Abstract
Bakgrunn
microRNAs fungere som posttranskripsjonelt regulatorer av genuttrykk i mange biologiske prosesser. Deres dereguleringer forekommer ofte i magekreft (GC). Selv om DNA metylering utgjør en viktig mekanisme for mikroRNA deregulering i kreft, forblir dette feltet stort sett uutforsket.
Metodikk /hovedfunnene
Total RNA ble ekstrahert fra vev av 100 pasienter med GC og fire mage cancercellelinjer. Uttrykket nivåer av MIR-10a ble bestemt ved real-time PCR med spesifikke TaqMan prober. Dessuten ble en funksjonell analyse av MIR-10a ved regulering av celle proliferasjon, migrering og invasjon utført. Deretter kvantitativ metylering spesifikke PCR (qMSP) ble brukt til å påvise DNA metylering status i CpG øyer oppstrøms av
MIR-10a
. I denne studien fant vi at uttrykket av MIR-10a i GC-celler var lavere enn i normale celler, som var på grunn av hypermethylation av CpG øyer oppstrøms av
MIR-10a
. Vi har også bekreftet den noe lavere ekspresjon av MIR-10a i GC vev enn de tilgrensende, ikke-neoplastisk vev i 100 GC pasienter og bekreftet hypermethylation av CpG øyer oppstrøms av
MIR-10a
hos noen pasienter. Videre re-innføring av MIR-10a inn i GC-celler var i stand til å inhibere celleformering, migrering og invasjon. Bioinformatiske og immunoblot analyse indikerte at tumorsupressorproteinene roller MIR-10a i GC-celler var muligens gjennom målretting HOXA1.
Konklusjon /Betydning
Våre data tyder på at Mir-10a fungerer som en tumor suppressor i GC celler og er delvis brakt til taushet av DNA hypermethylation i GC, noe som tyder på at MIR-10a kan tjene som et diagnostisk eller terapeutisk mål av GC
Citation. Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, Luo M, et al. (2014) mikroRNA-10A nedregulert av DNA Metylering og funksjoner som en tumor suppressor i Gastric kreftceller. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10,1371 /journal.pone.0088057
Redaktør: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Frankrike
mottatt: 26 januar 2013; Godkjent: 04.01.2014; Publisert: 31 januar 2014
Copyright: © 2014 Jia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (2011, 91129716, til JY), Beijing Municipal Science Technology Commission (2010B071, til J.Y.), Institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences (2009RC03, til J.Y .; 2010PYB06, til J.Y .; 2012G04, til J.Y.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den nest hyppigste årsaken til død av kreft i verden [1]. Så langt har noen tumorsuppressorgener og tumor-relaterte gener som er rapportert i GC. Selv om omfattende studier har blitt utført for å identifisere genetiske trasé og mekanismene som er involvert i kreftutvikling, har noen forbedringer på tidlig diagnostisering av kreft blitt gjort. MicroRNAs (mirnas) er endogene små ikke-kodende RNA som har blitt identifisert som posttranskripsjonelt regulatorer av genuttrykk. Tidligere studier har indikert at mirnas utøve sine funksjoner gjennom ufullkomne baseparring med 3’untranslated regionen (3’UTR) til målet mRNA [2] og mirnas har blitt grundig studert i sammenheng med cellesyklusregulering, differensiering, utvikling og apoptose [3], [4]. Akkumulert bevis indikerer at mirnas er deregulert i ulike sykdommer, spesielt i kreft. For eksempel, er MIR-216b markert nedregulert i nasofaryngeal karsinom [4]; MIR-340 er deregulert i brystkreft og kan hemme brystkreft celle migrasjon og invasjon [5]; og MIR-31 ble identifisert som et onkogen i esophageal plateepitelkarsinom [6]. Til sammen har mirnas blitt identifisert som potensielle kandidater til nye diagnostiske biomarkører eller terapeutiske mål for kreft.
MiR-10a har blitt rapportert å spille viktige roller i dannelsen og utviklingen av en rekke humane kreftformer. For eksempel er MIR-10a deregulert i hodet og nakke plateepitelkarsinom og også i leverkreft [7], [8]. Videre i menneskelig livmorhalskreft, serverer MIR-10a som et onkogen ved å regulere CHL1 [9]; nedregulering av MIR-10a ved kronisk myelogen leukemi fremmer CD34
+ celler spredning [10]. Imidlertid, hvis funksjon MIR-10a, og den mekanismen som ligger bak magekreft uklare. I denne studien har vi nøyaktig målt uttrykket av MIR-10a 100 pasienter med magekreft og undersøkt rollene til Mir-10a i mage kreftceller. Vi fant ut at Mir-10a ble nedregulert i GC vev og håndheves uttrykk for MIR-10a trykt spredning, migrasjon og invasjon av GC-celler.
epigenetiske modifikasjoner inkludert DNA hypermethylation, histon deacetylering og histon metylering er tett forbundet med geninaktivering. Promoter hypermethylation er antatt å være en alternativ mekanisme for å ned-regulere tumorsuppressorgener i humane cancere [11]. Mirnas hvis ekspresjon er undertrykt ved hjelp av DNA-metylering har blitt rapportert i noen humane cancere [12] – [14]. For ytterligere å undersøke hvorvidt den nedregulering av MIR-10a stammer fra hypermethylation av den genomiske regionen oppstrøms for
MIR-10a
, analyserte vi DNA-metylering av CpG øy i promoterregionen av
speil 10a
i 55 GC pasienter og fant at nedregulering av MIR-10a i GC vev kan være på grunn av hypermethylation av CpG sekvenser i sin promoter.
Materialer og Metoder
pasienter og prøvene
menneske~~POS=TRUNC kliniske prøver ble samlet inn fra kirurgiske prøver fra 100 pasienter med GC ved Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, General Hospital i Folkets frigjøringshær og Shanxi Cancer Hospital. De tilsvarende tilstøtende ikke-neoplastiske vev fra den makroskopiske tumor margen ble isolert på samme tid og anvendt som kontroller. Svulster ble iscenesatt i henhold til TNM (2010) klassifiseringskriteriene i Union for International Cancer Control (UICC). Alle prøver ble delt i to deler og ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Fire gastrisk cancer-cellelinjer (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45) var alle konservert i vårt laboratorium og opprettholdt i DMEM eller 1640 med 10% FBS. Klinisk forskningsetiske komité for Institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences godkjente forskningsprotokoller og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra deltakerne.
RNA Utvinning, cDNA syntese av mRNA og miRNAs, og Real- time PCR Assays
Total RNA ble ekstrahert fra magekreft vev og celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert ved absorbans ved 260 nm og cDNA ble syntetisert ved hjelp av M-MLV-revers transkriptase (Invitrogen) fra 2 pg av total RNA. Oligo (dT) 18 ble brukt som RT-primere for revers transkripsjon av mRNA. En stamme-sløyfe RT primer ble brukt for revers transkripsjon av miRNA. Kvantitativ RT-PCR ble utført i en Bio-Rad CFX96 real-time PCR System (Bio-Rad, CA, USA) ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq kit (Takara, Dalian, Kina) eller TaqMan prober (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) i henhold til produsentens anvisninger. PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 34 sek. For mRNA, ble data normalisert ved å bruke den endogene GAPDH kontroll. For mirnas, ble U6 snRNA anvendt som endogene kontroll. Den relative mengde av MIR-10a ble målt med 2
-ΔΔCT metode. Primer sekvenser er presentert i tabell S1.
DNA ekstraksjon, Metylering-spesifikke PCR (MSP) og kvantitativ Metylering-spesifikke PCR (qMSP)
Høy molekylvekt genomisk DNA ble ekstrahert fra mage kreft vev ved hjelp av en DNA Extraction Kit (BioMed, BJ, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Bisulfitt modifikasjon ble utført ved anvendelse av Epitect bisulfitt sekvenseringssett (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til protokollen. Opp til 2 pg av genomisk DNA ble anvendt som et utgangsmateriale. Normal lymfocytt-DNA behandlet med CpG metyltransferase (M.SssI) (NEB, MA, USA) ble anvendt som en positiv kontroll, og et reaksjonssystem uten templat ble brukt som en blank kontroll.
natriumbisulfat behandlede DNA ble amplifisert ved anvendelse av Bio-Rad CFX96 real-time PCR-system (Bio-Rad) ved anvendelse av KAPA SYBR® FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems) med følgende betingelser: 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 s, 54 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. qMSP reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Metyleringen nivå i en prøve ble beregnet som Lu L et al. beskrevet [15]. Primer sekvenser er presentert i tabell S1.
5-Aza-2′-deoxyazacytidine Behandling
Gastric kreftceller ble sådd i 10 cm retter (1 × 10
6 celler per parabol) en dag før behandling. Cellene ble behandlet med 1 pM 5-aza-2′-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) hver 24. time i 3 dager.
Cellekultur og Oligonukleotider Transfeksjon
De humane gastriske cellelinjer HGC-27, SGC-7901 og MKN-45 ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medier supplert med 10% føtalt bovint serum, og MGC-803 ble opprettholdt i DMEM (Gibco, BRL , UK) supplert med 10% føtalt bovint serum. Disse cellelinjene ble opprettholdt ved 37 ° C i fuktet luft som inneholder 5% CO
2.
Mir-10a etterligne, krafse ligne, siHOXA1 siRNA og krafse siRNA ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina ) og transfektert inn i cellene ved en sluttkonsentrasjon på 50 nmol /L ved hjelp DharmaFECT1 Reagens (Dharmacon, TX, USA).
Cell Proliferation og Colony Forming analyse
mimic- eller siRNA- transfekterte celler ble sådd på 96-brønners plater (5000 celler /brønn). Celler ble inkubert med 10% CCK-8 (DOJINDO, Japan) ved 37 ° C inntil visuell fargekonvertering inntraff. Spredningshastighetene ble bestemt ved 0, 12, 24, 48, 72, 96 timer etter transfeksjon.
ligne-transfekterte celler ble trypsinert og utsådd på 200 celler per brønn i 6-brønns plater og opprettholdt i 1640 med 10% FBS. Cellene ble dyrket i 7 dager, fiksert med metanol og farget med 0,1% krystallfiolett i 20% metanol i 15 min.
celleapoptose Assay
apoptose analyser ble utført i HGC-27 og MGC-803 cellelinjer ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose Detection kit jeg (BD Biosciences) i henhold til produsentens protokoll og deretter analysert ved Calibur Flowcytometer (Becton Dickinson).
Cell migrasjon og invasjon Analyser
A sårhelende analyse ble utført for å vurdere cellemigrering. En kunstig sår ble opprettet på en konfluent celle monolag uten FBS ved hjelp av en 200 mL pipette 24 timer etter transfeksjon. For å visualisere migrerende celler og sårheling, ble bildene tatt på 0, 12, 24, 36, 48, 60 timer.
For de transwell invasjons analyser, HGC-27 og MGC-803 celler suspendert i 0,2 ml RPMI 1640 eller DMEM uten FBS ble plassert på toppen av hvert kammer innsats (Millipore, MA, USA) på forhånd belagt med 40 ul av 1 mg /ml matrigel. Det nedre kammer ble fylt med 600 ul av RPMI 1640 eller DMEM-medium med 10% FBS som næringslokkemiddel. 24 timer senere ble cellene invasjons festet til den nedre overflate fiksert med 20% metanol og farget med May-Gruwald-Giemsa (MGG). Membranene ble deretter skåret og innebygd under dekke slips. Celler i tre forskjellige synsfelt ble tellet, og alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Western blotting
Western blot-analyse ble utført i henhold til standardmetoder. Proteiner ble separert ved 10% SDS-PAGE og deretter overført til PVDF-membraner (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membranene ble blokkert over natten med 5% ikke-fett tørrmelk og inkubert i 2 timer med et anti-HOXA1 antistoff (BioWorld, MN, USA) ved 1:500 fortynninger eller anti-GAPDH-antistoff (Proteintech, Chicago, USA) ved 1: 50.000 fortynninger. Etter vask med TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, og 0,1% Tween 20) ble membranene inkubert i 2 timer med sekundært antistoff (zsgb-bio, Beijing, Kina).
Statistikk
Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Studentens t-test (to-halet) og x
2-testen ble utført, og statistisk signifikans ble definert som α = 0,05 (to-side). Gjennomsnitt ± SD vises i tallene.
Resultater
MIR-10a er nedregulert i magekreft Cells
Vi undersøkte uttrykk for modne MIR-10a fire menneskelige mage kreft cellelinjer (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45) og en human mage epitel cellelinje (GES). Uttrykket nivået av MIR-10a i GES var betydelig høyere enn nivåene i de to magekreft cellelinjer (HGC-27 og MGC-803) og var ikke-signifikant, men observably høyere enn nivåene i de to andre mage kreft cellelinjer (MKN-45 og SGC-7901) (fig. 1a). Disse data antydet at nedregulering av MIR-10a kan være relevant for tilblivelse og utvikling av GC.
a Uttrykket av MIR-10a i fire menneskelige mage kreft cellelinjer (HGC-27, MGC- 803, SGC-7901 og MKN-45) og en menneskelig gastrisk epitel cellelinje (GES) ble oppdaget ved hjelp av real-time PCR med TaqMan prober. b Uttrykket av MIR-10a i 100 par GC vev sammenlignet med sine matcher tilstøtende ikke-neoplastiske vev. c Ekspresjon av MIR-10a i GC-vevet var lavere enn i tilstøtende vev, selv om det ikke var noen statistisk signifikante forskjeller. P = 0,148, paret t-test, tosidig. U6 snRNA ble brukt som endogen kontroll.
The Expression of Mir-10a i kliniske GC Pasienter og deres korrelasjon med Clinicopathological Kjennetegn
For ytterligere å studere sammenhengen mellom MIR-10a og GC genese, vi har oppdaget at ekspresjonen av MIR-10a i 100 kliniske pasienter ved TaqMan probe-avledet real-time PCR som beskrevet ovenfor. Ut av 100 par GC prøvene, ble uttrykket av MIR-10a nedregulert i 58 tilfeller (58/100, 58%) sammenlignet med tilsvarende tilstøtende vev (fig. 1b). Totalt sett, ekspresjonen av MIR-10a ble nedregulert i GC vev sammenlignet med de tilstøtende vev, selv om den nedregulering var ikke statistisk signifikant (p = 0,148, paret t-test, to-halet) (fig. 1c).
for å vurdere sammenhengen mellom uttrykket av MIR-10a og clinicopathological egenskaper, ble pasientene delt inn i to grupper i henhold til den relative uttrykk for MIR-10a i kreftvevet i henhold til en tidligere publisert artikkel [16] . Som vist i tabell S2, ble det observert en statistisk signifikant sammenheng mellom de to gruppene TNM. Det er flere pasienter som er i I + II scenen i gruppen med lavere uttrykk for MIR-10a i sine GC vev. Dette forholdet indikerte at Mir-10a kan være viktigere i begynnelsen av kreft kreftutvikling. Men våre data viser at uttrykket nivået av MIR-10a hadde ingen sammenheng med alder, kjønn, histologisk type svulst prosent, venøs invasjon, nerve invasjon, posisjon, Borrmann skrive, PT scenen, pN scenen eller PM scenen.
MIR-10a Hemmer Cell Proliferation
in vitro
for å undersøke hvilken rolle MIR-10a i magekreftutvikling, transfektert vi MIR-10a ligne inn i GC cellelinjer HGC-27 og MGC-803, som begge fremviste høy transfeksjonseffektivitet (fig. 2a). Som demonstrert av CCK-8 vekstmålinger 0, 1, 2, 3 og 4 dager etter etterligner transfeksjon, overekspresjon av MIR-10a redusert celleproliferasjon i begge cellelinjene, mens den krafse mimic hadde ingen effekt på celleproliferasjon sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 2b). Deretter ble kolonidannelse analyser utført for å evaluere den proliferative evne ligne-transfektert HGC-27 og MGC-803 celler og avslørte at overekspresjon av MIR-10a i HGC-27 celler redusert kolonidannelse (fig. 2c). Imidlertid har ingen av de MGC-803-celler dannet kolonier, som kan være på grunn av cellenes forholdsvis svak tilslutning. For ytterligere å håndtere effekten av MIR-10a på celle apoptose i de to GC cellelinjer ble tidlig apoptose av MGC-803 og HGC-27 celler undersøkt av Annexin V flekker etter MIR-10a ligne transfeksjon. Som forventet, få tidlig apoptotiske celler (20,8% i HGC-27 og 22,9% i MGC-803) ble påvist i krafse ligne behandlede celler, mens MIR-10a ligner behandlingen økte andelen av tidlig apoptotiske celler (28,4% i HGC -27 og 27,7% i MGC-803) (fig. 2d). Kollektivt, konkluderte vi med at Mir-10a kan undertrykke celle overlevelse i GC-celler ved å indusere celle apoptose.
a MIR-10a uttrykk i HGC-27 og MGC-803 celler transfektert med 50 nmol /L scramble eller speil 10a ligne i 48 timer. b Vekst-analyser av CCK-8 på 0, 1, 2, 3, 4 dager etter etterligner transfeksjon. c Colony dannelse analyse av ubehandlede, scramble-transfektert, og MIR-10A-transfektert HGC-27 celler. d MGC-803 og HGC-27 celler ble farget med PE Annexin V og 7-AAD 72 timer etter behandling med MIR-10a etterligner eller krafse. Tidlig apoptotiske celler er vist i nedre høyre kvadrant. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P . 0.001
MIR-10a Hemmer cellemigrasjon og Invasion
in vitro
Vi videre vurdert effekter av MIR-10a på celle migrasjon og invasjon, som var de viktigste faktorene for ondartet progresjon og metastasering. Migrasjonen evne ble demonstrert ved en sårheling /ripetest hos HGC-27 og MGC-803 celler. Begge cellelinjer ble behandlet med MIR-10a mimic var tydelig mindre trekkende enn de som ble behandlet med den krafse kontroll eller ubehandlede celler ved 12, 24 og 36 timer etter riper (fig. 3a). Videre gjennomførte vi en Matrigel celle invasjon analysen og farget de invaderte celler for å måle retnings invasjonen evner av cellene etter ectopically uttrykker Mir-10a i de to cellelinjer. Den invasivitet av celler transfektert med MIR-10a ligne ble dramatisk redusert sammenlignet med krafse kontroll og ubehandlede celler (fig. 3b). Resultatene viste at Mir-10a spilt viktige roller i å regulere cellemigrasjon og invasivitet i GC og foreslo at nedregulering av MIR-10a kan bidra til metastase i magekreftutvikling.
a HGC-27 og MGC -803 cellene ble behandlet eller transfektert med 50 nmol /L krafse eller MIR-10a i 24 timer, og sårene ble gjort. Det relative forhold av sårlukking i hvert felt er vist ved 0, 12, 24, 36, 48 timer. Bar, 500 mikrometer. b HGC-27 og MGC-803-cellene ble behandlet eller transfektert med 50 nmol /L krafse eller MIR-10a i 24 timer, og en transwell invasjon Analysen ble utført. Det relative forhold av invasive celler pr felt er vist. Bar, 50 um og 100 um. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P . 0.001
MIR-10a Targets HOXA1 i GC
mirnas utføre biologiske funksjoner gjennom negativt regulere sine mål gener. Det har blitt rapportert at onkogen HOXA1 er et direkte mål for MIR-10a i megakaryocytopoiesis og human bukspyttkjertel [17] – [19]. Som forutsagt av PicTar, var det en komplementær sekvens mellom has-MIR-10a og HOXA1 3’UTR (fig. 4a). Det er imidlertid ikke kjent om MIR-10a regulerer celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i GC ved å målrette HOXA1. For å klargjøre deres regulatoriske forhold, må vi først oppdaget proteinet og mRNA nivåer av HOXA1 i MIR-10a ligne-transfektert HGC-27 og MGC-803 celler ved hjelp western blotting og RT-PCR. Vi observerte en tydelig reduksjon i HOXA1 proteinnivået i nærvær av MIR-10a etterligner sammenlignet med kontroll krafse i de to cellene (fig. 4b). MRNA nivået av HOXA1 ble også nedregulert i HGC-27 celler, noe som tyder på at MIR-10a hemmer HOXA1 uttrykk ved nedverdigende mRNA av HOXA1 i HGC-27 celler. Imidlertid, var det liten endring i mRNA-nivået av HOXA1 i MGC-803-celler, noe som tyder på at MIR-10a kan nedregulerer ekspresjonen HOXA1 gjennom translasjonsbevegelse undertrykkelse men ikke mRNA spaltning i MGC-803 celler (fig. 4C). Videre har vi analysert proteinnivåer HOXA1 i 24 GC pasienter. Blant disse prøvene, var det 12 pasienter der MIR-10a ble nedregulert i sine GC vev og 12 pasienter der MIR-10a ble oppregulert i sine GC vev (fig. 4d). HOXA1 ble oppregulert i de fleste av pasientene som MIR-10a ble nedregulert i sine GC vev. Tilsvarende HOXA1 ble nedregulert i de fleste av pasientene som MIR-10a ble oppregulert i sine GC vev. En sammenligning av MIR-10a nivå og proteinnivå HOXA1 i GC viste en invers korrelasjon mellom MIR-10a og HOXA1 (R «> 2 = 0,1839, P = 0,0366) (fig. 4e). Sammen er disse funnene gir sterke bevis for at HOXA1 er et direkte mål på MIR-10a i GC. Vi har også oppdaget mRNA nivået av HOXA1 hos disse pasientene, og observerte at mRNA nivået av HOXA1 hos flere pasienter var ikke forenlig med proteinnivået som indikerte at Mir-10a regulerer uttrykket av målet, HOXA1, gjennom translasjonsforskning undertrykkelse, men ikke mRNA cleavage hos disse pasientene (fig. S1).
a prediksjon av bindingen mellom MIR-10a og HOXA1 av Pictar. b HOXA1 protein uttrykk i HGC-27 og MGC-803 celle transfektert med MIR-10a etterligner. c HOXA1 mRNA nivå i HGC-27 og MGC-803 celle transfektert med MIR-10a etterligner. d Western blot-analyse av HOXA1 proteinnivå på 24 GC pasienter. Det venstre panelet viser uttrykk for HOXA1 i 12 GC pasienter der MIR-10a ble nedregulert i sine GC vev (C) sammenlignet med tilsvarende tilstøtende ikke-neoplastiske vev (N). Høyre panel viser uttrykk for HOXA1 i 12 GC pasienter der MIR-10a ble oppregulert i sine GC vev (C) sammenlignet med ikke-neoplastiske vev (N). e omvendt korrelasjon mellom HOXA1 protein nivåer og MIR-10a uttrykk i over 24 GC pasienter.
Knock-down av HOXA1 Trykt magekreft cellevekst og migrasjon
in vitro
Deretter spurte vi om HOXA1 spilt viktige roller i magekreftceller. For å undersøke hvilken rolle HOXA1 i GC, vi slått ned endogen HOXA1 i HGC-27 og MGC-803 cellelinjer for å påvise effekten på celleproliferasjon og cellemigrasjon. Vi har observert at HOXA1 undertrykkelse inhiberte celleproliferasjon og migrering av HGC-27 og MGC-803-celler, henholdsvis (fig. 5a og 5b). Disse resultater antyder at MIR-10a fungerer som tumor suppressor i GC-celler ved å undertrykke HOXA1 uttrykk.
en vekstanalyser av CCK-8 på 0, 1, 2, 3, 4 dager etter transfeksjon siHOXA1. b HGC-27 og MGC-803-cellene ble behandlet eller transfektert med siHOXA1 eller kontroll i 24 timer, og sårene ble gjort. Det relative forhold av sårlukking i hvert felt er vist ved 0, 12, 24 og 36 timer. Bar, 500 mikrometer. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P . 0.001
MIR-10a epigenetiske Silenced i GC cellelinjer
For å belyse hvorvidt den lave uttrykk for MIR-10a i GC vev var et resultat av epigenetical endringer, behandlet vi HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45 celler med en DNA-metylering hemmer 5-AZA. Uttrykket av MIR-10a ble oppregulert i HGC-27, SGC-7901 og MKN-45 celler når de ble behandlet med AZA, noe som tyder på at uttrykket av MIR-10a kan bli undertrykt i disse cellene ved DNA metylering (fig. 6a).
a Validering av uttrykket av MIR-10a i HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45 cellelinjer behandlet med 5-AZA. b genomiske strukturen i
MIR-10a Hotell og dens omkringliggende regionen. CPG Øya ligger på 1,6 kb oppstrøms av
MIR-10a
. Vertikale flått representerer CpG nettsteder. c qMSP analyse av metylering nivået på
MIR-10a
genomisk region i GC cellelinjer og etter fem-AZA behandling. d metylering nivået av
MIR-10a
genomisk region i GC vev (kreft) var høyere enn sine matcher tilstøtende ikke-neoplastiske vev (normal) i 55 GC pasienter. e Den inverse sammenhengen mellom MIR-10a uttrykk og metylering status for MIR-10a genomisk region i de undersøkte 55 GC pasienter. f metylering nivået av MIR-10a genomisk region i GES, HGC-27 og MGC-803 celler. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P . 0.001
For å studere regulering av MIR-10a av DNA metylering, søkte vi det menneskelige genom database for tilstedeværelsen av CpG øyer rundt MIR -10a bruke «CpG Island Searcher» software og identifisert en CpG øy som ligger 1638 bp oppstrøms
MIR-10a plakater (fig. 6b). Videre, vi har oppdaget DNA-metylering status ved hjelp av qMSP og MSP i de fire GC cellelinjer. Den CpG øya ble hypermethylated i alle fire GC cellelinjer, som var konsistent med den lave ekspresjon av MIR-10a i disse GC cellelinjer. Når GC-cellelinjer ble behandlet med 5-aza-CDR, ble metylering nivået ble redusert sammenlignet med DMSO-gruppen (fig. 6c).
nedregulering av MIR-10a i GC pasienter skyldes den Hypermethylation av sine CpG Islands
Vi videre undersøkt metylering status for CpG øy i GC vev og tilstøtende normalt vev av 55 tilfeldig utvalgte saker gjennom qMSP. Metyleringen nivå i de 55 GC vevet var høyere enn i de tilstøtende ikke-cancervev (p 0,01), som var konsistent med den lave ekspresjon av MIR-10a i GC vev (figur 6d.). I tillegg har vi tilfeldig valgt to par av prøver på å analysere DNA-metylering nivået av bisulfat sekvensering av PCR (BSP) for å bekrefte nøyaktigheten av MSP. Resultatene av BSP var i overensstemmelse med den for qMSP og ble supplert som fig. S2. Videre metylering nivået av MIR-10a (M /M + U) i disse GC pasientene oppviste en invers korrelasjon med ekspresjonen av MIR-10a (R «> 2 = 0,1956, P = 0,0006) (fig. 6e). Vi har også oppdaget metylering nivået av MIR-10a i normale mage celler og mage kreft cellelinjer. Resultatene av qMSP viste at CpG island var delvis metylert i GES celler, men ekstremt hypermethylated i de to magekreft cellelinjer HGC-27 og MGC-803, som også foreslått at CpG island oppstrøms
MIR-10a
ble hypermethylated i GC-celler (fig. 6F). Sammen er disse funnene gir sterke bevis for at uttrykket av MIR-10a ble regulert av DNA metylering i disse GC pasientene. Den nedregulering av MIR-10a i GC pasienter skyldes hypermethylation av sine CpG øyer.
Diskusjoner
I denne studien har vi fastslått at Mir-10a ble nedregulert i menneskets magekreft delvis på grunn av sin DNA promoter hypermethylation. Videre studier viste at overekspresjon av MIR-10a trykt celleproliferasjon, migrasjon og invasivitet i GC cellelinjer HGC-27 og MGC-803, eventuelt gjennom målretting onkogen HOXA1.
Det er rapportert mirnas å regulere ulike utviklings og cellulære prosesser, og er implisert i mange menneskelige sykdommer, spesielt i kreft. Mirnas undertrykke genekspresjon ved å målrette mRNA gjennom binding til sine 3 «UTR. Disse mirnas oppviser regulatoriske rolle i patogenesen av kreft og er involvert i celle-proliferasjon, differensiering, apoptose, metastase og motstand [4], [20]. MiR-10a spiller en viktig rolle i en rekke kreftformer, inkludert hepatocellulær kreft [9], bukspyttkjertelkreft [17], akutt myeloid leukemi [21] og kronisk myeloid leukemi [10]. Den unormale ekspresjon av mir-10a er sannsynlig å spille en avgjørende rolle i ondartet transformasjon, og er i forhold til vev-spesifisitet. Dens deregulering kan bidra til utvikling av mage neoplasi.
validering av uttrykket av MIR-10a i kliniske prøver viste at Mir-10a ble nedregulert i 58 (58/100, 58%) GC vev sammenlignet med de tilstøtende vev. Men Weidong Chen
et al.
Undersøkt uttrykk for MIR-10a i 33 GC tilfeller og observerte at Mir-10a uttrykk var høyere i GC vev enn i de tilstøtende vev [22]. Den uoverensstemmelse kan være et resultat av den forskjellige mengde av kliniske prøver og ukarakteristisk endring av MIR-10a i GC vev. Våre data bør være mer biologisk representant på grunn av den større antall kliniske prøver. Bare en større del, men ikke alt av GC pasientene har en nedregulering av MIR-10a i sitt GC vev selv om MIR-10a fungerer som en tumor suppressor i magekreftceller. Dette kan være på grunn av tydelig mekanisme for tilblivelsen av GC i ulike individer. Det kan være noen andre viktige gener eller faktorer ansvarlig for tumordannelse i GC pasienter i hvis GC vev MIR-10a var uendret eller oppregulert. I tillegg MIR-10a ekspresjon viste ingen korrelasjon med clinicopathological karakteristika med unntak av TNM stadium, noe som indikerer at MIR-10a kan spille en rolle i delvis tumorigenesis spesielt i tidlige stadier.
Mange mirnas har blitt rapportert å korrelere med tumorigenesis imidlertid fortsatt den underliggende molekylære mekanismen uklart. I vår rapport, en funksjonell analyse av MIR-10a, inkludert celleproliferasjon, migrasjon og invasjon analyser, hjalp oss til bedre å forstå bidraget fra MIR-10a til magekreftutvikling. Transfeksjon av MIR-10a ligne signifikant hemmet celleproliferasjon, migrasjon og invasivitet i GC-celler, noe som indikerer at undertrykkelse av MIR-10a kan fremme tumorprogresjon i gastrisk karsinogenese. Fremtidige studier er nødvendig for å belyse denne mekanismen.
I det menneskelige genom,
MIR-10a
ligger oppstrøms
HOXB4
.
MiR-10b
, et annet medlem av MIR-10-familien, ligger oppstrøms
HOXD4
. Disse to elementer er forskjellige fra hverandre i bare en base og oppviser identiske frø sekvenser, noe som tyder på sine tilsvarende funksjoner. Kwoneel Kim [12] har rapportert at Mir-10b spiller en rolle i GC som en tumor suppressor. I vår studie, viste vi at overekspresjon av MIR-10a hemmet tumor spredning, migrasjon og invasivitet, som var lik funksjon MIR-10b i GC. Hox-gener er høyt konservert transkripsjonsfaktorer som er bestemmende for riktig anterior-posterior fordelingen av kroppsaksen [23]. HOXA1 har blitt validert som et direkte mål for MIR-10a i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen [17] og megakaryocytopoiesis [18].
