Abstract
DNA metylering er en epigenetisk mark i forbindelse med regulering av transkripsjon og genomstruktur. Disse markørene har vært undersøkt i en rekke kreft innstillinger for deres anvendelighet i å skille normalt vev fra tumorvevet. Her undersøker vi det direkte sammenheng mellom DNA metylering og pasient overlevelse. Vi finner at endringer i DNA metylering av nøkkel bukspyttkjertelen utviklings gener er sterkt assosiert med pasientens overlevelse
Citation. Thompson MJ, Rubbi L, Dawson DW, Donahue TR, Pellegrini M (2015) bukspyttkjertelkreft pasient overlevelse relaterer med DNA metylering av Pancreas Development gener. PLoS ONE 10 (6): e0128814. doi: 10,1371 /journal.pone.0128814
Academic Redaktør: Max Costa, New York University School of Medicine, USA
mottatt: 05.01.2015; Godkjent: 30 april 2015; Publisert: 03.06.2015
Copyright: © 2015 Thompson et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Dataene for denne studien er nå tilgjengelig på Gene Expression Omnibus (GEO) under tiltredelse kode GSE67205. Det finner du her: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67205
Finansiering:. Støtte for bukspyttkjertelen vev bank (DWD) ble gitt av Hirshberg Foundation for bukspyttkjertelen Research. M.J.T. ble støttet av tilskuddet P01 GM099134
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært noen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft-dødsfall i USA [1]. Den 5-års overlevelse på 6% for pasienter med bukspyttkjertel duktale adenokarsinomer (PDAC) er den laveste for noen solid kreft. Tidlig påvisning er ansett som viktig for å forbedre pasientens overlevelse som de fleste pasienter til stede med avansert, ikke-operable sykdom [2, 3]. Nylige fremskritt innen teknologi for genom målinger heve håp for identifisering av slike tidlige biomarkører, samt nye terapeutiske mål.
Flere dype sekvense innsats har identifisert et stort antall svært heterogene mutasjoner (~ 63 i gjennomsnitt) med fire mutasjoner som forekommer ved høy frekvens (KRAS, CDKN1A /P16, TP53 og SMAD4) i PDAC [4, 5] Disse nøkkel mutasjoner er blitt vist å mekanistisk drive tumorgenese i dyremodeller med SMAD4 assosiere med dårlig prognose [6]. Genekspresjon analyse av primære tumorer har muliggjort konstruksjon av multi-genet profiler som kan forutsi metastatisk sykdom og kortere pasientoverlevelse i uavhengige datasett, men disse har ikke vært brukt i klinisk beslutninger [7, 8]. Ved å kombinere flere sett med kliniske data, tre molekylære undergrupper av PDAC som forutsi overlevelse og respons på behandlingen i eksperimentelle modeller har blitt utviklet [9]. Nylig ble 171 gener med prediktiv biomarkør potensial identifiseres ved å kombinere mRNA uttrykk, DNA kopiantall variasjon og miRNA nivåer [10].
Men til dags dato mindre er kjent om endringer i DNA metylering over kreft i bukspyttkjertelen subtyper. DNA metylering har fått mye senere interesse for sin rolle i kreft biologi. Avvikende mønstre av DNA-metylering er kjent for å være assosiert med kreftutvikling og for å påvirke reguleringen av genomet stabilitet og gentranskripsjon [11]. Genom-wide studier av CpG øyer har avdekket tusenvis av loci der differensial metylering kan skille bukspyttkjertelen svulstvev fra normalt vev [12, 13]. Til tross for denne fremgangen, bruk av endringer i DNA metylering for å forutsi bukspyttkjertelen pasient overlevelse forblir uutforsket.
Her er vi undersøke direkte sammenheng mellom PDAC pasient overlevelse og metylering av individuelle CpG områder hentet fra redusert representasjon bisulfite sekvensering ( RRBS). Mange statistisk signifikante endringer i metylering direkte korrelert med pasientens overlevelse. Vi har observert en sterk anrikning av disse områdene blant gener som er involvert i celle-skjebne bestemmelse i bukspyttkjertelen. I motsetning til sekvenseringsarbeidet som identifiserte cellulære signalveier, disse resultatene tyder på at celleidentitet, som diktert av svulsten epigenome, kan være en viktig bestanddel av klinisk aggressiv PDAC. Endelig har vi ytterligere validert evne til noen eksempelsider for å skille pasienter basert på overlevelse ganger, noe som tyder på muligheten for å utvikle kliniske biomarkører basert på mer omfattende metylering analyse.
Resultater
Clinicopathologic karakteristikk av prøvene
Tabell 1 gir en oppsummering av statistikk for pasientene som brukes i dette arbeidet. Individuelle pasientdata kan bli funnet i S1 tabell. Alle pasientene hadde tidlig stadium PDAC og fått adjuvant kjemoterapi. Ved tidspunktet for analyse, 9 pasienter hadde tilbakevendende sykdom (median sykdomsfri overlevelse (DFS) av 15,0 måneder), mens 9 pasienter hadde dødd av sykdom (median sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) av 25,0 måneder). DFS refererer til intervallet mellom behandling eller fjerning av tumoren og tilbakefall av sykdommen, mens DSS refererer til intervallet mellom opprinnelige diagnosen og pasientens død hvor dødsårsak var sykdommen. For dette arbeidet har vi benyttet DSS eksklusivt. På tidspunktet for denne analysen 9 pasienter var døde og to var fortsatt bor. Disse clinicopathologic egenskaper og overlevelses utfall er lik andre publiserte årskull av PDAC.
Redusert-representasjon bisulfite sekvense
Kartlegging av alle kvalitet leser til referanse menneskelige genom (hg19) ga ~ 5 millioner CpG områder hvor en trygg metylering frekvens kan bli estimert i det minste en av de 16 prøver. Anvendelse av data kvalitet filtre forklart ovenfor redusert dette til et endelig antall 251,566 metylering nettsteder som brukes i alle etterfølgende analyse.
Principal Component Analysis Skiller Tumor fra Non-tumor
Prinsipal komponent analyse (PCA ) av metylering profiler for de 16 prøvene ble utført. Figur 1 viser en projeksjon av prøvene på de første to hovedakser. Langs den første prinsipp komponenten det er separasjon av tumorprøver. Langs den andre aksen prinsipp er det et klart skille mellom tumorprøver og de normale og pankreatitt prøver. Den første komponenten forklarer 24% av variansen i metylering data mens den andre komponenten forklarer ytterligere 21%.
For å få innsikt i biologien som ligger under separasjonen av prøvene langs de to hovedkomponenter, har vi valgt de 500 største størrelses koeffisienter for både positive og negative retninger langs hver akse. Ettersom disse koeffisientene tilsvarer CpG områder, sendes vi dem til Genomisk Regioner berikelse av merknader Tool (stor) server for annotering [14]. For det første prinsippet aksen (se S2 tabell) de sterkeste negative bidragene kommer fra gener involvert i bukspyttkjertelen utvikling (f.eks ONECUT1, PDX1, SOX9, FOXA2, …). De sterkeste positive bidrag, men ikke kommer fra et sett av gener med som sammenhengende en funksjonell annotering som negativer bortsett fra når det gjelder insulin menneskehandel og sekresjon; BACE2 og PIM-3, som også er kjent for å fremme human kreft i bukspyttkjertelen vekst [15].
For den andre hovedakse (se tabell S3) den sterkeste negativt bidrag kommer fra utviklings gener for av et stort antall vevstyper og organsystemer. De sterkeste positive bidragene kommer fra trans reseptor protein kinaser. Det mest bemerkelsesverdige bidrag kommer fra MST1R som har vært innblandet i KRAS onkogen aktivering i PDAC [16].
Gitt separasjon mellom tumorprøver basert på metylering av gener som er viktige for utvikling, flyttet vi å undersøke om det kan være en sammenheng mellom metylering av disse genene og sykdomsspesifikk overlevelse av pasientene.
Definisjon av
Survival + Hotell og
Survival-
vilkår for metylering nettsider
Vi observerte at metylering nettsteder med positive eller negative Cox regresjon score dannet to grupper med forskjellige egenskaper, som beskrevet nedenfor. For å forenkle konseptualisering og referanse av disse to gruppene, vi definert dem som «
survival-»
eller «
overlevelse +
«, begge signifikant korrelert med økt metylering. For
survival-
, økt metylering var assosiert med kortere overlevelse ganger. Omvendt, for
overlevelse +
økt metylering var assosiert med lengre overlevelse ganger. Basert på våre filtreringskriterier og bruke ap ≤ 0,05 terskel for betydning, fikk vi et sett av 17,251
overlevelses +
områder og 3256
survival-
nettsider.
Individuell CpG nettstedet metylering korrelerer med pasientens overlevelse
Vi testet om andre kliniske variabler kjent for å påvirke DNA metylering kan forklare sammenhengene vi observerer. Vi gjorde samme Cox regresjon med å sensurere for hvert nettsted metylering mot både pasientens alder og tumor innhold (cellularity). Vi tok Cox score basert på overlevelse og de som er basert på hver av de andre variablene og beregnet Pearson korrelasjon av de to koeffisienter mellom alle områder i hver av de
overlevelse + Hotell og
survival-
områder. For tumor kvalitet, korrelasjonen var 0,06 og for alder, var 0,08. Bruk av bare de områder av interesse for denne studien (de med p-verdi 0,05 i overlevelse og metylering sammenligning) ga korrelasjoner av 0,16 for alder og -0,12 for svulst kvalitet. Videre tallene nettsider hvor sammenhengen var statistisk signifikant for både metylering og alder eller metylering og tumor innhold var ganske liten (n ~ 10). Vi konkluderer derfor med at sammenhenger mellom metylering nivåer og overlevelsestider ikke er vesentlig påvirket av pasientens alder eller svulst innhold.
Funksjonell analyse avslører nøkler gener i bukspyttkjertelen celle skjebne engasjement
Bruke
overlevelse + Hotell og
survival-
metylering nettsider individuelt og hele ~ 250K metylering områder som bakgrunn har vi brukt flott verktøy for å søke etter signifikante sammenhenger med ulike funksjonelle kategorier og veier [17]. En undergruppe av de betydelige foreninger funnet av disse søkene er oppført i tabell 2 for
survival-
områder og tabell 3 for
overlevelses +
nettsteder.
for
survival-
satt av metylering nettsteder, observerte vi en rekke viktige assosiasjoner til utviklingsprosesser og stier som er spesifikke for bukspyttkjertelen, inkludert viktige gener involvert i transkripsjonsregulering bestemmer cellulær differensiering i bukspyttkjertelen. Linker ble også bemerket mellom gener og prosesser av neurale celledifferensiering, et funn som tidligere angitt i et både en exome sekvense forsøk [5] og et DNA-metylering studie av PDAC [13].
Figur 2 er en skjematisk fremstilling av celle linjene i bukspyttkjertelen tilpasset fra zaret,
et al
. [18]. Gener uthevet i rødt ble beriket i
survival-
sett, inkludert HHEX, ONECUT1, ISL1, NKX2-2, og Pax6. HHEX, en homeobox genet, er kritisk for utvikling bukspyttkjertelen og ONECUT1 er nødvendig for riktig ekspresjon av PDX1 og NEUROG3 i både rygg og pankreatisk endoderm [19, 20]. NKX2-2 er nødvendig for pancreatic beta-celle utvikling [21], er ISL1 kreves for islet celle utvikling [22], og, Pax6 er nødvendig for differensiering av alfaceller [22].
Gener som er godt vitskape som spiller nøkkelroller i cellen skjebne er oppført etter navn. Navn uthevet i rødt er gener beriket for
survival-
metylering nettsider.
Det har tidligere blitt rapportert at hypermethylation av ISL1 korrelerer med redusert genekspresjon og aggressiv progresjon av blærekreft [23]. Den metylering av NKX2-2 ble identifisert som en del av en signatur for glioblastoma multiforme [24]. Til slutt ble hypermethylation av Pax6 observert å korrelere med dårlig klinisk utfall i magekreft [25, 26], utvikling av ikke-småcellet lungekreft [27] og transcriptional deaktivering i invasive ductal brystkreft [28, 29].
survival- Hotell og
overlevelse +
har forskjellige posisjon tilbøyeligheter
fig 3A plotter log-odds ratio for
survival- Hotell og
overlevelse +
sider på ulike avstander fra transkripsjon start steder av sine nærmeste gener.
survival-
nettsteder, som har de klareste merknads resultatene, ble betydelig anriket i promotorområdene av gener. I kontrast til
overlevelses +
metylering nettsteder, som, som en gruppe, har mindre sammenhengende forbindelse med spesielle funksjonelle merknader ble distribuert bredere forstand og distal til genene «transcriptional starte nettsteder. Tilsvarende de to kategoriene av metylering nettsteder har ulike statistiske egenskaper. Fig 3B er et histogram av gjennomsnittlig metylering verdier for metylering områder av begge kategorier. Survival- og overlevelse + områder synes å ha nesten separate og distinkte fordelinger av metylering verdier. Mens survival- nettstedene har en tendens til å ha lav metylering som øker med kortere overlevelse ganger, er overlevelsen + kategorien overveldende består av CpG nettsteder som er hyper-denaturert. Vi merker oss at disse to distribusjonene reflektere bakgrunnen fordelingen av alle steder (se S1 figur). Overflod av overlevelse + områder i forhold til survival- områder gjenspeiler større bakgrunnen fordeling av hypermethylated CPGs. Som hypomethylated regioner av genomet er vanligvis forbundet med transkripsjonsstartsider, er det sannsynlig at de survival- nettsteder er mer direkte relatert til transcriptional endringer enn overlevelse + områder, som ofte er i distale intergeniske regioner, og har et mindre klart forhold til transcriptional regulering.
(A) Enrichment (log
-odds ratio) på
overlevelse + Hotell og
survival-
steder i ulike avstandskasser i forhold til transkripsjonsstartsider ( TSS) av sine nærmeste gener. (B) Histogram av gjennomsnittlig metylering score for CpG områder kategorisert som
survival- Hotell og
overlevelse +
.
Mot utvikling av biomarkører
Konkrete eksempler av sammenhengen mellom metylering og pasient overlevelse er presentert i figur 4. figur 4A viser tre gener (FAM150A, ONECUT1, og RASSF10) som var lokalt beriket for
survival-
nettsteder. Panelet viser kromosom beliggenhet, struktur, og en forstørret visning av DNA metylering spor for de 11 PDAC pasienter med deres overlevelse gang på flere måneder notert på venstre side av sporet, samt spor for to pankreatitt og 3 normale prøver. Den laveste delen av panelet Fig 4A viser spor for transkripsjon faktor bindende områder hentet fra KODE prosjektet [30]. Figur 4B viser Kaplan-Meier-kurver for tre spesifikke seter-hver tatt fra genet umiddelbart over den. En gratis sett av eksempler å bruke
overlevelses +
områder er gitt i S2 Fig.
(A) Tre gener der økt metylering i promoter regionen sterkt korrelerer med redusert pasientens overlevelse. Også vist er låter som tilsvarer transkripsjon faktor bindende bevis. (B) Kaplan-Meier kurver for en side fra hvert gen skjer innenfor en transkripsjonsfaktor bindingssete.
Sammenligning med kjente PDAC-assosierte gener
Ansette en gen-sentrisk tilnærming, vi telte antall signifikante metylering områder (
overlevelse +
eller
survival-
) som forekommer i et gitt gen pluss en 5 kilobase forlengelse oppstrøms for transkripsjon start stedet. Vi deretter sortert disse to listene og undersøkte de 10 oppføringer i hver. Den komplette lister over gener og antall signifikante metylering nettsteder for hver er gitt i S4 tabell.
I tillegg har vi sett på overlapp mellom våre gen sett og sett av gener med mutasjoner avdekket i to omfattende sekvense studier av bukspyttkjertelen kreft [4, 5]. For våre gen lister, tok vi bare de som hadde 10 eller flere betydelige metylering nettsider (for å redusere falske funnrate på noe enkelt område). Dette ga oss 32 gener for
survival-
satt og 54 gener for
overlevelse +
sett. Bare én (COL5A1) dukket opp i både en liste over muterte gener [4] og
overlevelse +
liste, mens ingen overlapping ble notert med
survival-
satt. Denne mangelen på overlapping mellom gener beriket for survival- og overlevelses + metylering nettsteder og gener assosiert med kreft i bukspyttkjertelen mutanter forklares av to faktorer. Den første er at vi brukt strenge kriterier for gener som skal vurderes for å redusere falske funn, og derfor har vi ikke nødvendigvis fanget alle epigenetiske forandringer. Den andre, og kanskje mer viktig observasjon er at PDAC-forbundet muterte gener ikke er beriket for bukspyttkjertelutviklings gener, men snarere for signalveier. Dermed mutasjoner til disse signalveier sannsynlig gi overlevelse fordeler for svulster, mens utviklings endringer der det gis overlevelse fordelene er mer effektivt modulert om epigenetisk heller enn genetiske endringer.
Diskusjoner
Genomisk endringer og genekspresjon forandringer assosiert med kreft i bukspyttkjertelen har blitt studert intensivt, og en rekke kritiske gener har blitt identifisert [4, 31, 32]. Kvantitativ integrering av flere data-kilder for genomisk endringer, genekspresjon og epigenetisk regulering med pasienten overlevelse har hjulpet i å karakterisere forholdet mellom PI3K /AKT og SRC trasé [10] og PDAC progresjon. I motsetning til tidligere studier, har vi innført
survival-
basert tilnærming med fokus på potensialet epigenetisk regulering via DNA metylering.
Vi fant at metylering av CpG nettsider sammenheng med pasientens overlevelse i ~ 20.000 tilfeller av ~ 250.000 målt. Disse nettstedene falt inn i to kategorier vi kalt
survival- Hotell og
overlevelse +
representerer forholdet mellom økt metylering å overleve. Vi fant også at disse to typer nettsteder hadde forskjellige posisjon tilbøyeligheter i forhold til transkripsjonsstart områder av gener. Mens
survival-
nettsider gruppert nær TSS-tilsvarer hypermethylation av promoter regioner,
overlevelses +
steder ble mer bredt distribuert intragenically. Som et resultat av dette partisjonering, og generelt mer fullstendig forstått og preget promoter regioner av gener,
survival-
sider ga klarere utvinning av funksjonell annotering og gener i samlet.
Mens store flertallet av DNA metylering studier har fokusert på metylering status for arrangører og CpG øyer, er det økende bevis for at intronic metylering og /eller metylering områder som ikke er en del av CpG øyer også spille en rolle i moduler genekspresjon [33, 34] . Det er antatt at disse metylering av disse intra-lende områder påvirker rollen som forsterkere av transkripsjon [35-37]. Vår studie gir tilslutning til dette som mesteparten av betydelige metylering endringene vi observerte var i
overlevelse +
kategori (ikke proksimalt for TSS).
Genet FAM150A hadde flest
survival-
nettsteder. Selv om ikke godt karakterisert i litteraturen, i en fersk studie av nyrecellekarsinomer, ble det funnet å være hypermethylated i klyngen av pasienter med aggressiv kreft og dårlig overlevelse [38, 39]. Rollen ONECUT1 (HNF6) i bukspyttkjertelen utvikling er godt etablert. Spesielt er det tenkt å fungere som en fenotypisk bryter i acinar-til-ductal metaplasi som kan føre til bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi og påfølgende PDAC [40]. Studier på mus tyder ONECUT1 har tumor suppressor aktivitet [41]. En annen velkjent tumor suppressor i vår topp 10 liste er RASSF10. Nyere studier har identifisert den som epigenetiske dempet via promoter hypermethylation i en rekke kreftformer [42-52]. RNF207 ble også nylig identifisert som en tumor suppressor i neuroblastomer [53]. PCDH9 er ofte tapt i levercellekarsinom, dens nedregulering er assosiert med tumor cellemigrasjon, og PCDH9-negative tumorer korrelerer med betydelig kortere overlevelse ganger for glioma pasienter [54, 55]. Likeledes er tapet av ett allel av BRF1 i forbindelse med en rekke forskjellige tumorer [56]. Som en underenhet av TFIIB, dereguleringen av dette genet bidrar trolig til dereguleringen av RNA pol III transkripsjon allment observert i kreftceller [57].
Av de 10
survival-
gener, bare tre (MAP6, RIN3, og HIST1H2BI) manglet entydig bevis for en onkogen eller tumor suppressor rolle i litteraturen. RIN3 er en negativ regulator av mastcelle respons på stamcellefaktor [58], og kan spille en rolle i undertrykkende tumor invasivitet. HIST1H2BI ser ikke ut til å ha en kjent rolle i kreft bortsett fra en generell kromatin strukturell rolle.
De resterende genet i vår topp 10 liste koder en miRNA (MIR96) kjent for å undertrykke KRAS og fungere som en tumor suppressor i bukspyttkjertelkreft [59]. Som et resultat, har vi også undersøkt andre mirnas vises i vår
survival-
genet listen. Selv ikke i topp 10, fant vi to mer miRNA gener med mer enn 5 betydelige metylering nettsteder. MIR130B er nedregulert i kreft i bukspyttkjertelen vev og dens uttrykk er en nyttig prognostisk for kreft i bukspyttkjertelen pasienter [60]. MIR196A1 har også blitt identifisert som å ha avvikende uttrykk forbundet med unormal apoptose, invasjon og spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler [61].
Undersøke de 10 genene med de mest tallrike
overlevelses +
nettsider ga følgende funnene. PTPRN2 er et velkjent medlem av de store autoantigener i insulinavhengig diabetes mellitus. Det har også blitt identifisert som en hypermethylated biomarkør i plateepitelkreft lungekreft [62]. CDH4 er abnormt denaturert i sin promoter-regionen i mage og tykktarmskreft, og kan fungere som en epigenetisk forstummet tumor suppressor i nasofaryngeal karsinom [63, 64]. MAD1L1 er et godt studert cellesyklus sjekkpunkt gen med mutasjoner innblandet i flere typer kreft [65]. CBFA2T3 er funnet i pediatrisk akutt myelogen leukemi og er involvert i translokasjon og fusjonsproteinprodukter (CBFA2T3-GLIS2) [66]. Avvikende metylering av CBFA2T3 promoteren er blitt funnet i brystkreft vev sammenlignet med normal [67]. CBFA2T3 er også funnet i IGH translokasjon i pediatrisk B-cellelymfom [68]. Kollagen-ombygging genet COL5A1, ble brukt i en 10-genekspresjon signatur assosiert med dårlig pasient overlevelse i høyverdig serøs eggstokkreft og dens uttrykk synes å fremme metastase [69]. CAMTA1 er en tumor suppressor kandidat funnet å hemme vekst i neuroblastomer og ser ut til å spille en rolle i utviklingen av glioma stamceller [53, 70-72]. Den H3K9me1 metyltransferase PRDM16 beskytter genomisk integritet [73]. Trans av dette genet er funnet i akutt myeloid leukemi og myelodysplastisk syndrom og korrelert med dårlig pasient overlevelse [74]. SHANK2 har blitt foreslått som en roman onkogen som sin over-uttrykk i esophageal plateepitelkarsinom er assosiert med celleproliferasjon og beskyttelse mot celledød [75].
For to av de 10 genene var det lite litteratur merknad . Høye nivåer av RBFOX4 protein har blitt funnet i supratentorielle ependymomas. [76], mens det er egentlig ingen kobling i litteraturen til en kreftforeningen for TRAPPC9.
Som vi fant interessante mirnas i vår sett
survival-
gener, så vi for dem i
overlevelse +
sett, så vel. Til tross for større antall
overlevelses +
områder i forhold til overlevelse stedet, var det ingen miRNA gener assosiert med mer enn 5 i denne klassen av nettsteder.
Etter en nærmere inspeksjon av individuelle gener assosiert med flere forekomster av
overlevelse + Hotell og
survival-
områder, fant vi ut at nesten alle hadde blitt identifisert via andre studier med andre typer data som å spille en rolle i kreft, selv om de ikke har blitt undersøkt spesielt i forhold til PDAC. Våre funn er i samsvar med tidligere studier som rapporterer sammenhenger mellom arrangøren hypermethylation eller transkripsjon inaktive for flere viktige utviklings regulatoriske gener eller gener med svulst undertrykkende kapasitet i andre kreftformer. Trasé som er beriket for
survival-
relatert epigenetiske endringene tilsvarer noen av trasé tidligere identifiserte i vid forstand. Utseendet av 3 miRNA gener i vår
survival-
sett, som alle har blitt identifisert som sentrale transkripsjons regulatorer i PDAC, er partikkel notat og gir større trygghet i tilnærmingen vi har tatt.
til slutt, som en foreløpig test av potensialet prediktive nytten av DNA metylering for kreft i bukspyttkjertelen pasient overlevelse, testet vi 3
survival-
plasser som forekommer i 3 gener med flere
survival-
sider på steder der det er tegn på proteinbinding. De metylering verdier ved hvert av disse områdene kan dichotomize pasientene i korte overlevelse og lengre overlevelse med statistisk signifikans.
Resultatet av denne tilnærmingen viser tydelig at DNA metylering endringer av nøkkel celle skjebne å bestemme gener er sterkt assosiert med PDAC progresjon. Denne studien bør motivere samling av flere prøve data for å bekrefte våre resultater, samt å utvikle biomarkører basert på DNA-metylering endringer knyttet til disse viktige gener.
Metoder og materialer
Pasienter og prøver
Alt arbeid ble utført med samtykke fra University of California, Los Angeles (UCLA) Institutional Review Board med skriftlig samtykke fra alle pasienter. Prøver fra PDAC tumorer og ikke-ondartede bukspyttkjertel ble hurtigfrosset ved tidspunktet for kirurgi. Tumor innhold ble vurdert på hematoxylin og eosin deler av en praktiserende gastrointestinal patolog (DWD). All clinicopathologic og overlevelse informasjon for pasienter ble hentet fra en prospektiv opprettholdes UCLA kirurgisk database med bukspyttkjertelen pasienter. Total overlevelse ble bestemt ved å søke Social Security Death Index og overlevelses intervaller ble beregnet fra datoen for kirurgi for å dato bekreftet død eller siste pasientkontakt.
For denne studien ble totalt 16 prøver brukes, inkludert 11 PDAC svulster, 2 normale prøver og 3 kronisk pankreatitt prøver. Kliniske detaljer for disse prøvene er gitt i tabell S1.
Redusert fremstilling bisulfitt-sekvense
Genomisk DNA fra alle prøvene ble ekstrahert for å skape biblioteker for redusert representasjon bisulfitt-sekvensering (RRBS) etter en standard protokoll [ ,,,0],77]. Spaltninger ble utført med metylering-insensitive restriksjonsenzym, MspI, og fragmenter i området fra 50 til 300 baser ble valgt for å anrike for CpG-rike regioner. Etter fordøyelse, ble prøver ligert med Illumina adaptere, størrelse valgt, denaturert og behandlet med natriumbisulfitt å avsløre sin metylering tilstand. Bibliotekene ble sekvensert ved hjelp av Illumina Hiseq 2000 sequencere.
Sekvense leser ble kartlagt til den menneskelige referansen genom (hg19) bruker BS Seeker2 sett dataverktøy [78]. Som bisulfite behandling konverterer unmethylated cytosines til thymines, beregnet vi metylering nivået på hvert genomikk CpG området som brøkdel av leser entydig kartlagt til at nettstedet inneholder en cytosin.
Datafiltrering
Vi filtrert sett av metylering steder for etterfølgende analyse ved hjelp av to statistiske kriterier som er beregnet for å velge biologisk relevante områder og forbedre kvaliteten på nedstrøms beregninger. Først da metylering tilstand på et gitt område er en binomisk frekvens anslag, beregnet vi konfidensintervall bruker Clopper-Pearson-metoden [79]. Vi inkluderte bare områder hvor metylering frekvenser for hver av de 16 prøvene hadde 95% konfidensintervall mindre enn 0,25. For det andre, beregnet vi standardavviket over 16 prøver og hentet nettsteder med et standardavvik = 0,05 for videre analyse.
Statistical Analysis
Principal Component Analysis [80] ble utført på metylering vektorer som består av alle områder som passerte filtrene som er beskrevet ovenfor. Cox regresjon [81] med sensur ble brukt til å beregne en regresjonskoeffisient og tilhørende p-verdi på hvert nettsted individuelt for å bestemme tegn og styrke forholdet til overlevelsesdata. Likeledes, for noen steder av interesse som presenteres i Resultater og Diskusjon, beregnet vi Kaplan-Meier [82] kurver og log-rank p-verdier ved dichotomizing prøvene basert på gjennomsnittlig metylering verdi på hvert sted.
Funksjon og Pathway Analysis
for å undersøke de funksjonelle konsekvensene av metylering områder med sterk korrelasjon til overlevelse, benyttet vi den genomiske regioner berikelse av merknader Tool (stor) [17]. Dette verktøyet samler flere databaser av biomolecular merknader og beregner statistiske sammenhenger mellom disse merknader og en gitt innspill satt av genomiske regioner. For våre innspill, brukte vi undergruppe av metylering nettsteder med p-verdier mindre enn 0,05. For bakgrunnen, brukte vi alle nettsteder som passerte de to kvalitet filtre. For det store inngangsparametrene vi valgte enkelt nærmeste genet alternativ og en maksimal forlengelse på 100 kilobaser fra transkripsjon start stedet av hvert gen.
Gitt det store antallet CpG nettsider undersøkt i denne studien, vi forsøkte å søke standard fler-testing korreksjoner [83] på disse p-verdier. Som et resultat av den underrepresentasjon av lave p-verdier i våre data sammenlignet med ensartet tilfeldig forventning, de falske funnrate vi oppnådde var sannsynlig oppblåst. Men som vist i Resultater og Diskusjon, ved hjelp av ukorrigerte p-verdier for å velge loci i en samlet måte (per gen eller genomisk region) forutsatt overbevise utvinning av funksjonell annotering og gener som tidligere fremhevet i litteraturen, tyder vår tilnærming er robust. Til slutt sammenlignet vi sett av gener sterkest beriket med betydelige metylering nettsteder til listene over gener funnet å være signifikant mutert i omfattende exome sekvense prosjektet [4, 5].
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Bakgrunn Fordeling av Per Side Gjennomsnittlig metylering Verdier
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128814.s001 plakater (TIFF)
S2 Fig. Genome leseren visualisering av Eksempel Gener med Survival + nettsteder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0128814.s002 plakater (TIFF)
S1 Table. Clinicopathological karakteristikker av pasientprøver
Kliniske variabler som samles for bukspyttkjertel adenokarsinom pasientene i denne studien
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0128814.s003 plakater (XLSX)
S2 Table. Funksjonell utgangspunkt i prinsipp Component 1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0128814.s004 plakater (XLSX)
S3 Table.
