Abstract
Bakgrunn
Magekreft (GC) er assosiert med høy dødelighet og ugunstig prognose ved avanserte stadier. I tillegg finnes det ingen effektive metoder for diagnostisering av magekreft på et tidlig stadium, eller for å forutsi utfallet for det formål å velge pasientspesifikke behandling. Derfor er det viktig å undersøke nye metoder for diagnose GC.
Metodikk /hovedfunnene
For å lette bruken i et diagnostisk innstilling, ble en gruppe på 74 gener med diagnostisk og prognostisk informasjon oversatt til en tilpasset microarray som inneholder et redusert sett av 1,042 sonder som er egnet for høy gjennomstrømning behandling. I denne rapporten viser vi for første gang at den tilpassede mini-matrisen kan brukes som et pålitelig diagnostisk verktøy i magekreft. Med en AUC verdi på 0,565 (95% CI 0,305 til 0,825) som indikerer en perfekt test, sensitiviteten og spesifisiteten for diagnose fra ROC-kurven ble beregnet til å være 70% og 80%, respektivt.
Konklusjon /Betydning
Dataene viser klart reproduserbarhet og robusthet av den lille skreddersydd microarray. Matrisen er et utmerket verktøy for å klassifisere og forutsi utfallet av sykdommen i mage kreftpasienter
Citation. Yin Y, Zhuo W, Zhao Y, Chen S, Li J, Wang L, et al. (2013) Konvertering av et microarray signatur i en diagnostisk test: En prøveversjon av Custom 74 Gene Array for Avklaring og Prediction prognosen for magekreft. PLoS ONE 8 (12): e81561. doi: 10,1371 /journal.pone.0081561
Redaktør: Courtney G. Montgomery, Oklahoma Medical Research Foundation, United States of America
mottatt: 25 juni 2013; Godkjent: 14 oktober 2013; Publisert: 03.12.2013
Copyright: © 2013 Yin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81302070, 81272678, 81071961) (https://www.nsfc.gov.cn), National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) har en høy forekomst og er den nest største årsaken til kreftdødelighet [1,2]. Prognosen for GC er svært avhengig av stadiet av sykdommen ved diagnose og behandlingsmetoden [3]. Den 5-års overlevelse i avanserte magekreftpasienter er ca 20%, mens i tidlig stadium magekreft er det over 60% [4-6]. Imidlertid har det ikke vært noen effektive og anvendelige metoder for å påvise tidlig fase kreft og for å forutsi mulige prognosen for å tilveiebringe passende behandling for hver enkelt pasient. I Japan, selv om de kunne mer effektivt detektere og behandle tidlig magekreft (EGC) gjennom omfattende screening, bare endoskopi kan vanligvis brukes for påvisning EGC. Dette er grunnen til tidlig diagnose og evnen til å skille maligne og premaligne lesjoner er viktig [7]. Derfor er det viktig å undersøke nye metoder for GC diagnostiske eller prognostiske spådommer for kliniske applikasjoner.
Visse gen forandringer kan være assosiert med canceration og progresjon av GC [8-11]. For eksempel, tidligere data studerte vi antydet at kollagen gener kan være en potensiell biomarkør for å skille fra ondartet premaligne lesjoner i magen [12]. På grunn progresjon av sykdommen fra premaligne betingelser til GC er en dynamisk prosess [13-15], kan påvisning av genet endringer tillate identifisering av sykdomsassosierte gener tidligere enn patologiske undersøkelser. I tillegg gir genekspresjon ytterligere informasjon om pasientens tilstand [16]. Derfor kan microarray analyse være et viktig og nyttig metode for diagnose og risikolagdeling i magekreft.
I tillegg bruker tilpassede mini-arrays for klinisk praksis kan ikke bare være billigere, men kan også kreve mindre prøve RNA-inngang for merking og hybridisering, og den databehandlingstiden kan bli vesentlig redusert sammenlignet med vanlige mikromatriser [17]. En tilpasset microarray av 70 gener for prognose av brystkreft, som har blitt godkjent av Food and Drug Administration (FDA), bekrefter muligheten for tilpassede microarray i klinisk bruk [18,19]. Selv om det har vært flere studier på visse grupper av gener for GC diagnose, er det mikromatriseteknologi for tiden ikke brukes som et diagnostisk verktøy i magekreft.
I denne artikkelen beskriver vi for første gang utviklingen av en tilpasset diagnostisk GC mini-matrise og viser at den tilpassede mini-matrise kan brukes som en pålitelig diagnostisk og prediksjon verktøy i magekreft.
Resultater
En tilpasset mini-matrise av en gruppe av mulige gener knyttet til GC canceration og fremgang
I en tidligere studie, brukte vi et oligonukleotid microarray for 38.500 gener til systematisk å undersøke differensial genekspresjon blant 33 prøver fra normal, premaligne og maligne lesjoner i magen [12]. En brøkdel av 696 differensiert-uttrykk gener funnet i den formelle undersøkelsen ble utformet i den tilpassede mini-matrise som en del av en forskningsbase. I tillegg, for enkelte grupper hvor gener ble funnet som ble muligens nært knyttet til GC, den tilpassede mini-matrise også inkludert 44 kollagen relaterte gener [20-22], 54 gener for sex hormonreseptorer og stier, differensiert-uttrykk gener funnet i andre studier, og 915 normaliserings gener (beskrevet dataene i tabell S1). I denne studien ble en 1042-genekspresjon profil etablert som en kraftig diagnose og prediktor for sykdomsforløp i magekreftpasienter.
Sammenligning av 1042-Gene Array prestasjoner med Original 25k Microarray
For å finne ut om den tilpassede mini-matrise test utfører lik den originale 25 k mikromatriser [12], to prøver ( LYXT og LYXS) fra en samme pasientene som brukes i den opprinnelige serien å utvikle 1042-diagnoseklassifiserings ble hentet. Uttrykkene av 696 gener som genereres ved hjelp av diagnose mini-matrise var svært lik (Pearson korrelasjon på 0,957, p 0,01) til de opprinnelige publiserte data (figur 1)
Dataene indikerte uttrykket forholdet mellom ondartet. /premaligne. Det var ingen signifikante forskjeller mellom to grupper.
Identifisering av gener forskjellig uttrykt i maligne og premaligne mage vev
Alle data av hybridiseringer ble bakgrunn korrigert, normalisert, og analysert for å identifisere de differensiert-uttrykk gener i 40 prøver som representerer maligne lesjoner og premaligne lesjoner (n = 20 i hver gruppe). Et sett av 371 gener ble funnet å skille maligne lesjoner fra premaligne lesjoner ved hjelp av hierarkisk clustering og SVM leave-one-out bekreftelse, mens en premaligne prøve (MGFS) ble klassifisert i den maligne gruppen, og fem ondartede prøver (XSHT, GJFT, CXCT , XYT og QLTT) ble klassifisert inn i premaligne gruppen. Den MGFS og prøven ble samlet inn fra omkringliggende vev av en signetring karsinom. Den patologisk rapport viste at XSHT prøven var en moderat differensiert adenokarsinom, den GJFT prøven var en moderat til godt differensiert adenokarsinom, mens CXCT, XYT og QLTT prøvene var godt differensiert adenokarsinom. Disse differensielt uttrykte gener inkludert 199 oppregulert gener og 172 nedregulert gener i maligne lesjoner sammenlignet med premaligne lesjoner (figur 2).
Hver kolonne representerer en prøve og hver rad et gen. Karakter av «T» refererer til tumor og karakteren av «S» refererer til premaligne vev i prøvenavn. Uttrykkene av gener mellom to grupper har betydelige forskjeller, fold endringslogg
2 = 1 eller = -1, P 0,01
Skille prognosen for magekreft
en ukontrollert, hierarkisk clustering algoritmen tillot oss å klynge de 20 GC maligne lesjoner på grunnlag av deres likheter målt over betydelige gener av 371 differensielt uttrykte gener mellom maligne og premaligne lesjoner. Spesielt, i den venstre gruppe, 4 av 10 sporadiske pasientene var på et tidlig stadium av GC og de andre presentert med sterkt differensiert lesjoner, mens i den høyre gruppe, 2 av 10 sporadiske pasientene var fra gruppen som utviklet fjernmetastaser i løpet av 5 år eller med høy scene og dårlig differensiert lesjoner. Dermed bruker uten tilsyn clustering, kan vi skille mellom «god prognose» og «dårlig prognose «svulster i noen grad (figur 3). I tillegg ble den type og stadium av GC av pasientene forbundet med sub-grupper av dårlig eller god prognose (tabell 1, detaljerte data i tabell S2).
Hver kolonne representerer en svulst, og hver rad en genet. Lengden og inndelingen av grenene vise slektskap av GC (nederst) og ekspresjonen av genene (til høyre). Den gule linjen markerer inndeling i to dominerende klynger. Uttrykkene av gener mellom to grupper har betydelige forskjeller, fold endringslogg
2 = 1 eller = -1, P . 0,01
Gruppe 1 (god prognose)
Gruppe 2 (dårlig prognose)
Age62.8 ± 7.1161.3 ± 7.02Gender (Mann /Kvinne) 7/38 /2Stage (I /II /III /IV) 2/1/7/01/0/5 /4Pathological type (moderat til godt differensiert adenokarsinom /dårlig differensiert adenokarsinom /Signet ring cell carcinoma /mucinous adenokarsinom) 7/2 /1/03/4/1 /2Metastasis med 5 years13Table 1. etappe av magekreftpasienter i to grupper.
CSV Last ned CSV
Custom matrise med minimum antall gener for GC diagnose og prognose
Unsupervised todimensjonal cluster analyse av genet clustering og GC clustering ble utført uavhengig ved hjelp av en agglomerative hierarkisk clustering algoritmen med 371 gener som kunne identifisere ondartet GC og premaligne lesjoner. Korrelasjonskoeffisienten i uttrykket for hvert gen med sykdom utfall ble beregnet, og 252 gener ble funnet å være signifikant assosiert med sykdoms utfall (korrelasjonskoeffisient -0,3 eller 0,3) (detaljerte data i tabell S1).
Disse 252 gener ble rang-organisert på grunnlag av størrelsen av korrelasjonskoeffisienten. Antall gener i «prognostisk klassifikator «ble optimalisert ved sekvensielt å legge undergrupper av 5 gener fra toppen av denne rang-ordnet liste og vurdere sin makt for korrekt klassifisering ved hjelp av» la-one-out «metoden for kryssvalidering. Klassifiseringen ble gjort basert på korrelasjon av de ekspresjonsnivåene for de gjenværende prøver fra de gode og dårlige pasienter, henholdsvis. Nøyaktigheten forbedret inntil det optimale antall markørgener ble nådd. Derfor, ble 74 gener bestemt til å være det minste antall gener som kan bli klassifisert som to undergrupper av forskjellig prognose (figur 4). Med en AUC verdi på 0,565 (95% CI 0,305 til 0,825) som indikerer en perfekt test, sensitiviteten og spesifisiteten for diagnose fra ROC-kurven ble beregnet til å være 70% og 80%, respektivt (figur 5).
hver kolonne representerer en svulst, og hver rad et gen.
Basert på Gene ontologi (GO) -funksjonen klassifisering, er den funksjonelle annotering for de som er involvert i cellesyklus, invasjon og metastasering, angiogenese, og signaltransduksjon gener signifikant oppregulert i dårlig prognose signatur (annotering av gener som er oppført i tabell S1). Disse genene har flere grupper for hvor funksjonen merknaden gir innsikt i den underliggende biologisk mekanisme som fører til viktige funksjoner som er involvert i tumordannelse og progresjon. Som er involvert i cellesyklus, invasjon og metastase, angiogenese, og signaltransduksjon genene ble signifikant forskjellig uttrykt mellom to signaturer (for eksempel GKN1, INHBA, SPP1 og THBS4). Samtidig skiller uten tilsyn klyngeanalyse mellom forskjellige prognostiske svulster. Ved å evaluere alle 74 prognostiske reporter gener, flere gener som tilhører disse funksjonelle kategoriene bli tydelig (for eksempel GKN1, GKN2, GIF, PSCA og LIPF).
Pasientene i de to gruppene klassifisert av de 74 genene og hele probene er nesten det samme, bortsett fra prøven LCM, som ble klassifisert inn i god prognose gruppen i hele sonder microarray og inn i det dårlig prognose gruppen i 74-genet klassifisering. LCM prøve ble oppsamlet fra ondartet vev fra en pasient som lider av mucinous adenokarsinom i trinn IV med en kortere levetid enn de andre pasientene i den formelle grupper. Derfor kan det hende at 74-genet klassifisering microarray være mer pålitelig.
Verifisering av 74 gener tilpasset matrise og korrelasjon av microarray data med den prognostiske profilen
For de 11 GC pasienter inkludert i tidligere studie [12], beregnet vi korrelasjonskoeffisienten av nivået av ekspresjonen av de 74 gener med den bestemte gjennomsnittsProfilen profilen~~POS=HEADCOMP til disse genene i tumorer fra pasienter med god prognose (CI). En pasient med en korrelasjonskoeffisient på mer enn -0,007 (terskelen resulterte i en 13 prosent rente for falske negative resultater) ble deretter tildelt til gruppen med god prognose signatur, og alle andre pasienter ble tildelt til gruppen med de fattige -prognosis signatur (figur 6). I tillegg overlevelsen kurve av de to gruppene varierer markert (p 0,05) (figur 7). Dermed klassifikator viste en tilsvarende ytelse på validering av 11 uavhengige sporadiske svulster og bekreftet prediktiv kraft og robusthet av prognosen klassifiseringen av 74-genet tilpasset array.
Den gule linjen markerer inndeling i to dominerende klynger av todimensjonal klyngeanalyse. Den hvite linjen markerer inndeling i to dominerende klynger med optimalisert følsomhet.
Den x-aksen angitte måneder i løpet som pasientene fortsatt i live. Y-aksen indikerte at andelen levende pasienter (inkludert de med metastaser eller residiv).
reproduserbarhet av tilpasset mini-matrise
For å validere data av genekspresjon fra microarray data, valgte vi en differensiert-uttrykk genet, INHBA, og undersøkt dens uttrykk med kvantitativ RT-PCR-analyse. Våre data viste at genet vesentlig endret uttrykk i ondartet vev i forhold til premaligne vev i 11 pair-matchet prøver, i samsvar med resultatene fra microarray analyse (figur 8).
De vertikale tall med log
2 transformasjon er paret matchet forholdet mellom maligne lesjoner til premaligne lesjoner. A. Kolonnene står for de forhold som stammer fra kvantitativ QRT- PCR eksperiment. B. Sammenligning av forholdene mellom microarray og kvantitativ QRT-PCR-analyser.
En undergruppe av reproduksjon forbundet gener med magekreft
I 74-genet tilpasset microarray liste, vi fant en gruppe av gener med GO klassifisering av reproduksjon (tabell 2), der 5 gener for sex hormonreseptorer og stier (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 og FOXL2), kunne ikke bare effektivt separat ondartede fra premaligne prøver, men også klassifisere dårlig og god prognose med hierarkisk clustering og SVM (figur 9). I tillegg er to kjønnshormoner gener hadde betydelig differentiated- uttrykk for god prognose til dårlig prognose av GC (ESRRG 8,83, AR 0,37, p 0,01).
Symbol
Brett endring
Symbol
Brett change
AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table . 2. Gener med GO klassifisering av reproduksjon i 74 gener microarray gruppe
CSV ned CSV
uttrykk for gener mellom to grupper har betydelige forskjeller, brett endringslogg
2 = 1 eller = – 1, P . 0,01
Diskusjoner
i denne studien rapporterer vi for første gang at den tilpassede microarray kan være en effektiv metode for diagnostisering og prediksjon av prognose i GC klinisk. En manglende kliniske biomarkører for tidlig magekreft uten noen spesifikke tidlige symptomer fører til forsinket diagnose og bidrar til den høye dødeligheten av magekreft [23]. I noen tilfeller forekommer endringer bare på gennivå, med ingen patologisk forandring. Endringer i genuttrykk kan hjelpe i tidlig diagnose, prognose og behandling veiledning for postoperativ strålebehandling og kjemoterapi. Utviklingen av mikroarray teknologi gjør det mulig å studere muligheten for patologisk reversering og evaluering og veiledning av behandlingen. I tillegg kan skape målrettet microarray utstyr gjør teknikken mer nyttig. På grunn av dårlig spesifisitet og mangel på modne felles diagnose, har tilpasset microarray ikke blitt anvendt i klinisk bruk for magekreft ennå, selv om det finnes studier i genet diagnose.
Microarray analyse er en mye brukt teknologi for å studere genekspresjon på en global skala. Flere molekylære analyser tiden ansatt i den kliniske vurderingen av kreft er utledet fra microarray-baserte genuttrykk profilering. Et eksempel på en mikromatrisebasert assay er MammaPrint, en tilpasset mikroarray av 70 gener assosiert med risiko for den tidlige utviklingen av fjernmetastaser hos unge pasienter med lymph node-negativ brystkreft. MammaPrint er ratifisert av FDA. Muligheten til å bruke denne profilen i en høy gjennomstrømning diagnostisk innstilling kan være en stor fordel i prognose og behandling av brystkreft [17-19]. Imidlertid er teknologien i dag ikke brukes som en rutinemessig diagnostisk verktøy i magekreft, og det har vært noen studier av tilpassede mikromatriser som brukes i diagnostisering eller prediksjon av prognose. I denne rapporten viser vi for første gang at den tilpassede mini-matrisen kan brukes som et pålitelig diagnostisk verktøy i magekreft.
I denne artikkelen beskriver vi utviklingen av et tilpasset diagnostisk magekreft mini-matrise og beskrive sin pålitelig bruk i en diagnostisk innstilling. Mange kliniske studier har korrelert endringer i ekspresjonen av individuelle gener med magekreft resultat, ofte med motstridende resultater. Eksempler er CXCL1, HOXA10, og metylering av PCDH10 [24-26]. Imidlertid ble disse genene ikke inkludert i vår mini-array. Det er mulig at de andre studiene betalt mer oppmerksomhet til funksjoner av disse genene, mens vi fokusert på uttrykk for mRNA. Den 74-genet tilpasset matrise kan være en mulig prediktiv verktøy for magekreft. Dataene viser klart reproduserbarhet og robusthet av den lille skreddersydd microarray. Bruken av en tilpasset mikroarray kunne gi flere fordeler, for eksempel nøyaktig informasjon om gjentakelse risiko sammenliknet med konvensjonelle kliniske kriterier, og vil således bedre veiledning for kravet om adjuvant terapi.
I mellomtiden, på grunn av en 2 ganger høyere forekomst hos menn enn hos kvinner med GC [1], flere større epidemiologiske undersøkelser tyder på at kjønn var en signifikant uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse i GC pasienter [27,28 ] og mannlig overvekt av magekreft korrelerer med en 10-15 års forsinkelse i utbruddet av tarm typen magekreft hos kvinner sammenlignet med menn [29]. I denne profilen på 74 genet tilpassede mini-array, ble 5 gener uttrykt forskjellig mellom maligne lesjoner og premaligne lesjoner av GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 og FOXL2). Denne gruppen av sex-forbundet gener med mulige roller i GC ble først foreslått, og det er få studier på denne gruppen av gener assosiert med kreft. Det er viktig å merke seg at den siste studien rapportert av Matson og kolleger viste en mulig sammenheng og sti DMRT1, FOXL2 og kjønnshormonet [30]. DMRT1, DMRT3, og DMRTA1 er alle inkludert i en klynge av genet familien som har en sinkfingerlignende DNA-bindingsmotiv (DM domene) i felles, som også er en viktig regulator av mannlig utvikling i fluer og nematoder. Videre er de viktigste genene i denne reaksjonsvei inkludert i våre data. Dataene kan gi oss en forskningsretning for sex-relaterte gener i GC og avslører en mulig sti og mekanisme av GC canceration.
Derfor kan matrisen være et utmerket verktøy for å klassifisere og forutsi utfallet av sykdommen i mage kreftpasienter. Det er imidlertid noen begrensninger i vår profil. Prøvene bør utvides til å bekrefte den kliniske validitet og reproduserbarhet.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Førti kirurgisk resected magekreft prøver og tilstøtende ikke-vevsprøver var tilsendt fra Sir Run Run Shaw Hospital, School of Medicine Zhejiang University, og ble brukt i løpet av juni 2007 til mai 2011. Vi samlet maligne og premaligne vev fra ulike regioner i resected magen fra hver pasient som gjennomgikk kirurgi. Førti gruppert vevsprøver fra tjue pasienter med primær magekreft som gjennomgikk kirurgi (tjue maligne lesjoner, tjue premaligne lesjoner) ble valgt for oligonukleotid microarray analyse (tabell 1, detaljerte data i tabell S2). Alle de innsamlede prøvene ble fikset, forankret, farget med H E, og diagnostisert med Lauren og WHO klassifisering uavhengig av tre profesjonelle patologer. Tolv parede prøver med maligne og premaligne lesjoner fra pasienter som gjennomgikk kirurgi ble valgt for kvantitativ revers transkripsjon-PCR (kvantitativ RT-PCR). Resultatene fra kvantitativ RT-PCR ble sammenlignet med de patologiske poster fra den medvirkende institusjon. Endelig patologisk analyse ble bestemt ved konsensus og anmeldt om nødvendig. «Ondartet» refererer til forskjellige typer av gastrisk kreft. «Premaligne» indikerer atrofisk gastritt, intestinal metaplasi og /eller dysplasi. Prøvene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil videre behandling. Skriftlig informert samtykke ble innhentet før prøvetaking, og studieprotokollen ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for Sir Run Run Shaw Hospital.
Customized Mini-Array
Den opprinnelige tilpasset 8 * 15k mini-matrise inneholdt 1042 canceration og prognose relaterte gener som er identiske med sondene på den opprinnelige matrisen [12]. Den mini-matrise inkludert 696 differensielt uttrykte gener mellom maligne lesjoner og premaligne lesjoner av GC pasienter som vi fant i forrige 38, 500 genet chips, 44 kollagen relaterte gener, 54 gener for sex hormonreseptorer og baner, og differensiert-uttrykk gener som finnes i andre studier som ble oppdaget i tre paralleller. Hver rekke inneholder også 1042 prober for hybridisering og utskrift kvalitetskontroll samt 915 normaliserings gener (detaljerte data i tabell S1). Åtte identiske mini-arrays er tilstede på en eneste en «× 3» slide, noe som åpner for åtte individuelle hybridizations som skal utføres samtidig (tilpasses i Shanghai biochip Co Ltd, Agilent Technologies).
Oligonucleotide microarray
Det totale RNA ble ekstrahert og renset ved anvendelse av TRIzol Reagens (Invitrogen, USA) og RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland) ved hjelp av standard prosedyrer som anbefales av produsentene. Nivåene og kvaliteter av cRNA ble målt med et Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, USA), og kvaliteten av RNA ble kontrollert ved standard 2100 RIN = 7,0 og 28S /18S = 0,7. CRNA ble fragmentert med Gene Chip Sample Opprydding Module (Affymetrix, USA) og merket med en enkelt farge ved hjelp av Agilent forstørre notasjon metode. Hybridisering, farging, vasking og skanning prosedyrer ble utført som beskrevet i Gene Chip Expression Analysis teknisk anvisningen (Affymetrix, USA).
Analyse av oligonukleotid microarray data
Resultatene av microarray var skannes av en Agilent skanner. Data ble normalisert og samtalte etter bilde oppkjøpet og kvantifisering å identifisere gener med betydelige differensial uttrykk ved hjelp Feature Extraction programvare. En fri tolket datamaskinspråk (R) ble benyttet for statistisk beregning og grafikk [12]. Rådata av tilpassede microarray har blitt lastet opp til ArrayExpress som tiltredelse antall A-MEXP-2338.
Studiedesign
Vi brukte en metode basert på genuttrykk profiler for å klassifisere mage kreft i prognostiske eller diagnostiske kategorier. Metoden omfattet følgende trinn: (1) utformingen av en tilpasset mini-array med en gruppe av gener muligens relatert til GC canceration og fremdrift basert på tidligere studier, (2) valg av differensiert-uttrykk gener mellom maligne og premaligne lesjoner (fold endringen 2 ganger og p 0,05) (3), uten tilsyn todimensjonal klynge analyse av genet clustering og GC clustering utføres uavhengig av hverandre ved hjelp av en agglomerative hierarkisk clustering algoritme (4), valg av diskriminerende kandidat gener fra gener valgt i trinn 2 i henhold til deres korrelasjon med den kategori (god eller dårlig prognose) (5), bestemmelse av den optimale sett av rapportørgener ved hjelp av en leave-on-out kryssvalideringsprosedyren (6), prognostisk eller diagnostisk forutsigelse basert på genekspresjonen av den optimale sett av rapportørgener [18,19], (7) GO annotering av rapportørgener, og (8) analyse av korrelasjon av de mikroarray data med den prognostiske profilen
Kvantitativ RT-PCR-analyse
det totale RNA ble ekstrahert fra prøvene ble reverstranskribert inn i cDNA ved å bruke prim skriptet TM RT reagenssettet (Takara, Japan) ved 37 ° C i 15 min og ved 85 ° C i 15 sek. PCR-reaksjoner ved bruk av SYBR® premis EX Taq TM sett ble utført ved 95 ° C i 30 sekunder etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 10 sek, og 72 ° C i 40 sekunder med 7500 Real- time PCR System (Applied Biosystems, USA). Husholdningsgenet β-actin fungert som en intern kontroll. Termin primer sekvens av INHBA er GTGATGGCAAGGTCAACATCT, og omvendt en er GCGGTAGTGGTTGATGACTGT.
Statistisk analyse
Vi brukte proporsjonale-farer regresjonsanalyse for å justere sammenhengen mellom korrelasjonskoeffisienten (CI) og metastaser for andre variabler. P-verdier knyttet til odds ratio er beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
informasjon om gener i trinn på metoder for å designe den mini-matrise og de endelige 74 mini-array-gener.
doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s001 plakater (XLS)
Tabell S2.
Detaljene i informasjon av lesjoner for microarray.
doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s002 plakater (DOC)
