Abstract
Nye rapporter har antydet at flere faktorer som verts genetikk, miljø og kosthold kan fremme utviklingen av sunne slimhinner mot sporadisk kolorektal kreft. Samle bevis har i tillegg assosiert tarmbakterier med sykdom initiering og progresjon. For å undersøke og analysere sammensetningen av tarmfloraen i fravær av samtidig andre påvirkninger, er det etablert en dyremodell for 1, 2-dimetylhydrazin (DMH) indusert koloncancer. Ved hjelp av denne modellen, har vi utført pyrosekvensering av V3-regionen i 16S rRNA gener i denne studien å bestemme mangfoldet og bredden i tarm mikrobielle arter. Våre funn tyder på at den mikrobielle sammensetningen av tarmlumen varierer sterkt mellom kontroll- og tumor-grupper. Overflod av firmicutes ble hevet mens overflod av bacteroidetes og spirocheter ble redusert i lumen av CRC rotter. Fusobacteria ble ikke påvist i noen av de friske rotter og det var ingen signifikant forskjell i observerte Proteobacteria arter når man sammenligner bakteriesamfunn mellom våre to grupper. Interessant, overflod av Proteobacteria var høyere i CRC rotter. På slekten nivå,
Bacteroides
utstilt en relativt høyere overflod i CRC rotter sammenlignet med kontroller (14.92% vs 9,22%,
p
0,001). I mellomtiden,
Prevotella plakater (55.22% vs 26,19%),
Lactobacillus plakater (3,71% vs 2,32%) og
Treponema product: (3,04% vs 2,43%), ble funnet å være signifikant mer rik på friske rotter enn CRC rotter (
p
0,001, henholdsvis). Vi viser også en betydelig reduksjon av butyrat-produserende bakterier, for eksempel
Roseburia
og
Eubacterium
i tarmfloraen av CRC rotter. Videre, en betydelig økning i
Desulfovibrio, Erysipelotrichaceae Hotell og
Fusobacterium
ble også observert i svulsten gruppen. En reduksjon i probiotiske arter som
Ruminococcus Hotell og
Lactobacillus
ble likeledes observert i svulsten gruppen. Sammen kan vi konkludere med at en betydelig forskjell i tarmbakterieflora eksisterer mellom friske rotter og CRC rotter
Citation. Zhu Q, Jin Z, Wu W, Gao R, Guo B, Gao Z, et al. (2014) Analyse av Intestinal Lumen Microbiota i en dyremodell for tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (3): e90849. doi: 10,1371 /journal.pone.0090849
Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, Storbritannia
mottatt: 10 desember 2013; Godkjent: 30 januar 2014; Publisert: 06.03.2014
Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Nature Science Foundation National of China (nr 81230057). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hvert år blir om lag 1,2 millioner personer diagnostisert med tykktarmskreft (CRC) over hele verden [1]. CRC er den tredje vanligste kreftformen hos menn og den nest mest vanlig hos kvinner med de fleste tilfellene oppstår i den industrialiserte verden. Det finnes et kompleks celle fellesskapet innen en ondartet svulst. Dette fellesskapet ble utgjøres av oncogent transformerte celler, ikke-neoplastiske celler som stromal og immunceller, og mikrober slik som bakterier og virus i enkelte tilfeller [2]. Mange typer av kreft er forbundet med infeksiøse midler, og disse cancere har en tendens til å oppstå i slimhinnevevet som har høyt nivå eksponering for mikrober. Noen mener at inntil en femtedel av alle krefttilfeller er forårsaket eller fremmes av smittestoffer [3]. For eksempel kan cervical cancer og gastrisk kreft være forårsaket av humane papillomavirus, og bakterien,
Helicobacter pylori
, henholdsvis [4].
Det er vurdert at den totale celle antall forskjellige bakteriearter i fordøyelsessystem er 10
14, noe som er mer enn 10 ganger antallet av eukaryote humane celler [5] og kanskje så mange som ti ganger flere virus. I en sunn tarmen, opprettholder den normale bakterieflora homeostase hos verts [6]. Imidlertid, endringer i bakteriepopulasjoner og deres metabolske produkter har vært knyttet til flere sykdommer, inkludert ulcerøs kolitt, Crohns sykdom og CRC [7] – [9]. Og det er økende rapporter om at tarmen bakterieflora spiller viktig rolle i utviklingen av tykktarmskreftutvikling [10]. For eksempel, i dyremodellstudier, ble mutante mus som er genetisk mottakelige for CRC funnet å utvikle betydelig færre tumorer når det holdes i bakteriefrie omgivelser [11]. Wei og hans kolleger bestemmes strukturen endringer i tarmfloraen hos rotter utviklings forstadier slimhinnere indusert av kreftfremkallende DMH behandling, og viste at overflod av
Ruminococcus
-lignende og
Allobaculum
-lignende bakterier var økt i avføringen til DMH-behandlede rotter [12]. Moore og medarbeidere rapporterte også at 15 bakteriearter fra menneskelige fekal flora var signifikant assosiert med høy risiko for tykktarmskreft og 5 var forbundet med lav risiko for tykktarmskreft [13]. I tillegg ble Bacteroides og Bifidobacterium sterkest assosiert med økt risiko i sin studie med kaukasiske, japanske, Hawaiian, og afrikanske pasienter. Disse studiene preliminær viste at det var en nær sammenheng mellom tarmen bakterieflora og utvikling av CRC [13]. Det ble imidlertid ikke klare enkle bakteriearter identifisert som risikofaktorer for CRC fordi ca 80% av menneske bakterier ble ansett uncultivable [14]. For å bøte på dette problemet og undersøker mikrobiell diversitet, forskere har slått til innen metagenomikk [15]. I 2011 var det fire høyoppløselige kart som viser til sammenhengen mellom menneskelige colonic dysbiosis og CRC dukket opp etter hverandre, som rapportert av tre uavhengige grupper [2], [8], [16], og flere bakteriearter ble funnet å være fortrinnsvis bor enten tumorvev eller omkringliggende ikke-tumorvev. Berikelse av
Fusobacterium spp.
I tumorprøver var påfallende lik med de dokumenterte CRC microbiomes. Særlig er det et isolat av Fusobacteria (CC53), ble vist å ha invasivitet i dyrkede colon adenokarsinom-2 (Caco-2) celler [16]. Disse studiene rapporterte også en relativ overflod av
Bacteroidaceae
,
Streptococcaceae
,
Fusobacteriaceae
,
Peptostreptococcaceae
,
Veillonellaceae
, og
Pasteurellaceae
i kreftvevet i forhold til den normale tarmlumen [17]. Videre, for å etablere kolorektal kreft-relaterte dysbiosis, Sobhani
et al
. undersøkt avføringen microbiota av normale og tykktarmskreftpasienter som bruker pyrosekvensering og påfølgende prinsipal komponent analyse (PCA) [18]. Og de oppdaget en sammensetning endring i tarmen bakterieflora av CRC pasienter. Spesielt
Bacteroides Hotell og
Prevotella
arter ble funnet å være mer rikelig hos kreftpasienter enn hos kontrollpersonene. Samlet utgjør disse studiene viste at tarmen microbiota kan spille en viktig rolle i CRC utvikling
Host genetikk, miljø og kosthold ha en dramatisk effekt på verts microbiota av personer fra ulike land [19] -. [20 ]. Derfor kan vi observere at variasjon eksisterer i sammensetningen av tarmfloraen som fører til kliniske sammenhenger mellom bakteriell infeksjon og CRC. I denne studien har vi etablert en dyremodell av 1,2-dimetylhydrazin (DMH) -indusert tykktarmskreft og utført pyrosekvensering av 16S rRNA gener å sammenligne bakterieflora i tarmlumen av CRC rotter og friske kontroller. Vi har i tillegg identifisert bakterie phylotypes som kan tjene som potensielle biomarkører i CRC utvikling.
Materialer og metoder
Dyr og reagenser
Fire uker gamle Wistar hannrotter (180 -200 g) kjøpt fra Shanghai Shriek Forsøksdyr Corporation (Shanghai, Kina) ble brukt i denne studien. Alle dyr ble holdt i plastbur (med fire eller fem rotter /bur) under kontrollerte betingelser for fuktighet (44 ± 5%), lys (12 timer lys /mørke syklus) og temperatur (22 ± 2 ° C). 1, 2-dimetylhydrazin (DMH) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). DMH ble fremstilt friskt før anvendelse i 1 mM EDTA-saltvann og pH ble justert til 7,0 ved anvendelse av fortynnet NaOH-oppløsning.
Eksperimentelle metoder
Førti 4 uker gamle Wistar hannrotter ble delt i to grupper : en DMH-indusert tumor-gruppe (TG, n = 30) og en ikke-DMH-indusert tumor-gruppe (kontrollgruppen, CG, n = 10). Dyrene ble akklimatisert til gnager kosthold og vann
ad libitum
for en uke. Etter akklimatisering ble rottene fra TG ble intraperitonealt (i.p.) injisert med DMH (40 mg /kg) en gang i uken i 10 påfølgende uker. De gjenværende 10 rottene ble injisert intraperitonealt med EDTA – normal saltløsning som kontroller. Dyrevekter ble målt en gang i uken i løpet av forsøksperioden. Begynnelsen på den 12. uke av protokollen, ble tre rotter avlivet hver 2 uker for å undersøke dannelsen av tykktarmskreft. Dyrene ble bedøvet med ketamin 100 mg /kg og Xylazin 15 mg /kg kroppsvekt i.p. under aseptiske betingelser. Hele tykktarmen ble fjernet kirurgisk og åpnet i lengderetningen. Avføringsprøver ble samlet og frosset umiddelbart i flytende nitrogen. De avføringsprøver ble senere overført til -80 ° C til DNA-ekstraksjon ble utført. Tykktarmen ble fotografert, og det totale antall tumorer ble tellet. For histologisk undersøkelse, ble colontumorer separat skåret ut og fiksert i 10% nøytral fosfat-bufret formalin.
histologisk undersøkelse
For histologisk undersøkelse, ble de faste vev integrert og delt på 5 mikrometer intervaller. Vev ble farget med standard hematoxylin og eosin for lys mikroskopisk undersøkelse. Vevssnitt ble gjennomgått av to uavhengige patologer i en blind mote. Avvik mellom disse to etterforskere ble løst gjennom revurdering av den tredje patolog til enighet om mening var nådd.
Bakteriell DNA Extraction
Nukleinsyrer ble ekstrahert fra hver avføringsprøver ved hjelp av en metode modifisert fra produsentens retningslinjer for QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Mengden av DNA ble bestemt av Synergy 2 Multi-Mode mikroplateleser (BioTek, USA). Integritet og størrelsen av DNA ble bestemt ved 1% (w /v) agarosegel-elektroforese. Alle DNA-prøvene ble lagret ved -20 ° C inntil bruk. Rør som inneholder bare de QIAamp DNA Stool Mini Kit utvinning kontroller ble inkludert i hele lysis og PCR-trinn for å tjene som negative kontroller
PCR og 454 pyrosekvensering
Følgende universelle 16S ribosomalt RNA primere. ( 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 «, 533R: 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3») tilsvarer de V3 stillinger av 16S rRNA-genet, med en prøve strekkode-sekvens, og de FLX Tianium adaptere ble anvendt for å amplifisere den V3-regionen i hvert fecal prøve ved polymerase-kjedereaksjon. PCR ble utført med 10 ng mal, 0,4 pl FastPfu Polymerase (TransGen Biotech, Kina), 4 pl 5 × FastPfu buffer, 2 pl dNTP (2,5 mm hver, Takara Bio, Japan), 0,4 mL forward primere (5 mm) og 0,4 ul reverse primere (5 mm) på en ABI GeneAmp® 9700 cycler. Syklusparametrene var som følger: 5 min av denaturering ved 95 ° C etterfulgt av 25 sykluser på 30 sek ved 95 ° C (denaturering), 30 sekunder for hybridisering ved 55 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C (forlengelse), med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Triplikat PCR-reaksjoner ble utført på hver prøve. Amplifiserte produkter fra avføringsprøver ble verifisert ved hjelp av gelelektroforese under anvendelse av 5 ul av PCR-reaksjonsblandingen i en 2,0% agarosegel. PCR-produktene ble renset ved hjelp av AxyPrepDNA Gel utvinning kit (Axygen, US) og kvantifisert på QuantiFluor ™ -St fluorometer (Promega, USA). Produktene fra forskjellige prøver ble blandet med like forhold for pyrosekvensering ved hjelp av Roche GS FLX 454 Sequencer i henhold til produsentens instruksjoner.
Alle pyrosekvensering leser ble deretter fjernet fra sine primere, strekkoder, og adapter sekvenser, og videre skjermet og filtreres i henhold til standarder for kvalitetskontroll som følger: eliminering av sekvenser som ikke passer perfekt til proksimale PCR-primer (over to uoverensstemmelser til primere), de med kort sekvense lengde (mindre enn 200 nt) sekvenser som inneholdt mononukleotid gjentar av 6 nt, sekvenser med tvetydige tegn, eller sekvenser med en lese kvalitet scorer 25. Til slutt ble totalt 197,911 høykvalitets sekvenser fra tjue prøver produsert, som utgjorde 62,9% av gyldige sekvenser ifølge barcode- og primer-sekvens filtrering.
bioinformatiske analyse av Sekvensering av data
sekvensene ble justert ved hjelp av databasen SILVA (https://www.arb-silva.de/), og avgrensning av operasjonelle taksonomiske enheter (Otus) ble utført med Mothur på 97% cutoff i henhold til deres parvise avstander. Deretter gjennomførte vi analyse av God dekning, mangfold estimatorene (Shannon og Simpson), rikdom estimatorer (Chao1 og Ace), og vakuum, kurve ved hjelp av Mothur programvarepakken (https://www.mothur.org/wiki/Main_Page) på 80% konfidensnivået [21]. Heatmap ble bygget på slekten informasjon med heatmap 2 funksjon i R vegan pakken. I tillegg ble Bray-Curtis likheter som brukes til å konstruere en klynge dendrogram. Vi har også gjennomført uvektet Unifrac avstandsberegninger analyse ved hjelp av Otus fra hver prøve, og utføres hovedkomponentanalyse i form av matrisen av avstand. En metagenomic biomarkører tilnærmingen ble ansatt med lefse [lineær diskriminant analyse (LDA) kombinert med virkning størrelsesmåling] som utførte en parametrisk Wilcoxon sum-rank test etterfulgt av LDA analyse ved hjelp av online programvare (https://huttenhower.sph.harvard.edu /Galaxy /) for å vurdere effekten størrelsen på hver forskjellig rikelig taxon [22].
Statistical Analysis
t
-test og Mann-Whitney-testen ble utført ved hjelp av SPSS versjon 19.0 for Windows.
Etikk erklæringen
den eksperimentelle protokollen ble gjennomgått og godkjent av Animal Care og bruk komité og etikkomiteen i den sjette Folkets sykehus Affiliated til Shanghai Jiao Tong University.
data Access
16S sekvens informasjon som genereres i denne studien har blitt sendt til NCBI Sequence Les Arkiv under tilgjengelighetsnummeret SRA098098.
Resultater
Animal modeller og svulstdannelse
Ifølge den eksperimentelle protokollen (figur 1A), avlives vi tre DMH-behandlede rotter hver to uker begynner i 12. uke. Adenom ble først funnet i 12. uke i en av tre dyr avlives. Flertallet av adenomer, men ble funnet mellom det 14. og 18. uke (7/9). Dessverre, to DMH-behandlede rotter døde i 19. uke av kolon hindringer og kakeksi. I prøvene fra den 20. uken, fant vi at to rotter viste adenokarsinom (2/3) med tidvis adenom i vevet. Som et resultat, bestemte vi oss for å avlive den resterende del av DMH-behandlede rotter, så vel som de som hører til kontrollgruppen i den 22. uken for å holde rottenes livssyklus i samstemmighet. Ved obduksjon fant vi patologisk bekreftet colon adenokarsinom hell indusert i elleve DMH-behandlede rotter (11/13) med ingen bevis for organmetastaser. De resterende to rotter viste ingen tegn til tumordannelse. Men en av de dyr som ble funnet å ha en ufullstendig kolon hindring, derfor bare ti DMH-behandlede rotter ble inkludert i vår siste studiegruppen. I mellomtiden ble alle rottene i kontrollgruppen levde til den 22. uken. Den gjennomsnittlige kroppsvekt i de ti utvalgte DMH-behandlede rotter var 343,5 ± 10,74 g og 359,3 ± 7,61 g i kontrolldyrene uten statistisk signifikans (
p
= 0,59). Detaljer av DMH-induserte tumorer er oppsummert i Tabell 1 og vist i figur 1B-G.
(A) Eksperimentelle prosedyrer. (B) Normal kolon. (C) Adenom (hvit pil). (D) Adencarcinoma (gul pil). Den blodflekk rundt tumoren var forårsaket av tumor sår i stedet for vår disseksjon. Representative mikrofotografier som viser normal slimhinne (E), adenom (F) og adenokarsinom (G) ble forstørret i 40 × (til venstre), og hver av riktig mikrograf (400x) fremhevet distriktet fra den tilsvarende grønne rektangelet.
Kjennetegn på 454 pyrosekvensering
totalt 314,880 gyldige sekvenser ble innhentet fra alle 20 prøver, med et gjennomsnitt på 15,744 sekvenser per prøve. De resulterende sekvensene ble behandlet ved hjelp Seqcln (https://sourceforge.net/projects/seqclean/) og Mothor [23]. Etter å ha fjernet lav kvalitet sekvenser ( Q25) og sekvenser som er kortere enn 200 bp, med homo- lenger enn seks nukleotider, og inneholder tvetydige basis samtaler eller feil primer sekvenser, ble totalt 197,911 høy kvalitet sekvenser produsert med en gjennomsnittlig lengde på 481 bp per sekvens. Sekvenser ble justert mot silva database (SSU111 versjon: https://www.arb-silva.de/) med k-mer søking (https://www.mothur.org/wiki/Align.seqs). Potensielt kimære sekvenser ble oppdaget ved hjelp UCHIME (https://drive5.com/uchime) og fjernet. De resterende leser var pre-gruppert (https://www.mothur.org/wiki/Pre.cluster) og deretter gruppert hjelp ukorrigert parvis algoritme. De detaljerte egenskaper ved hver prøve finnes i tabell 2. I tillegg ble Operative taksonomiske enheter definert som deling 97% sekvensidentitet ved hjelp Lengst nabo-metoden (https://www.mothur.org/wiki/Cluster). Det totale antall otus ved 97% likhetsnivået var 41 923, med et gjennomsnitt på 2096 otus per prøve.
middelverdien av god dekning for hver gruppe var over 80%, noe som indikerer at 16S rRNA -sekvensene som er identifisert i de to gruppene utgjør hoveddelen av bakterier som er tilstede i forsøksprøvene. Mens vi ikke observere platået av refraksjon kurven (figur S1 A) med gjeldende sekvensering, hadde Shannon mangfold estimater av alle prøvene allerede nådd stabile verdier på dette sekvense dybde, noe som tyder på at selv om identifisering av nye phylotypes forventes av ytterligere sekvensering, hadde utvalget av mangfold innenfor prøvene blitt fanget (figur S1B, C, D). Statistisk signifikante forskjeller ble sett i Shannon indeksene mellom svulsten gruppe og en kontrollgruppe (5,92 ± 0,30 vs. 6,17 ± 0,20,
p
= 0,042, figur S1E). Forskjeller viser at høyere mangfold kan bli funnet i noncancerous tarmlumen av rotter fra kontrollgruppen som er bekreftet av Simpsons mangfold indeks (0,024 ± 0,013 g 0,013 ± 0,007,
p
= 0,037, figur S1F). Estimatorene av samfunnet rikdom (Chao1 og Ace) og detaljerte kjennetegn ved hver prøve er vist i tabell S1.
Sammenligning av Gut Microbiota mellom kontrollgruppen og Tumor Gruppe
Den mikroflora og komposisjoner av to gruppene ble analysert og sammenlignet ved den relative overflod av otus ved hjelp av uvektede Unifrac avstand matrise for hver gruppe. Følgende resultater fra PCA viste at det ikke var signifikant forskjell i bakterie fellesskap sammensetningen mellom friske rotter og CRC-rotter ved hjelp av de to første hovedkomponent-score av PC1 og PC2 (31,32% og 20,4% av forklart varians, henholdsvis) (figur 2). I tillegg ble lefse utført for å skaffe cladogram representasjon og de dominerende bakterier av bakterieflora i løpet av de to gruppene, som er vist i figur 3A. Vi viste også de største forskjellene i taxa mellom de to samfunnene i figur 3B.
Peptostreptococcaceae
,
Erysipelotrichales
,
Coriobacteriaceae Hotell og
Porphyromonadaceae
ble beriket i CRC rotter, mens
Roseburia Hotell og
Prevotella
ble beriket i friske rotter, som alle var viktige phylotypes involvert i segregering av tarmfloraen i CRC og friske rotter i samsvar med lefse analyse.
Hvert symbol representerer en prøve. Røde sirkler representerer friske rotter; Blå sirkler representerer CRC rotter.
(A) Taksonomisk representasjon av statistisk og biologisk konsistente forskjeller mellom friske rotter og CRC rotter. Forskjellene er representert ved fargen av de mest tallrike klasse (rød indikerer kontrollgruppe, grønn tumor gruppe og gul ikke-signifikant). Diameteren av hver sirkelens diameter er proporsjonal med takson overflod. (B) Histogram av LDA score for ulikt rikelig slekter. Cladogram ble beregnet ved lefse, og vises i henhold til effektstørrelse.
Sammenligninger av Gut Microbiota på ulike nivåer mellom friske rotter og CRC Rats
Vi studerte bakteriesamfunn i avføring fra tarmlumen fra rotter med eller uten CRC. De forskjellige phyla og slekter ble vurdert ved taksonomiske tilordning av alle sekvenser og den totale mikrobielle sammensetning for hver gruppe i rekken nivå er vist i figur 4A, B. Ifølge den taksonomiske resultater vi demonstrert at bacteroidetes, som utgjør 79,26% og 63,95 % av tarmen bakterieflora i friske og CRC rotter henholdsvis var den mest dominerende phylum i vår studie. Og firmicutes var den sekundære rekken med andelen av 15,14% og 29,55%, henholdsvis. Til slutt, spiroketer og Proteobacteria utgjorde den tredje mest vanlige phyla, bidrar 3,04% og 1,06% til friske rotter, og 2,44% og 2,95% i CRC rotter, respektivt. Sammensetningen av dominerende phyla er vist i Tabell S2. Vi finner at den mikrobielle sammensetningen viser høy interindividuell variasjon (Figur 4C). Firmicutes utgjorde 3,39% -48,35%, og bacteroidetes 43,24% -95,79% blant alle individuelle dyr (Tabell 3). Bortsett fra at, overflod av bacteroidetes og Cyanobakterier var høyere i tarmen bakterieflora i friske rotter enn at CRC rotter, og forskjellen viste statistisk signifikans (
p
= 0,044 og 0,003, henholdsvis) (figur S2A, B ). Mens firmicutes og aktinobakterier var betydelig mindre rikelig bakterieflora i friske rotter (
p
= 0,01 og 0,035, henholdsvis) (figur S2C, D). Fra våre data ingen Fusobacteria ble påvist i noen av de friske rotter (figur S2E) og det var ingen signifikant forskjell i Proteobacteria (
p
= 0,175) (figur S2F) når man sammenligner bakteriesamfunn i de to gruppene, selv om sin overflod var høyere i CRC rotter. Statistisk signifikante forskjeller mellom svulsten gruppe og en kontrollgruppe på familienivå ble også utført i vår studie. Forskjell i den relative overflod av bacteroidetes (11,6% vs. 4,6%,
p
= 0,0029), Rikenellaceae (3,71% vs 1,47%,
p
= 0,0008), og Peptostreptococcaceae (9,18 % vs. 1,61%,
p
= 0,046) var betydelig mellom CRC rotter og friske rotter, mens det var en ekstremt lavere Prevotellaceae (31,91% vs. 62,88%,
p
= 0,0027) og cyanobakterier (0,3% vs. 0,82%,
p
= 0,003) i CRC rotter sammenlignet med friske rotter.
(A) friske rotter, (B) CRC rotter. Histogram representerer den relative overflod av bakteriell phyla i bakterieflora av hver prøve (C). «Annet» representerer de uklassifiserte bakterier, aktinobakterier, cyanobakterier, Deferribacteres, Elusimicrobia, Fusobacteria og Tenericutes.
På slekten nivå, studerte vi den mikrobielle sammensetningen av hver prøve (Figur S3) og fant dem til å være signifikant forskjellig mellom de to gruppene. De ti mest tallrike slektene i kontrollgruppen var
Prevotella
,
Bacteroides
,
Lactobacillus
,
Treponema
,
Parabacteroides
,
Anaerovibrio
,
Ruminococcus
,
Roseburia
,
Oscillospira Hotell og
Sutterella
. Men
Prevotella
,
Bacteroides
,
Allobaculum
,
Treponema
,
Lactobacillus
,
Blautia
,
Parabacteroides
,
Paenibacillus
,
Anaerovibrio Hotell og
Paraprevotella
var de ti mest tallrike slektene i tumor gruppe, tilsvarende (figur S4). Interessant, selv om
Prevotella
var den mest tallrike slekten i begge grupper, overflod av det var mye høyere i friske rotter. Statistisk sett
Bacteroides
, med over 1% av de totale bakterier i avføringen, var relativt rikelig i CRC rotter. Legg spesielt merke slektene
Bacteroides. fragilis
ble i hovedsak funnet i CRC rotter. I mellomtiden,
Prevotella
,
Lactobacillus Hotell og
Treponema
ble funnet å være signifikant høyere hos friske rotter enn CRC rotter (figur 5). Genera
Desulfovibrio
,
Clostridium
,
Actinobacillus
,
Succinatimonas
,
Dorea
,
Phascolarctobacterium
,
Parabacteroides
,
Bilophila
,
Paraprevotella
,
Helicobacter Hotell og
Paenibacillus
utstilt lav overflod; men de var alle statistisk anriket i avføring av CRC-rotter sammenlignet med friske rotter. Videre slekter
Roseburia, Eubacterium Hotell og
Ruminococcus
ble beriket i kontrollgruppen, og
Fusobacterium
var fraværende fra friske rotter. Heatmap av bakterie slekten nivå også vist den samme fenomen (figur S5). Andre forskjeller mellom de to gruppene kan finnes i tabell S3.
Mann-Whitney test ble brukt for å vurdere betydningen av sammenligninger mellom angitte grupper.
Diskusjoner
den tarmfloraen i tarmen er heterogene og komplekse. Laboratorie gnagere har vært instrumental i å hjelpe forskerne å løse de komplekse interaksjoner som pattedyr, inkludert mennesker, har med sine mikrobielle commensals [24]. Vi har anvendt en felles dyremodell av CRC i denne studie for å undersøke naturen av mikrobiell fellesskap struktur i CRC sammenlignet med friske dyr. Funksjonene som utføres i dyremodeller studier kunne ha viktige implikasjoner relevante for sykdom hos mennesker [25].
I denne studien ble sammenlignet vi den bakterielle sammensetningen av tarmlumen fra rotter mellom friske gruppe og CRC-gruppen ved hjelp av plattformen Roche 454 sequencer. Vi observerte betydelig differensiering av gut microbiota mellom friske rotter og kreftfremkallende-behandlede rotter som utviklet colonic karsinomer. Vi viste en relativ høyere overflod av firmicutes, Proteobacteria og aktinobakterier i intestinal lumen av CRC rotter, og videre viste at bacteroidetes var mindre rikelig i denne gruppen. Dette resultatet er i samsvar med tilsvarende funn av Zhao
et al. Product: [26] fra studier på mennesker. Det har blitt rapportert at de inflammatoriske tarmsykdommer så som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt er kjente risikofaktorer for kolorektal kreft, og en betydelig reduksjon av Phylum bacteroidetes ble påvist i disse to sykdommer ved forskere [27] – [28]. I videre studier, ble endringer blant slektene i denne rekken også påvist i vår studie. Spesielt funn at
B. fragilis
ble økt i tarmlumen av CRC rotter.
Tidligere studier har antydet at ulike
Bacteroides
stammer kan påvirke helsen til verten gjennom sin colitogenic eller probiotiske potensial. Waidmann og hans kolleger hadde beskrevet den isolerte B. vulgates stamme med mulige probiotiske propertites som var i stand til å forbedre E. coli indusert kolitt utvikling av en ennå ukjent mekanisme i interleukin-2-mangelfull mus [29]. Men et menneske colonic commensal, enterotoksigenisk
B. fragilis
har vist seg at den koloniseringen av den i flere intestinale neoplasi (min) mus kan resultere i en markert økning i colonic tykkelse, betennelse og synlige colonic tumorer som følges av aktivering av STAT3 og infiltrasjon av T
H17 inflammatoriske celler [30]. Disse forskningsresultatene er i samsvar med våre funn at
B. fragilis
var aplenty i CRC rotter. I tillegg har Proteobacteria også blitt rapportert å være økt i den bakterieflora av dyr med eksperimentelt indusert kolitt og pasienter som lider av IBD [31]. Det kan være aktuelt med den direkte interaksjon mellom Proteobacteria og tarmcellene gjennom bakterie sekresjons-systemer så som type III sekresjon system (T3SS) [32]. Videre har det blitt rapportert at firmicutes holdt evne i å forbedre energi avling fra kosten [33]. Den firmicutes phylum inneholder relevant slekter, inkludert
Ruminococcus
,
Clostridium
og butyratproduserende produsenter
Eubacterium
,
Faecalibacterium Hotell og
Roseburia
[34]. Butyrat er en viktig energikilde for colonic epithelial cells, ofte foretrukket i forhold sirkulasjons glukose eller glutamin. Opptil 90% av butyrat metaboliseres av colonocytes [35]. Her viser vi redusert overflod av
Roseburia Hotell og
Eubacterium
i tarmen bakterieflora av CRC rotter. I to kostholdsintervensjonsstudier, befolkningstetthet av
Roseburia Hotell og
Eubacterium
ble vist seg å ha en sterk sammenheng med fecal butyratproduserende konsentrasjoner som svar på endrede karbohydrattilførsel [36], noe som tyder på viktigheten av
Roseburia Hotell og
Eubacterium
i produksjonen av butyrat in vivo. Sengupta
et al.
[37] viste at det kan være noen bevis på at levering av en tilstrekkelig mengde butyrate til tarmslimhinnen kan beskytte mot tidlig tumorigene hendelser. Derfor er strukturen ubalansen i denne papiret spiller en viktig rolle i å redusere butyrat-produserende bakterier i tarmen av CRC rotter.
Dessuten struktur ubalanse i tarmfloraen av CRC rotter er signifikant relatert til økningen i flere potensielle patogener og nedgangen i probiotiske arter. Det har blitt vist at
Bacteroides
populasjoner, og mer spesielt de av
B. fragilis
produsere en metalloprotease kjent som fragilysin i kolon kreftpasienter, men ikke i kontroller. Denne rapporten tyder på at dette undergruppe kan favorisere kreftutvikling [38]. I tillegg serried
Desulfovibrio
reduserer sulfat for å fremstille hydrogensulfid (H
2S), noe som har vist seg å være istand til å generere DNA-skade som kan være delvis ansvarlig for generering av genomisk ustabilitet og de kumulative mutasjoner observert i tykk- og endetarmskreft [39] – [40].
