Abstract
Ulike kreftceller utvise endret følsomhet for metformin behandling. Nylige studier tyder disse resultatene kan skyldes delvis den felles cellekultur praksis med å benytte høy glukose, og når glukose blir senket, blir metformin stadig mer cytotoksisk for kreftceller. I lave glukose forhold som strekker seg fra 0 til 5 mm, metformin var cytotoksiske til brystkreft cellelinjer MCF7 MDAMB231 og SKBR3, og eggstokkreft cellelinjer OVCAR3, og PA-en. MDAMB231 og SKBR3 ble tidligere vist å være resistente mot metformin i normal høy glukosemedium. Når glukose ble øket til 10 mM eller over, alle disse cellelinjene blir mindre mottakelig for metformin behandling. Metformin behandling signifikant redusert ATP-nivåer i celler inkubert i media med lav glukose (2,5 mM), med høyt fruktoseinnhold (25 mM) eller galaktose (25 mM). Reduksjoner i ATP-nivåer ble ikke observert med høy glukose (25 mm). Dette ble kompensert ved økt glykolyse gjennom aktivering av AMPK når oksidativ fosforylering ble hemmet av metformin. Men økt glykolyse var enten redusert eller avskaffet ved å erstatte 25 mM glukose med 2,5 mM glukose, 25 mM fruktose eller 25 mM galaktose. Disse funnene tyder på at å senke blodsukker forsterker metformin indusert celledød ved å redusere metformin stimulert glykolyse. I tillegg under lave blodsukker forhold metformin signifikant redusert fosforylering av AKT og ulike mål for mTOR, mens fosfor-AMPK ikke ble vesentlig endret. Dermed hemming av mTOR signal ser ut til å være uavhengig av AMPK aktivering. Videre in vivo studier ved hjelp av 4T1 brystkreft musemodell bekreftet at metformin hemming av tumorvekst ble forsterket da serum blodsukkeret ble redusert via lavt karbohydrat ketogen diett. Dataene støtter en modell hvor metformin behandling av kreftceller i lav glukose medium fører til celledød ved å redusere ATP-produksjon og hemning av overlevelsessignalveier. Den forbedrede cytotoksisitet av metformin mot kreftceller ble observert både in vitro og in vivo
Citation. Zhuang Y, Chan DK, Haugrud AB, Miskimins WK (2014) mekanismer som lav Glukose Forbedrer Cytotoksisitet av Metformin til kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP Begge
In vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE ni (9): e108444. doi: 10,1371 /journal.pone.0108444
Redaktør: Viji Shridhar, Mayo Clinic College of Medicine, USA
mottatt: 13 juli 2014; Godkjent: 29 august 2014; Publisert: 25.09.2014
Copyright: © 2014 Zhuang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet gjennom stipend KG100497 (W.K. Miskimins) fra Susan G. Komen for Cure. Seahorse XF24 eksperimenter ble støttet av Cobre award 5P20GM10358 (W.K Miskimins) fra National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health. Prosjektet ble også støttet delvis av en Cobre pilot award (Y. Zhuang) og PHS tilskuddet 1R01CA180033-01 (W.K. Miskimins) fra National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i transformasjonen til kreft celler gjennomgår omprogrammering av deres vanlige metabolske funksjoner for å lette rask vekstpotensial. Otto Warburg rapportert høy forekomst av glykolyse i kreftceller selv i aerobe forhold. Dette paradoksale endringen er en mekanisme ved hvilken kreftceller er innrettet for hurtig proliferasjon. Som et resultat av dette endret metabolisme, kreftceller bruker store mengder glukose og generere store mengder laktat. Glukosemetabolismen gjennom glykolyse bidrar til ATP syntese og gir mellomprodukter for andre biosyntetiske prosesser. Dermed kreftceller er avhengig av høy forekomst av glukoseopptak og metabolisme for å overleve [1], [2].
Aktuelle metoder for
in vitro
kreftcellekultur vanligvis bruker høy glukose, 25 mM (450 mg /dl) i vekstmediet. Mens høy glukosemedium skaper et optimalt miljø for kreftcelleformering, kan disse glukosenivåer komplisere tolkningen av medikamentet beskyttelsesstudier. Høy glukose alene har evnen til å aktivere spredningsveier i en kreftcelle [2], og den konstante tilgjengeligheten av glukose plasserer lite av den normale spenning kreftceller erfaring
in vivo
. I kreft i bukspyttkjertelen celler, Sinnett-Smith
et al
. [3] fant at metformin handlinger på AMPK-aktivering ble forsterket ved bruk av 5 mM glukose media i dyrkede celler.
Normalt serum glukose blir vanligvis opprettholdt mellom 4 og 6 mM (ca. 72-108 mg /dl). I tilfelle av lav næringsstoffer, kan serumglukosenivået faller til 2,5 mM (45 mg /dl), med vev nivåer av glukose vanligvis lavere. Reduksjon av glukose tilgjengelighet er også blitt forsøkt som en kreftbehandling ved en rekke metoder. Modifisere dietten ved direkte kaloribegrensning eller faste har blitt undersøkt som en fremgangsmåte for å redusere cancer vekst med noen lovende resultater [4] – [6]. Generelt synes faste å være mer effektive enn konstant kaloribegrensning for å redusere veksten av kreft [5]. Foruten diett modifisering, anti-diabetiker narkotika er en annen måte å senke plasma glukose. I en klinisk studie som sammenligner metformin sin effekt til eksisterende type II diabetes medisiner, ble metformin funnet lavere plasmaglukosekonsentrasjoner med ca 3 mm (55 mg /dL) fra nivåene før behandling [7]. Det er imidlertid verdt å merke seg at metformin ikke hadde signifikant effekt på reduksjon av plasmaglukose hos ikke-diabetikere [8].
Nylig metformin har fått fornyet interesse som en potensiell kreft terapeutisk og kjemoterapi adjuvant. Metformin potensielle anti-kreft-aktivitet ble innblandet ved den lavere forekomst av kreft hos type II diabetikere versus andre glukose kontrollerende midler [9]. Denne effekten ble først tilskrevet metformin er systemiske glukose og insulin reguleringsegenskaper. Senere metformin ble også funnet å hemme kreftvekst på cellenivå. Den anti-onkogen virkning for metformin er sannsynligvis en kombinasjon av systemiske insulin kontroll effekter og direkte cellulære effekter. Mange grupper har vist metformin handling
in vitro
i en rekke forskjellige krefttyper [10] – [14]. Men for å etterligne effekten av metformin
in vitro
som er observert
in vivo
, høye konsentrasjoner, vanligvis 5-20 mM, av metformin er nødvendig. Nylige studier tyder disse resultatene kan skyldes delvis den felles cellekultur praksis med å benytte høy glukose, og når glukose blir senket, blir metformin stadig mer cytotoksisk for kreftceller [15], [16]. I tillegg ble det karbonkilden for kreftceller funnet å vesentlig endre anti-kreft-effekter av metformin når man sammenligner glukose til glutamin [17]. I denne studien kreftceller utsettes for høye glutamin i fravær av glukose var mye mer følsomme for hemming av metformin.
Selv om den nøyaktige mekanisme for metformin kreft cytotoksisitet fortsatt uidentifiserte, metformin s systemiske handlinger sannsynlig kombineres med den direkte cellulær virkning for å forbedre dens virkning på kreftcellevekst inhibering og kreftcelledød. Her viser vi at lav til normale glukosenivåer, i motsetning til høye glukose betingelser, potenserer virkningen av metformin i bryst- og eggstokk-kreft-cellelinjer. De mulige mekanismer for denne aktiviteten er utforsket. Disse observasjonene kan avsløre både mer relevante celle kultur teknikker for å studere metformin i kreft samt gi innsikt i klinisk bruk av metformin som en adjuvant behandling av kreft.
Metoder
Kjemi og reagenser
følgende kjemikalier ble anvendt i denne studien: metformin (1, 1-dimethylbiguanide,), D – (-) – fruktose, D – (+) – galaktose, 2-deoksy-D-glukose, oligomycin (Sigma Chemical Co). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med høy glukose (Hyclone), Gibco DMEM uten glukose (Liv Technology), SYTOX Grønn Nucleic Acid Stain (Invitrogen), og ATP Assay Kit (Invitrogen).
Cellekultur
humane kreftcellelinjer MCF7, MDAMB231, OVCAR3, PA-1, SKRB3, og human mammary epitel-celler MCF10A ble alle innkjøpt fra ATCC og holdt i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum med varierende glukose og 1% penicillin- streptomycin ved 37 ° C under en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO
2. Alle cellelinjene ble brukt innen passasje ti etter å ha mottatt fra ATCC å sikre cellelinje godkjenning.
Celledød analysen bruker Sytox Grønn Nucleic Acid Stain
Celler ble sådd ut i 96 brønners plater og behandlet med den indikerte behandling for en eller to dager. Sytox grønn flekk nukleinsyre (10 uM) ble tilsatt direkte til celler i 96-brønners plater og inkubert i 10 minutter. Platen ble avlest ved eksitasjon /emisjon på 485 nm og 530 nm, henholdsvis, med en 515 nm cut-off ved bruk av en fluorescens plateleser (SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, LLC). Fluorescens ble målt for å oppnå antallet døde celler. Deretter, for å bestemme totale celleantall ble 0,4% Triton-X100 tilsatt til hver prøve, og det ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur for å permeabilisere alle cellene, og fluorescens ved 485/530 nm ble målt på nytt for å oppnå det totale celleantall .
ATP-testen
Celler ble sådd ut i 6 brønners plater, etterfulgt av inkubering i 24 timer. Behandling ble gitt sammen med friskt medium i 24 timer. Like mange celler ble lysert i hver behandlingsgruppe og 10 ul ble brukt fra hver prøve å følge produsentens protokoll for ATP-analyser (Invitrogen, ATP Fastsettelse Kit, A22066). I korte trekk ble 100 ul av standard reaksjonsløsningen måles i et luminometer for bakgrunn luminescens. Deretter 10 ul av lysatet supernatanten ble tilsatt til reaksjonsløsningen, og luminescens ble målt igjen. Bakgrunn luminescens ble trukket fra prøven luminescens og resultatene ble plottet som fold endring fra kontrollprøvene.
Western blotting
Celler i 35 mm skåler ble skylt en gang med PBS og lysert ved tilsetning av natriumdodecylsulfat ( SDS) prøvebuffer [2,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2,5% SDS, 100 mM ditiotreitol, 10% glycerol, 0,025% Pyronin Y]. Like mengder av protein fra hver behandlingsgruppe ble separert på 10% eller 15% SDS-polyakrylamidgeler. Proteiner ble overført til Immobilon P membran (Millipore) ved hjelp av en halvtørr Bio-Rad Trans-blot-apparat med en overføringsbuffer på 48 mM Tris-HCl og 39 mM glysin. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fet tørrmelk eller 5% BSA i Tris-bufret saltvann [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] inneholdende 0,1% Tween-20 (TBS-T) i en time ved romtemperatur. Membranen ble deretter inkubert med det passende antistoff i TBS-T inneholdende 5% ikke-fet tørrmelk eller 5% BSA i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Etter vasking i TBS-T ble membranen inkubert med det passende pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff. Proteiner ble påvist ved hjelp av Super Signal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Pierce Biochemical). Anti-β-aktin monoklonalt antistoff (A5441, som ble brukt ved 1:10,000) ble innkjøpt fra Sigma. Antistoffer mot fosforylert AKT på treonin 473 (# 05-669 brukes på 1:1000) ble kjøpt fra Upstate Bioteknologi. Antistoffer mot AKT fosforylert ved treonin 308 (# 4056, brukt på 1:1000), ATK (# 4691, brukt på 1:1000), fosforylert S6K (# 9206, brukt på 1:2000), S6K (# 9202, som brukes ved 1:2000), PARP (# 9542, brukt på 1:2000), kløyvde PARP (# 9541, brukt på 1:2000), AMPK fosforylert ved treonin 172 (# 2535, brukt på 1:1000), og AMPK (# 2532, brukt på 1:1000), ble spaltet Caspase 7 (# 9491, brukt på 1:1000) kjøpt fra Cell Signal Technology. Sekundær pepperrotperoksidase bundet anti-mus (# 31430, som brukes ved 1:5000) og anti-kanin (# 31460, som brukes ved 1:5000) IgG antistoffer ble kjøpt fra Pierce Biokjemisk.
Laktat-analyse
MCF7 ble sådd ut i 96-brønners plater, og behandlet som indikert i 15 timer. Medium fra hver behandling ble samlet og testet for laktatkonsentrasjon ved hjelp av en L-laktat Assay Kit (Eton Biosciences Inc.). Cellene ble telt ved bruk av Sytox grønne fargemetoden som beskrevet tidligere. Relative laktatnivåer ble oppnådd etter normalisering av totalt celle nummer.
Måling av Extra Cellular Forsuring Rate (ECAR) og oksygenforbruk Rate (OCR)
ECAR og OCR ble målt ved hjelp av en Seahorse XF24 analysator i henhold til produsentens instruksjoner (Seahorse Bioscience). Kort sagt ble MCF7 celler platet med 40.000 celler /brønn i XF24-brønners plater. Celler ble behandlet som angitt neste dag. Før de ble behandlet med Seahorse XF24 analysator, ble cellene vasket og ekvilibrert med buffer fritt medium (D5030, Sigma) ved 37 ° C i en CO
2-fri-inkubator i en time. Innledende målinger av ECAR og OCR ble oppnådd, fulgt av tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av glukose (2,5 mM eller 25 mM), fruktose (25 mM) eller galaktose (25 mM). ECAR og OCR ble videre målt etter injeksjon av oligomycin og 2-deoxyglucose. Celle nummer ble oppnådd ved trypsinizing celler og telling ved hjelp av en hemocytometer. ECAR og OCR ble plottet etter normalisering av totalt celle nummer
In vivo
musestudier
Alle forsøkene ble utført i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer og regler.; protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Sanford Research. I korthet, ved hjelp av en 25-gauge nål, Balb /C-mus ble subkutant injisert med 1 x 10
5-celler i den flanke (10 mus per behandlings tilstand). Fire dager etter tumorcelleinjeksjon ble musene byttet til en kalorifattig lav karbohydrat ketogen diett (BioServ P3666) for KD gruppen (se nedenfor for detaljer om dietter). Kontrollgruppene forble på normal mus chow (Teklad Global 18% Protein Rodent Diet) og ble matet som libitum. Metformin (2 mg /mus) ble administrert intraperitonealt daglig fra 7 dager etter tumor injeksjon. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av A
2 × B der A er større diameter og B er mindre diameter. Dyrene ble avlivet når tumorstørrelsen var større enn 15 mm i sin største dimensjon, eller tumorvolumer nå 3000 mm
3, eller når dyret var i det vesentlige utmagret.
Serumglukose måling
Serumglukosenivåer glukose~~POS=TRUNC nivåer~~POS=HEADCOMP ble målt ved anvendelse av halevenen blod etter punktering halen med en 25 gauge nål for å frembringe en bloddråpe for hver test. Glukose ble målt med en Bayer Contour Glucometer og glukose teststrimler.
Diet informasjon
Den lave karbohydrat ketogen diett ble kjøpt fra BioServ (# F3666). Denne dietten gir kalorier fra protein, fett og karbohydrater på ca 4,6%, 93,4% og 2%, henholdsvis. Alle mus matet denne dietten ble utsatt for 30% kalori begrensning (7 kcal /dag /mus) starter 4
th dag etter tumorcelle injeksjon. Calorie begrensning ble bestemt ved å måle vekten av mat konsumert hver dag. Den passende mengde av den ketogene diett ble gitt hver dag i en petriskål inne i buret. Kalorier ble økt til 7,5 kcal /dag /mus (25% begrensning) på dag 7 etter initiering av ketogen diett for å hindre vekttap. Kalorier ble ytterligere øket til 8 kcal /dag /mus på dag 11 etter initiering av ketogene diett og holdt ved dette nivå inntil slutten av forsøket. Kontroll diett gruppene ble foret ad libitum på standard mus chow (Teklad Global 18% protein gnager diett) som gir kalorier fra protein, fett og karbohydrater på ca 24%, 18% og 58%, henholdsvis.
statistisk analyse
Feilfelt vises er standardavvik fra gjennomsnittet av minst tre paralleller. To-tailed parvise Student
t
tester ble brukt for å sammenligne to grupper.
P
verdier som er mindre enn eller lik 0,05 ble ansett å ha betydning.
Resultater
Vår tidligere forskning har vist at metformin er cytotoksiske til mange bryst- og eggstokk-kreft cellelinjer . Men noen cellelinjer så som brystcellelinjer MDAMB231 og SKBR3 oppviste motstand mot metformin cytotoksisitet [14], [18], [19]. Tidligere forsøk ble utført i DMEM inneholdende 25 mM glukose, som er vesentlig høyere enn normale fysiologiske tilstander 4-8 mm. For å bestemme innvirkningen glukosekonsentrasjonen har på cytotoksisiteten av metformin, testet vi effektene av forskjellige konsentrasjoner av glukose i kulturmediet av kreftceller eksponert for metformin behandling. Alle cellekulturer ble først holdt i høy glukosemedium (25 mM glukose) og sådd ut i 96-brønners plater for en dag, ble den neste dagen cellene behandlet med metformin (0 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM og 16 mM) i medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av glukose (0 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM og 25 mM) for en dag. Som glukose i mediet synker, metformin behandling økte signifikant prosentandelen av døde celler i MDAMB231, MCF7, og SKBR3 celler (figur 1A, 1B, 1C). Tidligere data viser at i høy glukose medium, både MDAMB231 og SKBR3 cellene er resistente mot metformin behandling (8 mm) i inntil tre dager [14], [18], [19]. I høye glukosebetingelser disse cellelinjer, MDAMB231 og SKBR3, fortsatte å være motstandsdyktige mot metformin behandlinger opp til 16 mm konsentrasjoner av medikamentet. Imidlertid, når glukosenivåene ble redusert til 2,5 mm eller mindre både MDAMB231 og SKBR3 viser en cytotoksisk respons på metformin behandling fra 4 mM til 16 mM.
Alle celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av metformin (0, 2 , 4, 8, 16 mM) i medium inneholdende forskjellige nivåer av glukose (0, 2,5, 5, 10, 15, 25 mM) i en dag. Andel av døde celler ble bestemt ved bruk Sytox Grønn farging. Metformin betydelig økt prosentandel av døde celler med avtagende glukosekonsentrasjon i (A) MDAMB231 celler, (B) MCF7-celler, og (C) SKBR3 celler, men ikke i (D) MCF10A celler. Resultatene ble angitt som middelverdi ± standardavvik.
Samtidig ble virkningen av metformin ved forskjellige konsentrasjoner av glukose undersøkt i den ikke-kreft human bryst epitelcellelinje MCF10A (figur 1D). I motsetning til cancercellekulturer, ble reduksjon av glukosekonsentrasjonen ikke signifikant sensitiv MCF10A metformin behandling i løpet av denne tidsperioden. Denne forskjellen kan være et resultat av underliggende forskjeller i glukosemetabolismen mellom normale mammary epitelceller og kreftceller.
For å teste om disse effektene på metformin cytotoksisitet brukt til andre kreftcelletyper, vi også undersøkt eggstokkreft celler . På en lignende måte for å senke glukose ble funnet å øke cytotoksisiteten av metformin i ovarian cancer cellelinjer OVCAR3 og PA-1 (figur 2). Dette tyder på at senke glukose fluksen i kreftceller kan i betydelig grad øke cytotoksisiteten av metformin, og at denne effekten kan være bredt relevant for forskjellige cancercelletyper.
A. Etter 48 timers behandling med metformin (5 mm, +) eller kontroll kjøretøy (H
2o, -), live OVCAR3 celle nummer ble bestemt ved å telle trypanblått negative celler og død celle nummer ble bestemt ved å telle trypanblått positive celler. B. PA-1 celledød ble bestemt som beskrevet i A. fasekontrastbilder (40x) av celler dyrket med (nederste bilde) eller uten (øvre bilde) metformin behandling. Søylediagrammer representert gjennomsnitt ± standardavvik. Alle metformin behandlede grupper i medium inneholdende lav glukose (1 mM) var signifikant forskjellig fra sine kontrollgrupper. * Indikerer signifikant forskjell mellom gruppene.
Andre kjente cellulære handlinger metformin inkluderer hemming av kompleks I i elektrontransportkjeden og oksidativ fosforylering [20]. Denne handlingen kan resultere i avdøde produksjon av ATP og andre cellulære mellomprodukter. De cellulære ATP-nivåer av MCF7, MDAMB231, og PA-1 ble undersøkt etter metformin behandling (24 timer) i enten høy glukose (25 mM) eller lav glukose (2,5 mM) vevskulturmedium (figur 3). Resultatene viser at metformin sterkt reduserer ATP-nivåer bare i lav glukose medium. I høye glukoseforhold, på dette tidspunkt, metformin hadde en tendens til å øke ATP, men ikke til et nivå av betydning.
MDAMB231 (A) og (B) MCF7-celler ble behandlet med metformin (8 mM) i enten 25 mM glukose eller 2,5 mM glukose for en dag og ATP-nivåene ble målt og brette endring av ATP sammenlignet med kontrollen ble plottet. C. ATP målinger i PA-1-celler etter 12 timer med eller uten metformin. Dette tidspunkt ble valgt på grunn av den hurtige hastighet på PA-1-vekst under betingelser som kontrollkulturen. Resultatene ble angitt som middelverdi ± standardavvik. Alle metformin behandlede grupper i medium inneholdende lav glukose (2,5 mM) var signifikant forskjellig fra sine kontrollgrupper. * Indikerer signifikant forskjell mellom gruppene.
I høye blodsukker forhold, metformin behandlede celler potensielt opprettholde ATP nivåer ved aktivering av AMPK og styrke glykolyse [21], [22]. For å teste dette, ble MCF7 celler behandlet med metformin (8 mm) i 15 timer, cellulær oksygenforbruk (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) ble målt ved hjelp av XF24 sjøhest analysator. Som forventet, metformin signifikant hemmet oksygenforbruk av MCF7-celler i medium inneholdende enten 25 mM eller 2,5 mM glukose (figur 4A). Forbedret glykolyse i metformin-behandlede celler i 25 mM glukose inneholdende medium ble bekreftet ved øket surgjøring av ekstracellulært medium (figur 4B) og laktat-sekresjon (figur 4C). Imidlertid, i lave glukose behandlede kreftceller viste redusert forøkning av ECAR og laktatproduksjon av metformin, noe som indikerer en redusert evne til å fremme en økning i glykolysen (figur 4B, 4C). Således, manglende evne til i tilstrekkelig grad å fremme glykolyse korrelerer med en manglende evne til å opprettholde intracellulær ATP under disse betingelser.
A. MCF7-celler ble behandlet med metformin (8 mM) i 15 timer i enten 25 mM eller 2,5 mM glukose inneholdende media. Oksygenforbruksrate (OCR) ble bestemt ved bruk av FX24 instrument for metabolsk fluks analyse. Metformin behandlede gruppene var signifikant forskjellige fra sine kontrollgrupper. B. MCF7-celler ble behandlet med metformin (8 mM) i 15 timer. Ekstracellulære forsuring rate (ECAR) ble bestemt ved hjelp av FX24 instrument for metabolsk flux analyse. Metformin behandlede gruppene var signifikant forskjellige fra hverandre og deres kontrollgrupper. C. MCF7-celler ble behandlet med metformin (8 mM) i 15 timer, og mellomlaktatnivåer ble målt som en indikator på glykolytisk fluks. Metformin behandlede gruppene var signifikant forskjellige fra hverandre. D. Ekstrakter av MCF7- og MDAMB231 cellene høstet en dag behandling med metformin i enten 25 eller 2,5 mM glukose ble brukt til Western blotting påvisning av fosforylert AMPK og total AMPK. P-Actin ble oppdaget som en lasting kontroll. Densitometry p-AMPK /AMPK eller p-AMPK /Actin for MCF7 celler er presentert som et søylediagram. Kløyvet capsase 7 i MCF7 celler ble oppdaget med western blotting. P-Actin ble oppdaget som en lasting kontroll. E. MCF7 celler i høy glukose ble behandlet med metformin (8 mM) og forbindelse C (10 mm) som indikert i 15 timer. DMSO er bærerkontrollen for forbindelse C. ECAR ble bestemt som beskrevet i B. Metformin behandlede gruppene var signifikant forskjellige fra hverandre. F. MCF7 celler i høy glukose ble behandlet med metformin (8 mM) og forbindelse C (10 mm) som indikert i 15 timer. Medium laktatnivåer ble bestemt som i C. Metformin behandlede gruppene var signifikant forskjellige fra hverandre. Alle søylediagram representerer gjennomsnitt ± standardavvik. * Indikerer signifikant forskjell mellom gruppene
AMPK er kjent for å regulere glykolyse ved å forbedre glukoseopptak og regulering av flere viktige enzymer i veien [21] – [25].. Våre tidligere data viste at metformin kan aktivere AMPK ved å styrke fosforylering av AMPK på Threonine 172 i medium som inneholdt 25 mM glukose [14]. Derfor, ble nivåene av AMPK aktivering med metformin behandling i både høy og lav glukose glukose undersøkt. MCF7 og MDAMB231 celler ble behandlet med metformin (8 mM) for en dag i enten 25 mM eller 2,5 mM glukoseholdig medium. Western blotting ble utført for å oppdage fosforylert AMPK og total AMPK. I begge cellelinjene metformin forbedrede nivåer av fosforylert av AMPK, den aktive formen av enzymet, i medium inneholdende 25 mM glukose, men ikke i medium inneholdende 2,5 mM glukose etter en dag behandling (figur 4D). I motsetning til dette, mens lav glukose, i seg selv, økt fosforylering av AMPK, tilsetning av metformin under disse betingelser syntes å redusere både fosfo-AMPK og totale nivåer av enzymet. Dette blir videre demonstrert ved densitometery av western blot av MCF7-celler for å kvantifisere forholdet mellom fosforylerte AMPK til total AMPK og forholdet av fosforylert AMPK til aktin (figur 4D). I medium inneholdende 2,5 mM glukose, metformin fortsatt forsterket aktivering av AMPK sammenlignet med kontroll, demonstreres ved øket forhold av fosforylert AMPK til total AMPK. Men på grunn av den sterke reduksjon av total AMPK, ble samlet fosforylert AMPK ble redusert med metformin behandling sammenlignet med kontrollen. Reduksjonen av AMPK nivåer med metformin behandling i medium inneholdende 2,5 mM glukose var assosiert med sterk apoptotisk celledød som demonstrert ved økt spaltet kaspase 7 (figur 4D nedre panel). Variansen i nivåer av aktiv AMPK mellom høye og lave glukoseinneholdende medium kan være den underliggende årsaken til forskjellen i glykolysen metabolisme stimulering av metformin behandling. For å bekrefte den rollen som AMPK i å fremme ytterligere glykolysen, ble MCF7 celler behandlet med eller uten forbindelse C (10 mm), en spesifikk inhibitor av AMPK. Etter 15 timer i medium inneholdende 25 mM glukose med eller uten metformin, ble ECAR samt laktat målinger innhentet. Omfanget av ECAR styrking og akkumulering av laktat med metformin behandling ble delvis blokkert av cotreatment med forbindelse C (figur 4E, 4F). Dette støtter en rolle for metformin-indusert AMPK aktivering i å stimulere glykolyse i høy glukoseholdig medium. I tillegg er disse funnene støtter konklusjonen om at unnlatelse av å aktivere eller opprettholde AMPK aktivering av metformin i lav glukoseholdig medium fører til utarming av ATP.
For å bedre forstå de intracellulære endringene som skjer med metformin behandling i høy og lav glukose media, protein nivåer av flere kinaser ble undersøkt. Både MCF7 og MDAMB231 celler ble behandlet med metformin (8 mM) for en dag i medium som inneholdt enten 25 mM eller 2,5 mM glukose. Western blotting ble utført for å teste fosforylering av AKT og mål av mTOR signalering. Responsen på metformin var sterkt betydelig endret i lave glukose forhold. Ved lave glukose betingelser metformin ble funnet å vesentlig redusere fosforylering av AKT og redusere fosforylering nivåene av mål av mTOR (S6K og 4EBP1), sammenlignet med høye glukose betingelser (figur 5A, 5B). Siden disse banene er kjent for å fremme celle overlevelse samt glycolytic stoffskifte, kan deres hemming av metformin bidra til redusert glykolyse, etter uttømming av ATP, og til slutt celledød.
MCF7 og MDAMB231 celler ble behandlet med metformin i DMEM inneholdende enten 25 mM glukose eller 2,5 mM glukose for en dag. Western blotting ble brukt for å beregne nivåene av p-AKT (Thr308), p-AKT (Thr473), total AKT, p-S6K, total S6K, 4EBP1 (nedre bånd representerer hypofosforylerte og høyere bånd representerer hyperfosforylert), og β-actin som lasting kontroll.
for ytterligere å undersøke hvilken rolle glukose i å beskytte celler fra metformin-indusert død, effekten av glukose ble sammenlignet med de av beslektede sukkerarter, inkludert heks fruktose og galaktose. Det har tidligere blitt rapportert at fruktose og galaktose ikke bidrar vesentlig til glykolytisk metabolisme i kreftceller [26], [27]. Videre behandling av galaktose gjennom glykolyse gir ingen netto ATP syntese. Basert på disse finne spådde vi at fruktose og galaktose ville være ute av stand til å støtte ATP syntese i nærvær av metformin. For å teste dette ble glukosefritt cellekulturmedium supplert med glukose, fruktose eller galaktose, og kulturene ble igjen analysert med hensyn til celledød (figur 6A, 6B). Bryst kreft cellelinjer MCF7 og MDAMB231 ble behandlet med eller uten metformin i 1,5 dager i DMEM inneholder glukose (0 eller 25 mm), fruktose (25 mm), galaktose (25 mm), eller fruktose pluss galaktose (12,5 mm hver). I likhet med tidligere resultater, øke glukosekonsentrasjon vesentlig redusert cytotoksisitet av metformin i både MCF7 og MDAMB231 celler. Imidlertid, fruktose og galaktose var ikke effektive i å forhindre cytotoksisiteten av metformin. ATP-nivåer ble også undersøkt i celler behandlet med metformin i medium inneholdende de forskjellige heksoser. Metformin behandling førte til signifikant redusert ATP-nivåer i lav glukose, høy fruktose, galaktose eller høye forhold, men ikke i høy glukose (25 mM) betingelser. Reduksjonen av ATP til tross for høy fruktose eller galaktose kan forklare hvorfor disse sukker er ikke i stand til å redde cellene fra metformin indusert cytotoksisitet.
MCF7 (A) og MDAMB231 (B) celler ble behandlet med metformin i DMEM uten glukose, med 25 mM glukose, med 25 mM galaktose, 25 mM fruktose, eller 12,5 mm fruktose pluss 12,5 mm galaktose i 1,5 dager. Andel av døde celler ble bestemt ved Sytox Grønn farging. Metformin behandlede grupper i 25 mM galaktose, 25 mM fruktose og 12,5 mM fructose pluss 12,5 mM galaktose var signifikant forskjellig fra metformin-behandlede grupper i 25 mM glukose. MCF7 (C) og (D) MDAMB231-celler ble behandlet i det angitte medium med eller uten metformin (8 mM) i en dag og ATP-nivåer ble målt. Metformin behandlede grupper i 2,5 mM glukose, 25 mM galaktose og 25 mM fruktose var signifikant forskjellig fra sine kontrollgrupper. Resultatene ble vist som ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. * Indikerer signifikant forskjell mellom gruppene.
For ytterligere å undersøke glukose som en bestemt karbonkilde for å opprettholde glykolyse og produksjonen av ATP i nærvær av metformin, vi neste testet effekten av stoffet på oksidativ fosforylering og glykolyse ved å måle OCR og ECAR i 25 mM glukose, 25 mM fruktose, eller 25 mm galaktose medier. Zhou et al.
