Abstract
Heterogene atom ribonucleoparticule A1 /A2 (hnRNP A1 /A2) og skjøting faktor 2 /alternativ spleising faktor (SF2 /ASF) er avgjørende for forløperen messenger RNA (pre-mRNA) spleising. Interferon regulerende faktor-3 (IRF-3) spiller viktige roller i vertens forsvar mot virus og mikrobiell infeksjon. Avkortede IRF-3 proteiner som følge av alternativ spleising er identifisert og karakterisert som funksjonelle antagonister til full-lengde IRF-3. I denne studien undersøkte vi den molekylære mekanismen for skjøting regulering av IRF-3 pre-mRNA og først rapportert den regulerende effekt av hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF på IRF-3 skjøting og aktivering. RNA interferens-mediert nedbrytning av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler øket utelukkelse av eksonene 2 og 3 av IRF-3-genet og redusert uttrykk nivåer av IRF-3 protein og IRF- 3 nedstrøms effektor molekyler interferon beta og CXCL10 /IP-10. I tillegg er direkte binding av hnRNP A1 og SF2 /ASF til spesifikke bindingsmotiv i IRF-3 intron 1 ble bekreftet ved RNA-elektroforetisk mobilitet skift analyse. Etterfølgende minigenet spleising analysen viste at IRF-3 minigenes med mutert hnRNPA 1 /A2 eller SF2 /ASF bindende motiver økt utstøting av eksoner 2 og 3. Videre knockdown av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF hos NSCLC celler forsterket phytohemagglutinin-indusert tumor nekrose faktor-alfa-frigivelse av perifere mononukleære blodceller (PBMC), men undertrykkes den av interleukin-10 i NSCLC /PBMC-ko-kulturer. Til sammen tyder våre resultater at spesifikk knockdown for hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF økning utelukkelse av eksoner 2 og 3 av IRF-3-pre-mRNA og påvirke immunmodulerende funksjoner av humane NSCLC-celler
Citation:. Guo R, Li Y, Ning J, Sun D, Lin L, Liu X (2013) hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF Regulere alternativ spleising av Interferon Regulatory Factor-3 og påvirke Immunmodulerende funksjoner i human ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 8 (4): e62729. doi: 10,1371 /journal.pone.0062729
Redaktør: Luwen Zhang, University of Nebraska – Lincoln, USA
mottatt: 06.12.2012; Godkjent: 25 mars 2013; Publisert: 29 april 2013
Copyright: © 2013 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (Grant nr 30572072) til XL og av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Grant nr 5092009) og Natural Science Foundation National of China (Grant nr 30871366) for å YL. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Jinying Ning, som den tredje forfatteren av dette manuskriptet, var ansatt i selskapet Crown Biovitenskap Inc (Beijing). Han bidro noen analyseverktøy og gitt rådgivning til dette arbeidet. Ingen patenter vil bli delt av Crown Bioscience Inc (Beijing). Ingen produkter i utvikling og ingen markedsført produkter fra Crown Biovitenskap Inc (Beijing) ble brukt i dette forskningsarbeidet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Alternative forløper messenger RNA (pre-mRNA) spleising er et viktig posttranskripsjonelt mekanismen som cellene kan generere en mangfoldig repertoar av protein isoformene fra et mer begrenset antall gener [1]. Det er anslått at flertallet av humane multi ekson gener er alternativt spleiset [2]. Alternativ spleising spiller viktige roller i utvikling, fysiologi, og sykdom og prosessen med å fjerne introner selektivt og sammenføyning av rest eksoner er underlagt presis regulering og blir ofte forstyrret ved inflammatoriske forstyrrelser og kreft [3] – [6]. Tallrike undersøkelser har vist at enkelte RNA-bindende proteiner kan delta i reguleringen av inflammatoriske prosess og tumordannelse ved å regulere spleising eller mRNA-stabilitet av inflammation- og tumor-relaterte gener [4], [6] – [8]. To kjernefysiske RNA-bindende protein familier, familien av heterogene kjernefysiske ribonucleoproteins (hnRNP) og familien til serin /arginin-rike proteiner (SR), spille sentrale roller i regulering av alternativ spleising og mRNA stabilitet. Den hnRNP familien inneholder minst tjue medlemmer og binder seg hovedsakelig til sekvenser som kalles spleise lyddempere, som ligger i eksoner (ESSs, exonic spleise lyddempere) eller introner (ISSS, intronic skjøte lyddempere), for å fremme ekson eksklusjon og fungere som spleise repressors [9]. De mest tallrike og best karakteriseres proteiner av denne gruppen er hnRNP A1 og hnRNP A2, som deler en høy grad av sekvenshomologi og funksjonelle homologi [10]. Økende bevis har vist at hnRNP A1 og hnRNP A2 er over-uttrykt i ulike typer svulster og tjene som tidlige kreft biomarkører [7], [11] – [13]. HnRNP U, som en annen hnRNP familiemedlem, har blitt rapportert å forbedre TLR-indusert proinflammatorisk cytokin produksjon ved å stabilisere mRNA i makrofager [14]. Familien til SR proteiner, en annen regulator for alternativ spleising, inkluderer også mer enn tjue medlemmer. Disse proteinene binder seg til spleise enhancers som finne i eksoner (eses, exonic spleise enhancers) eller introner (ISES, intronic skjøting enhancers), og hovedsakelig fungere som antagonister av hnRNP proteiner [15]. Men en rekke studier har også vist at SR proteiner regulere ekson hoppe hendelser og ulike SR proteiner viser motsatte aktiviteter for å fremme ekson inkludering eller hoppe på de samme genene [16], [17]. Skjøting faktor 2 /alternativ spleising faktor (SF2 /ASF), som den beste karakterisert medlem av SR-familien, er blitt rapportert å være oppregulert i flere humane kreftformer, inkludert lungekreft og kreft i livmorhalsen, og spiller viktige roller i etableringen og opprettholdelse av celletransformasjon [8], [18] – [20]. Nyere forskning viser også at SF2 /ASF mediert IL-17-indusert mRNA stabilitet chemokin CXCL1 i menneskelige livmorhalskreftceller [21].
Den stadig voksende interferon regulerende faktor (IRF) Familien omfatter transkripsjonsaktivatorer og repressors som regulere genekspresjon kritisk for immunrespons, hematopoiese, celleoverlevelse og [22] – [24]. IRF-3 er unik blant IRF-familiemedlemmer ved at det er en nøkkel direkte transduser av viral dobbelt-trådet RNA og bakterielt lipopolysakkarid-mediert signalisering [25], [26]. IRF-3 tjener som en viktig transkripsjonen aktivator for type I interferoner (IFNα /p), en undergruppe av interferon-stimulerte gener samt noen kjemokin gener så som RANTES og CXCL10 /IP-10 og spiller viktige roller både i det medfødte immun respons mot viral infeksjon, og den påfølgende aktivering av adaptiv immunitet [27] – [31]. IRF-3-genet består av 8 eksoner og introner 7 og koder for et 427-aminosyreprotein. IRF-3 er et fosfoprotein, og består av en N-terminal DNA-bindende domene (DBD) (aminosyrene 1 til 110), en C-terminal IRF-assosiert domene (IAD, aminosyrene 198-374), og et trans domene (TAD, aminosyrer 134 til 394) [32]. Med sine kritiske roller i vertens forsvar, er aktiviteten av IRF-3 strengt kontrollert. IRF-3 er allment uttrykt og finnes hovedsakelig i en inaktiv cytoplasmisk form. Etter infeksjon, virus eller dobbelt-trådet RNA induserer fosforylering av C-terminale serin /treonin-rester og fører til en konformasjonsendring i IRF-3 med eksponering av både DBD og IAD domener, som videre resulterer i homo- eller heterodimerisering, cytoplasm- to-kjerne trans, tilknytning til CBP /P300 coactivators, og transcriptional aktivering av flere mål gener [33], [34].
Konstruksjonssikkerhet er viktig for IRF-3 for å utføre sin vanlige funksjon i utallige mobilnettet trasé , som er blitt demonstrert ved funksjonelle endringer som følge av alternativ spleising av IRF-3-pre-mRNA. IRF-3a er den første karakteriserte IRF-3 skjøting isoformen og den opprinnelige exon 2 som finnes i IRF-3 er erstattet av intron 2 [35]. IRF-3a-protein mangler en del av den N-terminale DBD av IRF-3, og er ute av stand til å binde til klassiske IRF bindende elementer, så som IFN-stimulerte responselementer (ISREs). Imidlertid har IRF-3a med en intakt IAD domene blitt vist å danne et heterodimer med IRF-3 følger viral infeksjon og hemme IRF-3 transkripsjonen aktivitet [36]. Nylig identifiserte vi fem nye spleisevarianter av IRF-3, referert til som IRF-3b, 3C, -3D, -3e, og -3f, og avslørte at disse spleisevariantene er dannet ved delesjon av exon 2, 3, eller 6 eller en kombinasjon av disse [37]. Disse nye spleise isoformer ble betinget å miste hele regionen av DBD domenet (IRF-3b-3C, -3D, og -3f) eller mister deler av TAD og IAD domener (IRF-3b, -3D, og -3e ). I tillegg har vi også vist at disse nye spleise varianter ble uttrykt i ulike typer humane celler og vev, og så ut til å fungere som negative modulatorer av IRF-3 og redusere trans av IFNβ arrangøren i forskjellig grad. Disse etablerte strukturelle og funksjonelle endringer på grunn av alternativ spleising garanterer videre etterforskning av den molekylære mekanismen for skjøting regulering av IRF-3 pre-mRNA.
I denne studien, RNA interferens-mediert uttømming av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i menneskets ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler økt utstøting av eksoner 2 og 3 av IRF-3 pre-mRNA. Ved å bruke sekvensanalyse og programmer som ESE Finder, identifiserte vi hnRNP A1 /A2 bindingssetet (UAGGGA) og SF2 /ASF bindingssetet (GGAAGGA) i IRF-3 intron 1. Etterfølgende elektromobilitet shift analyse (EMSA) med villtype ( wt) RNA sonde eller RNA med mutasjon i disse bindingsseter og mutant IRF-3-minigenet spleising analyse bekreftet tilstedeværelsen av hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF-bindende motiv i IRF-3 intron 1. Videre er innflytelsen av endring av IRF- 3 skjøting mønster på uttrykk for nedstrøms målgener og på cytokin produksjon i NSCLC /perifert blod mononukleære celler (PBMC) co-kulturer ble også evaluert.
Materialer og metoder
Cell Kultur og RNA interferens
Menneskelig NSCLC cellelinjer A549 og Calu-6 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia). Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C med 5% CO
2.
Små interferens RNA (sirnas) rettet mot hnRNP A1, A2 hnRNP, SF2 /ASF, eller polypyrimidine kanalen bindende protein (PTB eller hnRNP I) mRNA ble selektert og siRNA transfeksjoner ble utført som beskrevet [7] [38]. På grunn av funksjonell redundans av hnRNP A1 og hnRNP A2 rapportert tidligere, ble sirnas av disse to genene transfektert samtidig. Kort sagt ble eksponentielt voksende A549 og Calu-6-celler sådd ut i 6-brønns plater (2 x 10
5 celler /brønn). Neste dag, 80 pmol hnRNP A1 og hnRNP A2 (hver 40 pmol), 40 pmol av SF2 /ASF, eller 40 pmol PTB duplex RNA (Beijing DNA-SYN Bioteknologi Co, Beijing, Kina) ble blandet med 6 pl Oligofectamine transfeksjon reagens (Invitrogen) pluss 250 pl opt-MEM-medium (Invitrogen) i 20 minutter og ble deretter tilsatt til cellene, henholdsvis. Etter transfeksjon i 48 timer ble cellene ytterligere transfektert med 20 pmol av dobbelt-trådet RNA-Poly (I: C) (Sigma, St. Louis, MO) for å aktivere signalisering gjennom IRF-3 pathway. Etter Poly (I: C) stimulering i 24 timer, ble totalt cellulært RNA og protein isoleres for videre analyse. For spesifikke siRNA transfections ble feilaktige siRNA transfeksjon brukt som mock-transfektert kontroll.
Total RNA Isolation og Semi-kvantitativ RT-PCR
Totalt cellulært RNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Omtrent 3 pg av total RNA fra hver cellelinje ble spaltet med RNase-fri DNase (Promega, Madison, WI) for å fjerne DNA-kontaminering og revers transkribert inn i cDNA ved anvendelse av Superscript III System (Invitrogen). For å undersøke mRNA-ekspresjonsnivåene av mål-gener i celler, ble type-spesifikke primersettene utformet og de tilsvarende PCR-produktene ble sekvensert for å bekrefte transkripsjon nøyaktighet. Primersettene, glødetemperatur for forsterkning, og lengden av PCR-produkter er angitt i tabell 1. Den PCR-blanding besto av 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 200 pmol av hvert primer, 2 U Taq DNA-polymerase (Promega), og en 1-2 pl av prøve cDNA. De resulterende fragmenter ble underkastet elektroforese på en 1,2 til 2,5% agarosegel og visualisert med etidiumbromidfarging. Alle PCR-reaksjoner ble gjentatt med reproduserbare resultater. β-aktin ble benyttet som intern kontroll, og total-RNA ekstrahert fra de samme celler uten revers transkripsjon ble anvendt som negativ kontroll. For å sikre at PCR-reaksjonene faller innenfor det lineære området av amplifikasjon, ble de riktige antall sykling for amplifisering av hver kontroll eller målgenet undersøkt (data ikke vist).
Western Blot analyse
Cellene ble lysert i 30 minutter i lyseringsbuffer (15 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, og 1 mM DTT) supplementert med proteasehemmere, og løsningen ble fjernet ved sentrifugering ved 12 000 rpm i 15 min. Totalt protein (25 ug) i 1 x natriumdodecylsulfat (SDS)-prøvebuffer ble separert ved 10% SDS-PAGE og elektro-overført til nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Chicago, IL). Membranene ble deretter blokkert med 5% fettfri melk og undersøkt med spesifikke primære antistoffer: anti-hnRNP A1 (Proteintech Group, Inc., Chicago, IL), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA), anti-PTB (Proteintech), anti-aktin (i-19) (Santa Cruz), eller anti-IRF-3 (Proteintech) (1:1000 til 1:3000 fortynning), respektivt. Etter vask med 0,2% Tween 20 /PBS buffer tre ganger, ble membranene inkubert med pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff og visualiseres ved hjelp av forbedret chemiluminescence system, ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
Elektro Mobility Shift analyse (EMSA)
sekvensen av intronet en av IRF-3-pre-mRNA, oppstrøms for exon 2 5 «spleisesete, inneholder UAGGGA sekvens som er den samme som den konsensus hnRNP A1 /A2 høy affinitetsbinding område identifisert ved SELEX, UAGGG (A /U) [39]. Ved å bruke ESE Finder program, ble to andre bindingsseter (GGAAGGA) av SF2 /ASF identifisert umiddelbart oppstrøms for exon 2 5 «spleisesetet. For å utforske muligheten for at hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF binder seg til disse bindende motiver, fusjonsproteiner GST-hnRNP A1 og GST-SF2 /ASF ble uttrykt av IPTG induksjon og renset med glutation Sepharose 4B. Syntetiske RNA-oligonukleotider inneholdende villtype bindingsmotiver for hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF (wt-A1 eller wt-SF2), den G3C mutant bindingsmotiv for hnRNP A1 /A2 (mu-A1), eller den G2C mutant bindingsmotiv for SF2 /ASF (mu-SF2) ble biotinylert med Pierce RNA 3 «End Biotinylation Kit (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) i henhold til produsentens instruksjoner. Gel-skiftreaksjoner ble utført ved anvendelse av LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce) i henhold til produsentens beskrivelse. Kort sagt ble 20 fmol av biotinylerte villtype eller mutante RNA-prober ble inkubert med 50 ng av renset GST fusjonsproteiner i 20 minutter ved romtemperatur i en 20 ul bindingsreaksjon inneholdende 2 ug tRNA. EMSA reaksjonene ble underkastet elektroforese på en 6% nativ PAGE, overført til en positivt ladet nylonmembran (Amersham), og deretter kryssbundet ved hjelp av en GS Gene Linker UV kammer (BioRad, Hercules, CA). Påvisning av biotinylert RNA ble utført ved anvendelse av stabilisert streptavidin /pepperrotperoksidase-konjugat (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner. For å demonstrere spesifisitet av protein-RNA kompleks formasjon, ble renset GST protein som brukes for EMSA reaksjon og fungerte som negativ kontroll.
IRF-3 minigenet Bygg og Transfeksjon
En vill type minigenet inneholder relevant IRF-3 genomisk region fra ekson 1 til ekson 4, og flankerer regioner ble klonet inn pcDNA3.0 vektor (Invitrogen) ved hjelp av
KPN
i og
Eco
RI skjære nettsteder. Den intron 1 av wt-IRF-3 minigenet inneholder de antatte bindingsseter for hnRNP A1 /A2 (wt-A1) og SF2 /ASF (wt-SF2). Minigenes med G3C muterte bindingssetet for hnRNP A1 /A2 (mu-A1) eller G2C mutant bindingssetet for SF2 /ASF (mu-SF2) ble samlet gjennom en to-trinns PCR-overlappsforlengelses [40] med wt-IRF -3 minigenet konstruere som en mal. Alle ekspresjonskassetter er under kontroll av CMV-promoteren og en polyA-signal. Alle konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering. Villtype og muterte minigenet vektorene ble transfektert inn i A549-celler. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble cellene samlet og de relative uttrykk nivåer av IRF-3-isoformene ble analysert ved hjelp av RT-PCR.
Isolering og dyrking av perifere mononukleære blodceller (PBMC) og co-dyrking med A549-celler
studiet protokollen og samtykke dokumenter ble godkjent av etikk og fagkomiteene av Peking University første sykehuset. Perifer vene blodprøver ble tatt fra friske givere med informert samtykke. Isolering og dyrking av PBMC ble utført som tidligere beskrevet [41]. Kort fortalt PBMC ble isolert fra perifert blod ved hjelp Histopaque®-1077 (Sigma) etter produsentens anvisninger. For dyrking av PBMC, ble cellene resuspendert i RPMI 1640 supplert med 5% varme-inaktivert FBS (Invitrogen), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 5 ug /ml fytohemagglutinin (PHA) (Sigma) og 10 mM HEPES og sådd ut ved 2 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater.
For etterfølgende ko-dyrking med PBMC, A549 celler ved 60-80% konfluens ble transfektert med spesifikke sirnas som beskrevet ovenfor. Ved 48 timer etter transfeksjon ble cellene transfektert med ytterligere Poly (I: C). Fire timer senere ble mediet endret til PBMC ko-kulturmedium [RPMI 1640 supplert med 10% varme-inaktivert FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1 ug /ml PHA og 10 mM HEPES]. PBMC (5 x 10
6 celler) ble sådd ut Transwell-Clear innsatser (0,4 um porestørrelse, Costar Group, Washington, DC) og plassert på toppen av A549 kulturer. Ko-dyrking ble utført i 72 timer, og kulturmediet ble så oppsamlet for videre analyse.
Påvisning av IFNβ, CXCL10 /IP-10, TNF-α, og IL-10 ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA )
Konsentrasjoner av IFNβ (Pierce), CXCL10 /IP-10 (SABiosciences, Frederick, MD), tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) (SABiosciences) og interleukin-10 (IL-10) (SABiosciences) i cellekultursupernatanter ble bestemt ved ELISA i henhold til produsentens instruksjoner. Dataene ble målt ved 450 nm med en mikroplateleser BioRad.
immunhistokjemisk farging
For immunhistokjemisk analyse av ekspresjonen av hnRNP A1, A2 hnRNP, SF2 /ASF, og IRF-3, 63 parafininnstøpte humane NSCLC tumorvev, 39 tilstøtende ikke-tumorkontroll vev, og 26 bronchiectasis vev ble hentet fra Peking University Først Hospital, Beijing, Kina. Denne studien ble godkjent av både etikk og fagkomiteene av Peking University første sykehuset, og informert samtykke ble innhentet fra hvert fag.
Alle vev ble parafin-embedded og ble farget med S-P immunhistokjemisk metode. I korthet, ble objektglassene deparaffinised i xylen, rehydratisert i gradert etanol, og deretter behandlet med PBS inneholdende 3% hydrogen dioksyd for å blokkere endogen peroksidase. Etter preincubating i 10% geiteserum for ikke-spesifikk binding blokk, ble objektglass og deretter inkubert med spesifikke primære antistoffer: anti-hnRNP A1 (Proteintech), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz), eller anti-IRF-3 (Proteintech) ved 4 ° C over natten. Etter skylling ble snittene deretter inkubert med biotinylerte immunoglobuliner i 15 minutter og deretter med streptavidin-peroksidase-konjugat i 15 min. Signalene ble utviklet med DAB-H
2o
2-løsning. Objektglassene ble motfarget med hematoksylin 5%, og deretter undersøkt ved hjelp av lysmikroskopi. Seksjoner uten primært antistoff behandling ble anvendt som negativ kontroll. Den farging ble scoret på en skala fra 0 til IV som følger: 0, mindre enn 5% celler ble farget; Jeg, 5-25% cellene ble farget; II, 25-50% celler ble farget; III, 50-75% celler ble farget; og IV, mer enn 75% celler som var farget. Poeng II-IV ble klassifisert som positive, mens skåren 0 og jeg var negative.
Statistical Analysis
SPSS 15,0 programvare (SPSS Inc, Chicago, IL) ble brukt for å bestemme statistisk signifikans. De kontinuerlige variabler fra forskjellige grupper ble vist som gjennomsnitt ± S.D. og ble sammenliknet med
t
test. Chi-kvadrat test ble brukt til å analysere betydning for hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, og IRF-tre uttrykk mellom ondartede og godartede lungevev grupper studert. Verdier av
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
knockdown av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i Human NSCLC Cells Øker Utelukkelse av Eksoner 2 og 3 av IRF-3 Gene
for å undersøke den mulige effekten av hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF på spleising regulering av IRF-3-genet, utførte vi siRNA-mediert uttømming av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF hos NSCLC celler A549 og Calu-6. Etter siRNA transfeksjon og påfølgende Poly (I: C) stimulering av IRF-3-signalveien, totalt cellulært RNA og protein ble isolert og overflod av hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF mRNA og protein ble bestemt ved semi-kvantitativ RT-PCR og Western blot-analyse, respektivt. Sammenlignet med mock-transfektert kontroll ekstrakter, uttrekk fra både A549 og Calu-6 celler transfektert med spesifikke sirnas viste markert reduksjon i uttrykket nivåer av målgener (fig. 1B og 1C). Som forventet, ble det SF2 /ASF siRNA transfeksjon ikke påvirke nivåene av hnRNP A1 /A2, og vice versa.
(A) Skjematisk diagram som viser tre spleisevarianter FL-IRF-3 (full-lengde IRF -3), Type I (bare E2 eksklusjon) og Type II (både E2 og E3 eksklusjons) isoformer. E, exon. IRF-3 eksoner fra 1 til 4 er nummerert. Den svarte heltrukne linjen representerer introner. Pilene over transkripsjoner viser plasseringen av spesifikke primersett utformet for RT-PCR analyse av IRF-3 spleisevarianter. (B) skjøting faktorer hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF ble utarmet av spesifikke siRNA transfeksjon i humane NSCLC-celler A549 og Calu-6, henholdsvis. A1, hnRNP A1; A2, hnRNP A2. Den feilaktige kontroll siRNA ble brukt for mock-transfektert kontroll. Etter siRNA transfeksjon og påfølgende Poly (I: C) stimulering ble cellene høstet og semikvantitativ RT-PCR ble utført for å bestemme effekten av RNA-interferens på ekspresjon av målgener og IRF-3-spleisevarianter. Produkter som tilsvarer FL-IRF-3 og dens to typer spleisevariant (type I og type II) er angitt med piler. For alle reaksjoner, ble total RNA ekstrahert fra A549 celler uten revers transkripsjon anvendt som negativ kontroll. PCR produkter av FL-IRF-3, Type I og Type II-isoformene ble kvantifisert ved TotalLab Quant skanning. Grafen viser forholdet isoformen FL /(FL + I + II), og verdiene er gjennomsnitt ± SD for n = 3 forsøk. (C) Western blot-analyse ble utført med antistoffer rettet mot proteinene som er angitt på høyre side. Protein band av IRF-3 ble også kvantifiseres og normalisert til intern kontroll Actin. Grafen viser forholdet IRF-3 /aktin og verdiene er gjennomsnitt ± SD for n = 3 forsøk.
#
P Hotell og
##
P
. 0,05 sammenlignet med mock-transfektert A549 og Calu-6 celler, henholdsvis
av de IRF-3 spleisevarianter, IRF-3b, 3C, -3D, og -3f mister exon 2 eller begge ekson 2 og ekson 3 [37]. For å analysere endring av alternativ spleising av IRF-3 i siRNA-transfekterte celler, ble RT-PCR-amplifisering av IRF-3 utført ved hjelp av særskilte primersettene med forover primer lokalisert i exon 1 og revers primer i exon 4. Som vist i fig. 1A og 1B, full-lengde IRF-3 (FL-IRF-3) og de to typer skjøte variant (Type I: bare exon 2 utelukkelse og Type II: både exon 2 og ekson 3 utelukkelse) som genereres tre bånd: 500 bp (E1 + 2 + 3 + 4), 327 bp (E1 + 3 + 4), og 155 bp (E1 + 4) i lengde, henholdsvis. Som for A549-celler, kombinert uttømming av hnRNP A1 og hnRNP A2 og enkel tømming av SF2 /ASF både medførte tydelig reduksjon i FL-IRF-3 mRNA, fra 67% til 9% eller 11%, og samtidig økning i mRNA of Type I og II isoformer (fig. 1B). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av Calu-6-celler, med knockdown av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF noe som resulterer i reduksjon fra 91% til 13% eller 15% FL-IRF-3 mRNA (fig. 1B). Enkelt hnRNP A1 eller A2 hnRNP uttømming ble også utført i NSCLC-celler og viste ingen effekt på IRF-3 spleisemønsteret (data ikke vist). I samsvar med RT-PCR resultater, hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF uttømming resultert i åpenbar nedgang i uttrykk nivåer av IRF-3 protein i både A549 og Calu-6 celler (Fig. 1C).
For å undersøke mer direkte spesifisitet hnRNP A1 /2 eller SF2 /ASF utarming og ekson hoppe av IRF-3 pre-mRNA, brukte vi siRNA å utarme PTB, en annen rik negativ regulator av alternativ spleising. PTB uttømming viste ingen effekt på spleisemønsteret av IRF-3 (fig. 2A og 2B).
skjøting faktor PTB ble oppbrukt av spesifikk siRNA transfeksjon i humane NSCLC-celler og A549 Calu-6. Den feilaktige kontroll siRNA ble brukt som mock-transfektert kontroll. Etter siRNA transfeksjon og påfølgende Poly (I: C) stimulering, totalt cellulært RNA og protein ble samlet og testet ved semi-kvantitativ RT-PCR (A) og Western blot-analyse (B) for å undersøke uttrykket nivåer av målgener og IRF- 3 spleisevarianter som er angitt på høyre side. For RT-PCR-reaksjoner, ble total RNA ekstrahert fra A549 celler uten revers transkripsjon anvendt som negativ kontroll. For all RT-PCR og Western blot analyse, ble Actin brukt som intern kontroll.
hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF binde spesifikt til sekvenser i IRF-3 Intron en
grunnet identifiseringen av hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF-bindingsmotiv umiddelbart oppstrøms for IRF-3 exon 2 5 «spleisesete (fig. 3A), vi utforsket mulighetene videre at hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF binder spesifikt disse bindende motiver. Fusjonsproteiner GST-hnRNP A1 og GST-SF2 /ASF ble uttrykt ved IPTG-induksjon og renset med glutation Sepharose 4B (fig. 3B). GST fusjonsproteiner ble inkubert med biotinylerte RNA-prober inneholdende de UAGGGA eller GGAAGGA sekvenser av IRF-3 intron 1 og EMSA-analyse ble utført. Som vist på fig. 3C, klare skift band ble funnet med GST-hnRNP A1 og GST-SF2 /ASF proteiner. Videre G3C mutasjon av UAGGGA motiv og G2C mutasjon av GGAAGGA motiv ført til stor nedgang i hnRNP A1 og SF2 /ASF bindende. Disse data bekreftet tilstedeværelsen av hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF bindingsseter oppstrøms for exon 2 5 «spleisesete av IRF-3-pre-mRNA.
(A) Sekvenser av intron 1 (439-462) og intron 1 (558-600) av IRF-3. De antatte bindingsseter for hnRNP A1 /A2 (wt-A1) eller SF2 /ASF (wt-SF2) er angitt i fet kursiv. Den G3C mutant bindingssete for hnRNP A1 /A2 (mu-A1) og G2C mutant bindingssetet for SF2 /ASF (mu-SF2) er understreket. (B) Fusion proteiner GST-hnRNP A1 (GST-A1) og GST-SF2 /ASF (GST-SF2) ble uttrykt av IPTG induksjon og renset med glutation Sepharose 4B. (C) Tjue nanogram hver GST, GST-A1, og GST-SF2 protein ble brukt for elektromobilitet skift analysen med biotinylerte RNA-prober WT-A1 eller wt-SF2 og deres mutante derivater.
IRF-3 Minigenes med mutert hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF Binding motiver Øk Utelukkelse av Eksoner 2 og 3
for ytterligere å utforske rollene til hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF bindende motiver i spleising regulering av IRF -3-genet, IRF-3 minigenes inneholdende villtype eller mutante hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF-bindende motiv ble konstruert og transfektert inn i A549-celler (fig. 4A og 4B). De relative ekspresjonsnivåer av IRF-3-isoformer ble målt ved hjelp av RT-PCR-analyse. Sammenlignet med villtype minigenet transfeksjon, mutasjon av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF-bindingsseter ga tydelig reduksjon i forholdet isoformen FL /(FL + I + II), fra 79% til 23% eller 28% (begge
P
0,05), henholdsvis, slik som vist i fig. 4B og 4C.
(A) villtype (wt) og mutant (mu) versjoner av IRF-3-minigenet er vist. PCMV, arrangøren av pcDNA3.0 vektor. pA, polyA signal. IRF-3 eksoner fra 1 til 4 er nummerert. Den svarte heltrukne linjen representerer introner. (B) Transient transfeksjon av vill-IRF-3 eller mu-IRF-3 minigenes ble utført i A549-celler, og de relative uttrykk nivåer av IRF-3-isoformer ble målt ved hjelp av RT-PCR-analyse. (C) Et diagram som viser forholdet isoformen FL /(FL + I + II), og verdiene er gjennomsnitt ± SD for n = 3 forsøk.
#
P Hotell og
##
P
. 0,05 i forhold til vekt-IRF-3 minigenet transfeksjon
siRNA-mediert Nedbryting av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF Reduserer uttrykk for IRF-3 Nedstrøms Effector molekyler IFNβ og IP-10
for å utforske effekten av IRF-tre alternativ spleising regulert av knockdown av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF på ekspresjon av IRF-3-induserbare gener, det isolert total RNA fra A549 og Calu-6 celler etter spesifikk siRNA transfeksjon og påfølgende Poly (i: C) stimulering og utført semikvantitativ RT-PCR for å analysere uttrykket nivåer av IFNβ og IP-10 gener. Videre supernatanten av cellekulturen ble også samlet opp og IFNβ og IP-10 proteiner ble undersøkt ved ELISA-analyse ved anvendelse av anti-IFNβ eller anti-IP-10-antistoffer, henholdsvis. Som vist i fig. 5A og 5B, A549 og Calu-6 celler uten Poly (I: C) stimulering viste meget lave nivåer av IFNβ og IP-10, sammenlignet med celler med Poly (I: C) stimulering. Som forventet, ble nedregulering av IFNβ og IP-10 gener i både mRNA og proteinnivåene Parallelt med signifikant redusert ekspresjonsnivåer av IRF-3-protein i både A549 og Calu-6-celler transfektert med hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF siRNA (fig. 1C, 5A og 5B).
A549 og Calu-6-celler ble utført spesifikk siRNA-mediert knockdown av hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF. Mock, celler transfektert med feilaktige kontroll siRNA. Control, celler uten spesifikk eller håne siRNA transfeksjon og Poly (I: C) stimulering. (A) Når siRNA transfeksjon og påfølgende Poly (I: C) stimulering, mRNA ekspresjon av IFNβ og IP-10-genene ble analysert ved semi-kvantitativ RT-PCR. Total RNA isolert fra A549 celler uten revers transkripsjon ble anvendt som negativ kontroll. (B) sekresjon av IFNβ (øverst) og IP-10 (bunn) proteiner ble undersøkt ved hjelp av ELISA-analyse. Verdien for hver analyse er presentert som gjennomsnitt ± S.D. Som vist på fig.
