Abstract
Det sentrale biologiske klokke innenfor suprachiasmatic nucleus (SCN) spiller en viktig rolle i timelig organisere og koordinere mange av de prosesser som styrer kreftcelle spredning og tumorvekst synkront med den daglige lys /mørke syklus som kan bidra til endogen kreft forebygging. Bioenergetisk underlag og molekylære mellom som kreves for å bygge svulst biomasse hver dag er hentet fra både aerob glykolyse (Warburg effekt) og lipid metabolisme. Ved hjelp av vev-isolert menneskelige brystkreft xenografter dyrket i nakne rotter, fant vi ut at sirkulerende systemiske faktorer i verten og Warburg effekten, linolensyre opptak /metabolisme og vekst signale aktiviteter i svulsten dynamisk regulert, koordinert og integrert i circadian tidsstruktur over en 24-timers lys /mørke syklus av SCN-drevet nattlige pineal produksjon av anticancer hormonet melatonin. Dim lys om natten (LAN) indusert melatonin undertrykkelse forstyrrer dette circadian-regulerte vert /kreft balanse mellom flere viktige kreft forebyggende signalmekanismer, som fører til hyperglykemi og hyperinsulinemi i verts og løpsk aerob glykolyse, lipid signal og proliferativ aktivitet i tumor.
Citation: Blask DE, DAUCHY RT, DAUCHY EM, Mao L, Hill SM, Greene MW, et al. (2014) lyseksponering om natten forstyrrer Host /Kreft i døgn Regulatoriske Dynamics: Konsekvenser for Warburg Effect, Lipid alarm og tumorvekst Prevention. PLoS ONE 9 (8): e102776. doi: 10,1371 /journal.pone.0102776
Redaktør: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, USA
mottatt: 25 september 2013; Godkjent: 23 juni 2014; Publisert: 6. august 2014
Copyright: © 2014 Blask et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble sjenerøst støttet av American Association for Laboratory Animal Science (www.aalas.org) Tilskudd til forsøksdyrlære (GLAS) Award til RTD, National Institutes of Health (www.nih.gov) gi R21CA129875 til DEB, Tulane University School of medisin (www.tulane.edu) og Louisiana Cancer Research Consortium (www.louisianacancercenter.org) Startup Grant 631455 til Deb og National Institutes of Health gi R01CA054152 til SMH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fornyet interesse i metabolismen av kreft vekst [1] – [3] har nylig ført til en intensiv revurdering av rollen spilt av aerob glykolyse (f.eks Warburg effekten) i ondartet vekst progresjon [4 ]. For å møte deres bioenergetiske behov for å understøtte biosyntesen av de molekylære og cellulære byggeblokker som er nødvendig for hurtig å øke tumor biomasse, kreftceller stole primært på de Warburg virkning i stedet for oksidativ fosforylering [1] – [4]. Faktisk er det Warburg virkning, karakterisert ved den robuste cellulært opptak av glukose og dets metabolisme til laktat via glykolyse til tross for en rikelig tilførsel av oksygen [1] – [4]. Studier har fokusert på signaloverføring og transkripsjons nettverk, inkludert AKT [5], hypoksi-induserbar faktor-1 alfa (HIF-1α) og c-MYC [6] som driver Warburg effekten å omdirigere kreftcelle bioenergi mot generasjon av molekylær mellomprodukter ubønnhørlig å støtte kreftcelledelingen [1] – [3]. Kreftcelle proliferasjon og tumorvekst også avhengige av cellulært opptak av linolsyre (LA), en essensiell omega-6 fettsyrer (FA) som er den mest utbredte FA i den vestlige dietten [7] – [9]. I mange tumorer, kreftceller ta opp LA via en cAMP-avhengig transportmekanisme og forbrenne det til mitogen 13-hydroxyoctadecadienoic syre (13-hode) ved hjelp av enzymet 15-lipoksygenase-1 [9] – [12], aktiviteten som er oppregulert ved aktivering av epidermal vekstfaktor (EGF) og insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1) reseptorer [13], [14]. I mange svulster, inkludert humane kreft xenografter [9], [11], [12], utøver 13-hode en positiv feedback effekt på EGF og IGF-1 reseptoren vekst signalveier for å forbedre nedstrøms fosforylering av ERK1 /2 og AKT fører til forsterket celleproliferasjon og overlevelse svar [15]. Det må imidlertid bemerkes at i enkelte andre kreftmodellsystemer og eksperimentelle sammenhenger 13-hode kan spille en antiproliferativ rolle [16].
homeostatiske prosesser som regulerer pattedyr fysiologi og metabolisme i celler, vev og organer utstillings døgnrytme som er synkronisert med lys /mørke syklus omfatter hver 24-timers dag. Dette oppnås gjennom den endogene oscillasjon tidtaking aktivitet av SCN i hypothalamus som mottar informasjon om lys /mørke-syklusen fra øynene primært via egen lysfølsomme, melanopsin-positive gangliecelle med ytterligere innspill fra stenger og kjegler. Photic informasjonen blir så behandlet av den SCN og omformet til en oppstilling av hormonelle og nevrale utganger til perifere målvev [17]. Hos mennesker, forstyrrelser i døgnrytmen regulering av metabolske prosesser, inkludert glukose og lipidmetabolisme indusert via den unormale tidspunktet for lys kan føre til en økt risiko for type 2 diabetes, fedme [18], [19] og forskjellige maligniteter, inkludert brystkreft som har rapportert i natt skiftarbeidere [20], [21]. Utgangssignalet fra SCN som gjenspeiler mest pålitelig circadian aktivitet er nattetid pinealkjertelen produksjon av melatonin som er undertrykt av LAN. Circadian melatonin-signalet har blitt knyttet til den tidsmessige organisering og synkronisering av mange fysiologiske og metabolske aktiviteter som glukose- og lipidmetabolisme [19], [22], [23].
utgangene fra SCN antas å koordinere den biologiske tidspunktet for, og i tilfelle av melatonin, modulere de prosesser som styrer startfasen, promotering og progresjon inkludert celleproliferasjon, syntese DNA, celleoverlevelse /apoptose, cellesyklus traversen, skade DNA /reparasjonsmekanismer, tumorsuppressorgener virksomhet og tumorcelle invasjon /metastase [24] – [27]. Vi har tidligere vist at melatonin, ved fysiologiske nattlige blodkonsentrasjoner, direkte hemmer svulst DNA syntese og vekst ved å undertrykke cAMP-avhengige svulst opptak av LA og dens metabolisme til den mitogen molekyl 13-hode [10], [12] via en melatonin reseptor -mediert mekanisme. Men potensialet involvering av circadian regulering og konsekvensene av sin avbrudd på kreft metabolisme, spesielt Warburg effekten, har aldri vært adressert siden undersøkelser i dette området har vært basert nesten utelukkende på
in vitro
studier hvilken påvirkning av kreft vert sentral circadian regulering er fraværende. Vi postulerte at den daglige bioenergetisk, metabolske signalering, og proliferativ aktiviteter som kreves for å bygge svulst infrastruktur utstillingen dynamiske døgnrytme i både vert og svulst som bidrar til tumorvekst forebygging. Disse rytmer, som er avhengig av natta produksjonen av melatonin, et døgntumorvekst forebygging signal, blir forstyrret av eksponering av verten til LAN som resulterer i økt tumor metabolisme og vekst.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Tulane University Institutional Animal Care og bruk Committee (NIH Assurance # A4499-01). Alle dyrene ble opprettholdt i et anlegg akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International. Alle operasjoner ble utført under ketamin /xylazin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Reagenser
væskekromatografi (HPLC) -grade kloroform, etyl eter, metanol, glacial eddiksyre, heptan, heksan, og Sep-Pak C18 patroner for HPLC uttak av prøver ble kjøpt fra Fisher Chemical (Pittsburgh, PA). Fri fettsyre, kolesterolester, triglyserid, fosfolipider, rapsolje metylester standarder, så vel som bortrifluorid-metanol, kaliumklorid, natriumklorid, perklorsyre og trikloreddiksyre syrer ble anskaffet fra Sigma Scientific (St. Louis, MO). HPLC-standarder, ble (+/-) 5-HETE og 13 (S) -HODE), samt ultrarent vann kjøpt fra Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Michigan).
Dyr, lysforhold , tumor implantering og vekst
Weanling kvinnelige nakenrotter (Hsd: Rh-
Foxn1 [rnu]
) mellom 35 og 50 g ble plassert i klar polykarbonat bur (2 rotter /bur) i de laboratorium lyseksponering kamre på en 12-timers lys /12-timers mørke (LD, 12:12) syklus (fuktighet og lov lysene på 0600-1800 eller zeitgeber tid ZT0-ZT12 ved 23 ° C og 45-50% for å akklimatisere seg til disse betingelser i to uker. rotter ble gitt vann og mat (Purina Prolab RMH 1000) ad libitum gjennom hele studiet. etter akklimatiseringsperiode, ble dyrene tilfeldig delt inn i en kontrollgruppe på 36 rotter som forble på LD, 12:12 belysning regime (stummende mørke i mørkefasen) og en annen gruppe på 36 rotter opprettholdes på LD, 12:12 med eksponering for å dimme LAN under den mørke fasen. lysintensiteten under 12-timers lys fase i både gruppene ble levert av en ballast /lampesystem (GE Watt gnier, F34CW-RS-WM, 34-W lyspære) i hvert kammer som ga en jevn lys stimulans på dyr øyehøyde over 141 μW /cm
2 ( 345 lux). I kammeret gir dim LAN, var det en andre ballast /lampesystem (GE Starcoat, F32T8-SP-11, 32-W lyspære) som avgis jevnt svakt lys stimulans på dyr øyenhøyde på 0,08 μW /cm
2 ( 0,2 lux) i løpet av 12 timer mørke fasen [12]. Seks uker senere ble dyrene implantert med steroid-reseptor-negativ (SR) MCF-7 humane brystcancer xenografter i et vev-isolert måte, som tidligere beskrevet [12]. Disse svulstene hadde utviklet seg over flere passasjer fra en undergruppe av SR + xenografter som hadde mistet uttrykket av østrogen og progesteron reseptorer og ble østrogen svarer. Disse xenotransplantater ble histopathologically karakterisert som dårlig differensiert grad 3, infiltrerende duktale adenokarsinom som tidligere beskrevet [12]. I løpet av cirkadisk /tumorvekst studien, når tumorene nådde en tilstrekkelig størrelse for måling rotter ble utsatt for lys CO
2 narkose, og tumor dimensjoner ble målt gjennom huden med vernier calipers hver dag; tumor dimensjoner ble konvertert til estimerte tumor vekter med en lineær regresjon formel og vekstrater beregnet som tidligere beskrevet [9], [12]. Den endelige tumorvekt i tumorvekst studien ble bestemt ved å veie ved slutten av forsøket. Ved slutten av hver av de tumor vekstperioder, når tumorene nådde omtrent 5-6 g for både kontroll og LAN-utsatte grupper, ble undergrupper av 6 dyr tilfeldig drept og deres tilsvarende tumorer ble høstet hver 4. time i løpet av en enkelt 24-timers periode på 6 forskjellige biologiske tidspunkter (f.eks 0800 timer = ZT2, 1200 timer = ZT6, 1600 timer = ZT10, 2000 timer = ZT14, 2400 timer = ZT18, og 0400 timer = ZT22) som tidligere beskrevet [28]. På grunn av de sterkt akselerert tumorvekstrater i LAN-gruppen, xenografter (n = 36) nådde målrettet slakteklar på 5-6 g ca to uker før at de xenografter (n = 36) i LD 12:12 kontroll gruppe.
arteriell blod~~POS=TRUNC fra Kreft Host Rats
Etter to uker med belysning regimer som er beskrevet ovenfor, dyrene ble utsatt for en serie på seks lavt volum blod trekker via cardiocentesis å samle venstre ventrikkel arterielt blod, som tidligere beskrevet [9], [10], [12], [28] i løpet av en periode på 30 dager før tumorimplantasjon (se ovenfor). Kort fortalt ble blod samlinger utført ved utpekte fire timers mellomrom i løpet av en 24-timers periode begynner på ZT2 (0800 timer) med hvert dyr blir utsatt for cardiocentesis bare en gang hvert 5 dager i løpet av 30-dagers periode før svulsten implantasjon. Dette ble gjort for at dyrene til å gjenopprette sin lille blodvolumet tap og for å minimere stress og redusere de potensielle effektene av prosedyren på fôring og sykelighet /dødelighet. Dyrene ble lett bedøvet av CO
2 inhalasjon (70% CO
2/30% luft); 1 ml prøver ble tatt fra venstre hjertekammer ved hjertepunktur (mindre enn 5% totalt blodvolum) via tuberkulinsprøyte (25 gauge, 3/8, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) fuktet med natrium-heparin (1000 U /ml, Elkin-Sinn, Cherry Hill, NJ), som beskrevet tidligere. Blodprøvetaking under den mørke-fase (dvs. 2000, 2400, 0400 timer) ble utført under et sikkerhetslys rød lampe (Kodak 1A, modell B, katalog # 152 1517, 120 V, 15 W, Rochester, NY) for å kunne bevare den nattlig melatoninoverspennings [9], [10], [12], [28]. Animal rød lampe eksponering i øyehøyde løpet av den korte 45-sek cardiocentesis prosedyren var ikke større enn 0,48 ± 0,01 lux (1,16 ± 0,04 μW /cm
2). Det var ingen komplikasjoner på grunn av anestesi eller cardiocentesis under blodprøvetaking perioden; overlevelse var 100%, og dyrene ble umiddelbart aktive etter inngrepet. Plasmaprøvene ble lagret ved -20 ° C inntil analyse for melatonin, insulin, glukose, laktat og totale fettsyrer.
Samling av arterielt blod fra Tumor perfusjon Donor Rotter
Før initiering av tumor perfusjoner, 3-4 voksne nakne hunnrotter som opprettholdes på LD 12:12 ble bedøvet ved bruk av ketamin-xylazin-oppløsning (89,1 mg /kg og 9,9 mg /kg, IP). Dyr ble heparinisert via hals injeksjon av natrium-heparin (25 mg /kg; Sargent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL). Førti til 50 ml arterielt blod ble samlet inn mellom 0600 og 0900 timer (lav melatonin verdien) fra den høyre halspulsåren av donor-rotter via kateter for tumor perfusjon forsøkene (3 til 4 perfusjoner per gruppe), slått sammen, filtrert gjennom en 2 «x 2 «cheesecloth pad (Kendall hets gasbind svamp, Tyco Healthcare, Mansfield, MA), lagres i et reservoar i henhold mineralolje (Cat # M1180-500 ML;. Sigma Scientific, St. Louis, MO) og kjølt ved 4 ° C i et reservoar på is og forsiktig blandet via mekanisk rører (Model # 6975-171, Corning, New York) [9], [10], [12], [28]
Tissue-Isolert Tumor Perfusjons
In Situ
Når (SR) MCF-7 humane brystkreft xenografter nådd 5-6 gm anslått svulst i vekt, dyrene var forberedt på arterielle-venøse forskjellen målinger av totale fettsyrer (TFAs), LA, 13-hode, glukose, laktat, pO
2, CO
2 og pH mellom 0600 og 1000 timer når endogene melatoninnivåer var lave. Tissue-isolert xenotransplantater ble dynket
in situ
med rotte donor fullblod som enten syntetisk melatonin (Sigma, St. Louis, MO) og /eller 13 (S) -HODE (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), eller MT
1 /MT
2 melatonin reseptor antagonist S20928 (en generøs gave fra Institute de Recherches Inter Servier, Courbevoie Cedex, Frankrike) ble tilsatt som tidligere beskrevet [9], [10], [12 ], [28]. Stiller (3 eller 4 svulster /perfusjon) av vev-isolert human brystkreft xenotransplantater ble dynket
in situ
for en time som tidligere beskrevet [9], [10], [12], [28] med hele -blood samlet inn fra giver rotter. Inkorporering av [
3H] tymidin inn i tumor-DNA ble igangsatt 20 minutter før slutten av hver perfusjon ved å injisere 20 pl fysiologisk saltvann inneholdende 2 uCi [metyl-
3H] tymidin /g (New England Nuclear, Perkin Eimer, Boston, MA) beregnede tumorvekt i det arterielle kateter. Ved ferdigstillelse av hvert perfusjon, svulster ble frysefastklemt under flytende nitrogen, veid og oppbevar ved -85 ° C inntil analyse.
arteriell glukose, laktat og syre /gassmålinger
I løpet av løpet av denne studien arterielle hele blodprøver ble tatt for målinger av pH, pO
2, pCO
2, glukose og laktatnivåer, og hematokrit ved hjelp av en iSTAT1 Analyzer og CG4 + og CG8 + patroner (Abbott Laboratories, East Windsor, NJ). Verdier for glukose og laktat er rapportert som mg /dL og mmol /L, og for pO
2 og pCO
2 som mm Hg. Minstedeteksjonsnivåene for pH, pO
2 og pCO
2, glukose og laktat-verdier var henholdsvis 0,01, 0,1 mm Hg og 0,1 mm Hg, 0,2 mg /dL og 0,01 mmol /l.
melatonin og insulin analyser
arteriell melatoninnivåene i plasma ble målt via radioimmunoassay hjelp av melatonin rotte
125I – radioimmunoassaysett (Ap Diagnostika Nord, Nordham, Tyskland) og analysert ved hjelp av en Packard Cobra 5005 Automated Gamma Counter (Palo Alto, CA), som beskrevet tidligere [10], [12]. Arteriell plasmainsulinnivået ble målt ved hjelp av en ELISA kit (diagnosesystemer Labs., Webster, Texas).
Fettsyre ekstraksjon og analyse
arteriell plasma frie fettsyrer (FFA), triglyserider (TGA ), fosfolipider (PL), og kolesterolestere (CE) ble ekstrahert fra 0,1 ml prøver, slik som tidligere beskrevet [9] – [10], [12], [28]. Før ekstraksjon heptadecansyre (100 ug), som var blitt oppløst i kloroform (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), ble brukt som en intern standard. Metylestere av fettsyrer (fettsyrer) ble analysert ved anvendelse av en Hewlett Packard (Palo Alto, CA) modell 5890A gasskromatograf utstyrt med en flamme-ioniseringsdetektor (modell # 7673 A) autoinjektor (modell # 7673 S), og integrator (modell # 3396A). Alle separasjoner ble utført ved anvendelse av en 0,25 mm x 30 m-kapillar-kolonne (modell # 2380, Supelco, Inc., Bellefonte, PA) ved 190 ° C, med helium som bæregass (lineær hastighet 20 cm /s, split 100:1). Injeksjonsport og detektoren ble justert til 220 ° C. Alle metylestere ble identifisert på grunnlag av deres retensjonstid sammenlignet med den for kjente standarder. Minste detekterbare grensen for analysen var 0,05 ug /ml.
Tumor lysat ekstraksjon, proteinekstraksjon og Western blot-analyse
Frosne tumorer ble pulverisert og manuelt homogenisert i 50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,1% natrium-deoksycholat, 1 mM Na3VO4, 100 nM okadainsyre, og 1 x protease inhibitor cocktail Set I (Calbiochem /EMD Biosciences, Billerica, Massachusetts). Tumorlysatene ble sentrifugert ved 15 300 x g i 20 minutter. Supernatanter ble alikvotert og lagret ved -80 ° C. Proteinkonsentrasjoner i supernatantene ble bestemt ved anvendelse av en proteinanalysesett (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Totalt protein (80 pg per prøve) ble elektroforetisk separert på en 10% SDS-polyakrylamidgel og elektroblottet på en Hybond membran. Etter inkubering med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween, ble immunoblot probet med antistoffer mot fosfo-AKT (Ser
473), c-MYC (Cell Signaling Tech., Inc., Danvers , MA) eller HIF-1α (BD Biosciences, San Jose, California). De samme Blottene ble strippet og re-probet med antistoffer mot AKT (Cell Signaling Technology, Inc.), tubulin eller GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase) (Millipore Corp., Billerica, Massachusetts).
Statistisk analyse
tilstedeværelsen av betydelige tumor rytmer over 24 timer og graden av deres robusthet i enten circadian regulerte kontroll eller -disrupted LAN-utsatte grupper ble bestemt ved cosinor analyse ved hjelp periodogrammet (VBScript) programvare . Rå individuelle tumor data som er samlet over en enkelt 24-timers periode ble analysert ved hjelp av denne fremgangsmåten med en fast 24-timers periode. Statistiske forskjeller mellom middelverdier i LAN-eksponerte gruppen versus kontrollgruppen ved hvert døgn tidspunkt ble vurdert ved hjelp av en uparet Student t-test. Statistiske forskjeller mellom gruppen betyr i tumor perfusjon studier ble bestemt ved en enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest for å gjøre følgende multiple sammenligninger blant alle grupper: kontroll versus melatonin; kontroll versus melatonin + 13-hode; kontroll versus 13-hode; melatonin versus melatonin + 13-hode; melatonin + 13-hode versus 13-hode; og melatonin versus 13-hode. Forskjeller i bakken av regresjonslinjer (dvs. svulst vekstrater) blant gruppene ble bestemt av regresjonsanalyser og tester for parallellitet (Student t test). Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant på p 0,05. Student t test, enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni innlegg hoc test, og lineære regresjonsanalyser ble alle utført ved hjelp GraphPad Prism 5-programvaren.
Resultater
Circadian regulering og forstyrrelse av verts sirkulerende faktorer
Vi først undersøkt potensielle circadian dynamikk og deres avbrudd ved LAN i et antall verts faktorer, inkludert plasmanivået av melatonin, total fettsyrer (TFAs), LA, glukose, laktat og insulin hos rotter som bærer vev-isolert, steroid reseptor negative (SR) MCF-7 humane brystkreft xenografter på en lys /mørk (LD) 12:12 syklus [12]. Plasma melatoninnivåer var lav i hele den lette fasen og markert øket til topp amplituden i midten av den mørke fase (Fig. 1A). Eksponering av dyr for å dimme LAN induserte en 88% undertrykkelse i nattlige melatonin amplitude uten å påvirke circadian fase (Fig. 1a). Plasma TFA (fig. 1B) og LA (fig. 1C) rytmer i LD kontroller, som er avhengig av cirkadisk SCN-drevet nattlige foring aktivitet, ble bevart i LAN-eksponerte rotter indikerer at circadian avbrudd var begrenset til undertrykkelse av den nattlige melatonin signal. Circadian kontroll over både blodsukker og insulin nivåer uavhengig av effekten av matinntak er rapportert hos rotter [29]. Plasmaglukosenivåer økte etter lysene på topp på midten av det lette fase etterfulgt av en nedgang til lysene (Fig. 1 D). Etter lysene, glukosekonsentrasjoner innledningsvis økes deretter redusert til en nadir ved midten av det mørke fase etterfulgt av en andre økning i slutten av den mørke perioden. Melkesyrekonsentrasjon i dyr opprettholdt i LD 12:12 var generelt lav i hele lyset fase fulgt av en økning i løpet av mørketiden til å nå en topp to timer før lysene på (Fig. 1E). Under dim LAN forhold, rotter ble hyperglykemiske med arytmisk blodsukker rester markert forhøyet med 50% over styringsnivåer (Fig. 1D) mens arytmisk blodlaktatnivåer vært konsekvent lavere enn kontrollene i hele 24 timer (fig. 1E). Sirkulerende insulin nivåer viste en daglig pendling henhold LD 12:12 (Fig. 1 F) som vanligvis speilet mønster av sirkulerende IGF-1-konsentrasjonene tidligere rapportert [28]. LAN-eksponerte rotter ble markert hyperinsulinemiske med insulin nivåer beholde en oscillerende mønster som ligner den som ble observert i LD 12:12 kontroller (Fig 1F.); sirkulerende IGF-1 nivåene var også circadian-forstyrret og forhøyet henhold til LAN-betingelser [28].
(A-F) Plasmanivåer av melatonin (A), TFAs (B), Louisiana (C), glukose ( D), laktat (E) og insulin (F) ble målt i nakne hunnrotter verts bærer vev-isolerte SR-MCF-7 humane brystcancer xenografter i henhold LD, 12:12 (fylte sorte sirkler) eller LD, 12:12 + LAN (0,2 lux) (heltrukne røde sirkler). Arterielle blodprøver ble erholdt via hjertepunktering på seks forskjellige biologiske tidspunkter i løpet av en enkelt 24-timers periode. Den samme enkle 24 timer mønster for hver plasma analytt vises to ganger for å illustrere rytme kontinuitet. Zeitgeber tid (ZT) representerer timer etter at lysene på (ZT0 eller 0600 timer); lysene av på ZT12 (1800 timer). Svarte striper nederst på tallene tyder på den mørke fasen og røde linjene viser LAN. Hele sorte eller røde sirkler er gjennomsnitt ± SD; n = 6 ved hvert tidspunkt. Betydelige rytmiske mønstre i henhold LD, 12:12 forholdene i A – F, p 0,001; betydelig, men forstyrret rytmiske mønstre er svakt LAN forhold A – C og F bare, p 0,001 (enveis ANOVA). * P 0,01; ** P. 0,05 LAN vs LD, 12:12 (Student
t
test)
Circadian regulering og avbrudd av svulst glukose og linoleic acid metabolism
Vi neste testet om tumorxenotransplantater seg utstilt døgnrytme i tumor cAMP-nivåer, LA opptak, 13-hode formasjon og Warburg effekten som kan bli forstyrret av LAN-indusert melatonin undertrykkelse. I den foreliggende undersøkelse, er det Warburg virkning identifisert som tumoropptak av arterielt blod glukose kombinert med utgivelsen av laktat inn i tumoren veneblod [1] – [4]. Under LD, 12:12 forhold, tumor cAMP-nivåer (Fig. 2A), TFA opptak (Fig. 2B), LA (Fig. 2C) opptak, og 13-hode dannelse (Fig. 2D), økte i løpet av lys fasen til nå en topp to timer før lysene av, etterfulgt av en nedgang i den mørke fasen for å nå et nadir to timer før lysene på. Tumor glukoseopptak (Fig. 2E) og laktat produksjon (Fig. 2F) fulgte en lignende daglig rytmisk mønster ved å øke i løpet av den lette fasen for å nå en topp to timer før lysene av. Under den mørke perioden var det en progressiv nedgang i disse parametrene med glukoseopptak når nadir ved enden av den mørke fase og laktatproduksjon reduseres til et trau ved midten av det mørke periode etterfulgt av en stigning til to timer før lysene av. Under LAN betingelser, imidlertid, ikke bare var disse rytmer fullstendig fraværende, men nivåene av hver av disse parametere ble betydelig forhøyet over hele 24-timers periode.
(A-H) Tumor nivåer av cAMP (A) , TFA opptak (B), LA opptak (C), 13-hode dannelse (D), glukoseopptak (E), laktat formasjonen (F), [
3H] tymidin inkorporering i DNA (G), og DNA-innhold ble målt under LD, 12:12 eller LD, 12:12 + LAN; se legende for figur 1 for ytterligere eksperimentelle forhold. (I) Tumorvekst i begge grupper ble målt i løpet av forsøket. Hele sorte eller røde sirkler er gjennomsnitt ± SD anslått svulst vekt; n = 6 for beregnede tumorvekt. Cosinor Analysen avdekket robuste og svært viktige rytmiske mønstre i henhold LD, 12:12 forholdene i svulst analytter; ingen vesentlige daglig rytmiske mønstre ble oppdaget etter dim LAN (se sammendrag tabell 3). * P 0,01; ** P 0,05 LEN vs LD, 12:12 (Student
t
test). Tumor vekstkurver i I, p. 0,01 skråningen av tumorvekst i LAN gruppe vs LD, 12:12 gruppen (lineær regresjon)
Circadian regulering og avbrudd av tumor uttrykk for alarm og transkripsjonsfaktorer
Vi adressert også om AKT, c-MYC og /eller HIF-1α, sentrale transkripsjons regulatorer av Warburg effekten, stille døgn rhythmicity som blir forstyrret av dim LAN. Som en sentral stimulerende signal for svulst celle overlevelse /spredning, og glukose og LA metabolisme, AKT aktivering [f.eks fosforylering på serin 473 (s473)] var høyest i den lette fasen og redusert deretter til et lavmål i løpet av midten av mørke fase. HIF-1α uttrykk nivåer var lav i lyset fase fulgt av en økning til topp uttrykk under den mørke fasen (fig 3 E . F). Imidlertid er svakt LAN eksponering, den rytmiske ekspresjon av både fosfo-AKT (pakt
s473) og HIF-1α ble fullstendig avbrutt (fig 3 A og. B og E . D). Som svar på LAN-indusert melatonin undertrykkelse imidlertid en betydelig, men mindre robust rytmisk ekspresjon av c-MYC vedvarte over 24 timer (figurene 3 C E . F).
(A-F ) Tumor nivåer av fosfo-AKT
ser473 (A og B), cMyc (C se legende for figur 1 for ytterligere eksperimentelle forhold. Hele sorte eller røde sirkler representerer gjennomsnitt ± SD relative uttrykk (avledet fra densitometrisk kvantifisering av immunoblot) av enten Pakt
ser473, c-MYC og HIF-1α ved hvert døgn tidspunkt; n = 3 representative tumorprøver på hvert tidspunkt. Relativ ekspresjon av pakt
ser473 representerer forholdet mellom pakt
ser473 proteinet til total (t) AKT protein; relative ekspresjon av c-myc og HIF-1α representerer forholdet mellom disse proteinene til tubulin og GAPDH, respektivt. Cosinor Analysen avdekket robuste og svært viktige rytmiske mønstre i henhold LD, 12:12 forholdene i svulst analytter; bortsett fra c-MYC, ble ingen signifikante daglige rytmiske mønstre oppdaget i svakt LAN (se sammendrag tabell 4). Statistiske sammenligninger var ikke i stand til å bli gjort mellom tilsvarende tidspunkter mellom LD, 12:12 og LAN-grupper siden immunoblotter ble utført for de to gruppene i egne løyper. Bare en enkelt 24-timers syklus av immunoblot ble kjørt og vist, mens densitometrisk fremstilling av de samme immunoblot ble vist to ganger for å illustrere rytme kontinuitet som er angitt i forklaringen av fig. 1.
Circadian regulering og avbrudd av tumor proliferativ aktivitet
I lys av ovennevnte funn, postulerte vi forekomsten av tilsvarende biologiske endringer i tumor proliferativ aktivitet og DNA innhold. Vi fant at tumor [
3H] tymidin inkorporering i DNA (fig. 2G), så vel som DNA-innhold (fig. 2 H) økte i løpet av den lette fasen kort tid etter at lysene på for å nå en topp i to timer før lysene av. Under den mørke fasen imidlertid redusert både [
3H] tymidin inkorporering og DNA innhold til en nadir to timer før lysene på (figur 2 G . H). Circadian svingninger i [
3H] tymidin inkorporering og DNA innhold tyder på at tumor celle nummer økte i løpet av lys fasen på grunn av økt proliferativ aktivitet mens i den mørke fasen celle nummer redusert som tyder på at apoptotisk celle tap pågikk parallelt med redusert celle spredning. Våre resultater er i samsvar med tidligere studier i transplant mus mammary kreft som viser at brutto tumor størrelser og vekstrater faktisk svinge i en circadian måte gjennom hver dag i perioden av netto tumorvekst [30]. Som svar på LAN, ble det daglig svingning i proliferativ aktivitet og DNA-innhold opphevet da disse parametrene forble vedvarende forhøyet i løpet av 24 timer (figur 2 G . H). Under circadian-regulert forhold, økt tumorvekst jevnt over en to-ukers periode, mens etter circadian-forstyrret forhold vekstraten økt med to ganger i løpet av de kontrollene (fig. 2i).
Potential melatonin regulering av
