5C), mens ingen signifikant effekt ble observert på celleformering (figur 5B). For å forstå mekanismen av DSC3 regulert migrasjon og invasjon, testet vi uttrykket av epitel-mesenchymale overgang (EMT) markør E-cadherin og vimentin i RWPE behandlet med enten kontroll eller DSC3 siRNA. Interessant, knockdown DSC3 i RWPE økt vimentin uttrykk mens hemme E-cadherin uttrykk (figur 5D). Dette antydet at DSC3 kan regulere prostata cellelinje migrasjon /invasjon potensial ved å fremkalle EMT. For å bestemme virkningen av DSC3 re-ekspresjon på funksjonen av prostataceller, migrering og invasive potensialet for kontroll og 5-Aza behandlede DU145-celler ble undersøkt. Induksjon av ekspresjon DSC3 på 5-Aza behandling av DU145-celler resulterte i en betydelig reduksjon av migreringen /invasjon potensialet til disse cellene. Videre behandling av disse cellene med DSC3 siRNA, delvis restaurert migrasjon /invasjonen potensial (figur 5F). Disse resultatene for gjengivelsesoverbevisende bevis for at den reduserte kreftcellemigrering /invasjon etter behandling med 5-Aza er hovedsakelig på grunn av induksjon av DSC3 uttrykk.
(A) DSC3 knockdown etter siRNA i benign prostata cellelinje RWPE som detektert av Q-PCR. * viser verdier som er vesentlig annerledes enn den ikke-Målgruppe (NT). siRNA # 2 og siRNA # 3 er to individuelle DSC3 siRNA. (B) Virkning av DSC3 knockdown på proliferasjon i RWPE celler ved WST-1. (C) Effekt av DSC3 knockdown på migrasjon gjennom Transwell og invasjon gjennom Matrigel i RWPE celler. Migrerte og invaderte celler ble farget med krystallfiolett, solubilisert og kvantifisert ved måling av absorbans ved 560 nm. * Indikerer verdier som er signifikant forskjellig fra den ikke-target-gruppe (NT). (D) E-cadherin og vimentin uttrykk vurderes av Western blot analyse i RWPE celle behandles med ikke-Target siRNA eller DSC3 siRNA. (E) Q-PCR for DSC3 hjelp total RNA hentet fra PCa cellelinje Du145 behandlet med 5-Aza eller DSC3 siRNA. (F) Et migrasjon og invasjon potensialet i den ubehandlede og 5-Aza-behandlede Du145 ble vurdert av Transwell eller Matrigel-analyse. Migrert og invaderte celler ble farget med krystallfiolett, oppløst og kvantifisert ved å måle absorbans ved 560 nm.
Diskusjoner
Desmocollin 3 (DSC3) ble funnet å være ofte nedregulert i flere kreftformer så som bryst, oral, kolorektal- og lungekreft, og inaktivering av DSC3 i disse kreftformene var forårsaket av promoter hypermethylation [13], [14], [15], [24]. Men lite er kjent om rollen DSC3 i prostatakreft. Mot dette vi først sammenlignet DSC3 uttrykk i prostatakreft fra publiserte microarray genuttrykkstudier bruker Oncomine verktøyet. Fire uavhengige PCA datasett avslørte at DSC3 ble betydelig redusert i prostata kreft vev sammenlignet med godartede prøver. Vår analyse viste også konsistent nedregulering av DSC3 mRNA i kreftcellelinjer. Deretter utforsket vi forskjellige offentlig tilgjengelige datasett for metylering status for DSC3 genet promoter i prostatakreft. Flere linjer av bevis basert på analyse ved hjelp av uavhengige plattformer som infinium metylering 450K Perler Arrays (kode), Redusert Representasjon Bisulfite Sequencing (KODE) som preget LNCaP og PREC celler, sammen med MethylPlex NGS sequencing studie som preget LNCaP, prec og prostatakreft klinisk eksemplarer som støttet differensial metylering av DSC3 genet promoter i prostatakreft. Vi viste også at DSC3 genet er epigenetiske forstummet i prostatakreft, som behandling av LNCaP celler med de-metylering middel 5-Aza, indusert DSC3 transkripsjon uttrykk. Vår nåværende studien viser altså at DSC3 uttrykk er ofte tapt i prostata kreft på grunn av arrangøren hypermethylation lik tidligere rapporter i andre solide tumorer [15], [24]. Viktigere DSC3 uttrykk i prostatakreft kliniske prøver var i stand til å forutsi dårlig klinisk utfall når analysert for biokjemisk tilbakefall.
En funksjonell studie utført hittil har identifisert DSC3 som en potensiell tumorsuppressorgen, stabil transfeksjon av en DSC3 ekspresjonsvektor i lungecancercellelinjer viste at ektopisk ekspresjon av DSC3 hemmet celleproliferasjon, forankrings-uavhengig vekst, migrering, samt invasjon [24]. Interessant vi observert en økning i celle migrasjon og invasjon av RWPE prostataceller når vi slått ned DSC3 genet ved hjelp av to spesifikke uavhengige siRNAs og ikke kontroll non-target siRNA. SiRNA mediert stanse av DSC3 viste ingen effekt på celleproliferasjon. I tillegg knockdown av DSC3 mens indusere vimentin proteinekspresjon, reduserte nivåene av E-cadherin, sannsynligvis noe som tyder på en EMT som fenotype når DSC3 genet er nedregulert. Mens de regulatoriske mekanisme som kontrollerer DSC3 uttrykk ikke er fullt ut forstått, er DSC3 en TP53 reaksjon gen og tilsetning av villtype TP53 ble funnet å være tilstrekkelig til å indusere ekspresjon av DSC3 i brystkreft [15], [25]. Derfor tap av TP53 funksjon gjennom somatisk mutasjon, som er hyppig observert i avansert prostatakreft, kan resultere i hypermethylation av sine mål gener. Et lignende forhold ble observert med ERG uttrykk og metylering status for dens målgen nemlig TDRD1 i prostatakreft [26], [27]. Men flere studier er nødvendig for å utforske de mekanismer som regulerer DSC3 i prostatakreft.
For å avklare uttrykk for DSC3 i prostata kreft vev kohort fra en kinesisk befolkning, utførte vi Q-PCR på prostata vev. DSC3 uttrykk ble betydelig og sterkt redusert i prostatakreft sammenlignet med godartet vev. Gitt sin inaktivering i PCA cellelinjer og vev, vil vi vurdere om DSC3 uttrykket er assosiert med dårlig klinisk utfall. I analysen ble det observert en sammenheng mellom nedregulering av DSC3 og betydelig høyere risiko for biokjemisk tilbakefall. Avvikende DNA-metylering av gen-promotorer er karakteristisk for kreftceller, og flere gener er epigenetiske endret på en bestemt måte kreft [28]. I prostatakreftpasienter, er korrelasjon mellom bestemt gen promoter hypermethylation og Gleason score, patologisk stadium eller tumorresidiv velkjent [29]. GSTP1 genpromoteren metylering er allment kjennetegnet ved flere uavhengige grupper, og er funnet å være ha diagnostisk verdi som en biomarkør i prostatacancerpasient vev eller kroppsvæske hjulpet i ikke-invasiv påvisning [30]. Hypermethylation av DSC3 ble tidligere rapportert som en markør for å forutsi klinisk resultat i tykk- og lungekreft [15], [24]. Dermed er flere studier på store prostata kreft vev kohorter samt kroppsvæsker for å ytterligere evaluere DSC3 som metylering biomarkør. Slike studier vil omfattende etablere sammenhengen mellom DSC3 promoter metylering og prostata kreft kliniske kjennetegn.
Konklusjon
I sammendraget, DSC3 nedregulert i prostata kreft ved DNA hypermethylation. Dette er den første studien, for å rapportere en detaljert analyse av DSC3 mRNA uttrykk og genet promoter metylering i prostatakreft. Analyse av uttrykk for DSC3 kan være nyttig for å forutsi kliniske resultater i pasienter med prostatakreft. Fremtidige studier er nødvendig å utvide disse observasjonene og undersøke spesielt den diagnostiske /terapeutiske potensialet i DSC3 i prostatakreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Oppsummering av Sekvenser av primere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0092815.s001 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Oppsummering av pyrosekvensering av tre CG posisjon i prostata cellelinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0092815.s002 plakater (XLSX)
Takk
Vi ville takke Dr. Saravana Mohan Dhanasekaran (University of Michigan) for å gi MethylPlex NGS sequencing data wiggle filer og diskusjon, Stephanie Huang for kritisk lesing, og KODE Project.
