Abstract
menneskelig vev kallikreins (KLKs) er medlemmer av en multigen familie av serin proteaser abnormt uttrykt i mange krefttyper. I eggstokkreft er 12 KLKs oppregulert, og av dem KLK5, 6 og 10 har vært fokus for undersøkelser i nye diagnostiske og prognostiske biomarkører. Men lite er kjent om bidrag fra KLK5, 6 og 10 til eggstokkreft patofysiologi.
I denne studien, et panel av 13 humane eggstokkkreft cellelinjer ble screenet med ELISA for sekresjon av KLK5, 6, 8 , 10, 13, og 14. ES-2 cellelinje, blottet for disse kallikreins, ble transfektert med ekspresjonsvektorer for KLK5, 6 og 10 enkeltvis eller i par. Co-uttrykk for KLK5, 6 og 10 ble korrelert med minsket aggressivity av eggstokkreft cellelinjer som er definert av redusert kolonidannelse i soft agar og tumorgenisiteten i nakne mus. ES-2 kloner overekspresjon KLK5, 10/5, 10/6, 5/6 gjort betydelig færre kolonier i soft agar. Sammenlignet med styre mus, overlevelse av mus injisert med ES-2 kloner overekspresjon KLK10, 10/5, 10/6, 5/6 var signifikant lengre, mens KLK6 var kortere. Alle gruppene som viser en overlevelsesfordel også forskjellig både kvantitativt og kvalitativt i sin presentasjon av ascites, med både en redusert forekomst av ascites og et fravær av cellulære aggregater innen disse ascites. Den overlevelse fordel gitt av KLK10 overekspresjon kan rekapitulert med eksogene administrasjon av en rekombinant KLK10. I konklusjonen, disse funnene tyder på at KLK5, 6 og 10 kan modulere progresjon av eggstokkreft, og samhandle sammen for å endre svulst patofysiologi. Videre Resultatene støtter den antatte rolle KLK10 som en tumor suppressor og antyder at det kan ha terapeutisk potensial i eggstokkreft
Citation. Pépin D, Shao ZQ, Huppé G, Wakefield A, Chu CW, Sharif Z, et al. (2011) Kallikreins 5, 6 og 10 Forskjellig Alter Patofysiologi og total overlevelse i en Eggstokkreft Xenotransplantat Model. PLoS ONE 6 (11): e26075. doi: 10,1371 /journal.pone.0026075
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: May 23, 2011; Godkjent: 19 september 2011; Publisert: 15.11.2011
Copyright: © 2011 Pépin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend fra Ontario Graduate Scholarship naturvitenskap og teknologi til D. Pépin. Dette Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Principal midler til forskning ble gitt av IBEX Pharmaceuticals, Inc., som ansatt noen av forfatterne som har bidratt til utformingen av studiene og innsamling og analyse av data. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Z.-Q. Shao, G. Huppé, A. Wakefield og C.-W. Chu var ansatte i IBEX Pharmaceuticals, Inc., på tidspunktet for datainnsamlingen. D. Pépin, Z. Sharif og f.Kr. Vanderhyden er for tiden ansatt ved IBEX Pharmaceuticals, Inc. Det er ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
De nylig oppdagede vev kallikreins er en familie av utskilte serinproteaser omfatter 15 medlemmer (KLK1- 15) som har gener (KLK1-15) er gruppert sammen på en 300 kb region på kromosom 19q13.4 [1]. Klk proteiner blir påvist i mange biologiske væsker som blod, sædvæske, svette, spytt, cerebrospinalvæske, melk, og interstitielle rom hvor de kan aktiveres og /eller inaktivert ved enzymatisk spaltning [2]. KLKs spalte et bredt område av underlag, inkludert ekstracellulær matriks (ECM) proteiner, insulinlignende vekstfaktorbindende proteiner, protease-aktiverte reseptorer (PAR), andre kallikreins og til og med seg selv [2]. Videre er KLKs ofte uttrykt i grupper, for eksempel KLK3, 4, 5, 6, 8, 10, 13 og 14 i brystet eller KLK2, 3, 4, 5, 11 og 15 i prostata [2]. Disse observasjonene har ført til hypotesen om at kallikreins kan fungere i en kaskade å megle sine biologiske effekter, også kjent som KLK activome [3]. For eksempel, tyder foreløpige bevis på at KLK5 kan være en initiator av klk kaskader, i stand til å aktivere pro-KLK2, 3, 6, 7, 11, 12, 14, som resulterer i nedbrytning av ECM komponenter av sæd, og kondensering [4] .
Kallikreins har vært implisert i en rekke sykdommer så som Alzheimers sykdom og multippel sklerose [5], [6], inflammatorisk tarmsykdom [7], artritt [8], sepsis [9], diabetes [10 ], hudsykdommer [11] og kreft [12]. Fordi KLKs utskilles og lett påvisbar i biologiske væsker, har de dukket opp som potensielt verdifulle biomarkører, spesielt i kreft, hvor KLK3 (også kjent som prostataspesifikt antigen) har vist seg å være nyttig for prostatakreft overvåking. Mest KLK uttrykk er under hormonell kontroll, og responsen KLK2 og tre til androgener i prostata kreft cellelinjer [13], og KLK6 og 10 til østrogener hos brystkreftcellelinjer er godt dokumentert [14], [15]. Mønsteret av ekspresjon av KLKs, så vel som deres hormonelle regulering, antyder at de kan være involvert i hormonrelaterte adenokarsinomer av skjede som for eksempel prostata, testikler, brystkreft, livmorhalsen, og eggstokk-kreft.
Akkumulerende bevis tyder på at minst 12 av de 15 kallikreins er oppregulert i eggstokkreft. Av disse, KLK4, 5, 6, 7, 10 og 15 er forbundet med ugunstig prognose mens ekspresjonen av KLK8, 9, 11, 13 og 14 er forbundet med en gunstig prognose [12]. Denne studien fokuserer på KLK5, 6 og 10 som ofte er overuttrykt i eggstokk-kreft og funnet i forhøyede nivåer i ascites og serum av pasienter [16] – [18]. Spesielt, serum KLK6 og KLK10 er indikatorer på dårlig prognose [19], [20], og høy KLK6 er forbundet med kortere gjentakelse overlevelse og lavere total overlevelse [21]. Høye nivåer av KLK10 i serum er assosiert med avansert stadium serøs svulster med stor restsykdom og dårlig respons på kjemoterapi [22], mens lave nivåer av KLK10 i svulsten spår dårlig total overlevelse [23]. De histologiske subtyper av epiteliale eggstokkreft, som serøs, mucinous, endometroide, klarcellet og udifferensierte svulster kan gjenspeile forskjellige ontogenies og blir stadig viktigere i å skreddersy behandling [24]. Uttrykket av KLKs er bemerkelsesverdig lik på tvers av histologiske subtyper. For eksempel, alle undergrupper uttrykke KLK6, med kanskje en litt høyere andel av klare celle svulster som viser sterk farging for KLK6 [21], [25]. Likeledes er pasienter med tumorer av hver subtype er påvisbare nivåer av KLK10 i sine cytosols, med en svak, men signifikant høyere andel av KLK10 høye pasienter som er av den serøs subtype [26]. Til slutt, synes KLK5 uttrykk for å være mer utbredt i serøse og udifferensierte svulster [27], [28].
Mens lite er kjent om det biologiske grunnlaget for bidraget av KLK5, 6 og 10 til eggstokkreft, den evnen til KLK5 og seks spalter ECM-proteiner [4], [29], og aktiverer PAR signalering [30], tyder på at de er direkte innblandet ved forskjellige aspekter ved kreftutvikling. Nedbrytning av ECM-komponenter kan lette løsgjøring av maligne celler fra svulsten og invasjonen av normale vev, mens noen av de frigitte ECM peptider kan ha både pro og anti-angiogene egenskaper [29], [31]. Dessuten har PAR signale viktige roller i vasoregulation, cellevekst og inflammasjon [32], [32,33]. KLK10 ble identifisert som en antatt tumor suppressor i bryst [34] og mage kreft [35], og er ofte brakt til taushet i eggstokkreft cellelinjer og svulster [36], til tross for dens uttrykk i serum være en ugunstig prognostisk markør. Dette tilsynelatende paradokset eksemplifiserer motsetningen av kallikreins som både positive og negative regulatorer av prosessene som er involvert i kreftutvikling som angiogenese, vekst, invasjon og metastasering [37].
Mens bevis på avvikende uttrykk for flere kallikreins i eggstokkreft er montering, er lite kjent om deres bidrag til patofysiologien av sykdommen. Heri vi rapportere det første forsøket på å avdekke bidrag fra KLK5, 6 og 10 i en xenograft modell av eggstokkreft, og den første terapeutisk bruk av en rekombinant KLK10 protein
in vivo
.
Materialer og metoder
Cell kultur
opprinnelsen [38], og hvilken type svulster som dannes i xenografter [39] for eggstokkreft cellelinjer Caov-3 (adenocacinoma [40]), OVCAR -3 (mildt differensiert serøs adenokarsinom [41]), OVCAR-4 (adenokarsinom [42]), OV2008 (endometreoid adenokarsinom med plateepitel differensiering [39]), C13 (endometreoid adenokarsinom med plateepitel differensiering [39]), OVCA433 (adenokarsinom [ ,,,0],43]), Skov-3 (klarcellet adenokarsinom [39]), OVCA429 (clear cell adenokarsinom [39]), Hey (udifferensiert [39]), ES-2 (udifferensiert [39]), OCC-en (udifferensiert [ ,,,0],39]), A2780cp (udifferensiert [39]), og A2780s (udifferensiert [39]) som brukes i denne studien, samt kultur forholdene deres ble beskrevet i en tidligere publikasjon [39]. Cellelinjene HT1080 og NIH3T3, anvendt som kontroller, ble anskaffet fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i henhold til deres anbefalinger.
Konstruksjon av stabilt transfekterte ES-2-cellelinjer over-uttrykker kallikreins
De plasmider pcDNA3.1D /V5-His /lacZ (Invitrogen, Mississauga, ON, Canada) med geneticin motstand, og pIRESpuro-2 (Clonetech, VWR, Mississauga, ON, Canada) med puromycin motstand ble brukt som stamnett og stabilt transfektert inn i ES-2 cellelinje for å gi vektor kontroller. Kort sagt, flere kloner stabilt transfektert med pIRESpuro-2 ble brukt som enkle vektor kontroller, og flere kloner suksessivt transfektert med pcDNA3.1.1D /V5-His /lacZ og pIRESpuro-2 ble brukt som dobbel vektor kontroll. CDNA for KLK5, KLK6 og KLK10, samt pcDNA-KLK5 ekspresjon konstruere på en pcDNA3.1D /V5-His-TOPO ryggrad, ble vennligst tilveiebrakt av Dr. E.P. Diamandis (Toronto, ON, Canada). Den KLK10 ekspresjonsvektor i pCMV-neo ble gitt av Goyal et al. og har blitt tidligere beskrevet [44]. I korthet, PCR amplifikasjon, restriksjonsspalting og ligering av DNA-fragmenter som representerer cDNA av KLK5, 6, og 10 inn i ekspresjonsvektorer pIRESpuro-2 ble utført, og de resulterende konstruksjoner ble stabilt transfektert inn i ES-2-celler. Et minimum av 3 kloner av hver ble plukket og en ble tilfeldig valgt for å utlede de respektive cellelinjer ES-2-KLK5, ES-2-KLK6, og ES-2-KLK10 for
in vivo
eksperimenter. For doble transfektanter ble minimum 3 uavhengige kloner av pCMV-neo uttrykker KLK10 videre transfektert med Pires-puro-2 uttrykker KLK5 eller KLK6 og en av hver ble tilfeldig valgt å generere henholdsvis ES-2-KLK5 /10 og ES -2-KLK6 /10 cellelinjer. Cellelinjen ES-2-KLK5 /6 ble generert fra en av de 3 kloner ved stabilt å transfektere ES-2-KLK6 cellelinje med pcDNA-KLK5 konstruere. Transfeksjon av ES-2 celler ble utført ved hjelp av Lipofectomine ™ 2000 (Invitrogen, Mississauga, ON, Canada) i henhold til protokollen gitt av produsenten. Klonene som er beskrevet ovenfor, ble valgt ut og holdt i DMEM medier (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) som inneholdt geneticin (400 ug /ml) og /eller puromycin (10 ug /ml) (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA).
Cell Proliferation Assay
for å vurdere spredning, cellevekst ble analysert i foreldre ES-2 cellelinjer og 3 eller flere kloner stabilt transfektert med konstruksjoner for KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10 eller Vector kontroll ved hjelp av 12-brønners plater med innledende plating tettheter av 10.000 celler /brønn. Etter 96 timer ble cellene trypsinert og deretter telles med en Coulter Counter (Beckman Coulter Inc., Fullerton CA, USA).
Anchorage uavhengig vekst
Den protokollen som brukes er tidligere beskrevet av M. Pace et al [45]. I korthet, 5 x 10
3-celler ble suspendert i 3 ml komplett medium inneholdende 3,5% lavt smeltepunkt agarose og helles på toppen av bunnlaget på 7% agarose i det samme medium i brønner i en 6-brønns plate. Media (0,5 ml) ble tilsatt til hver brønn og skiftet hver 2-3 dag. En løsning av
p
-iodonitrotetrazolium fiolett (1 ml) ble tilsatt til hver brønn på dag 7 og kolonier ble farget i 24 timer, regnet, og fotografert.
Invasion analysen
For invasjonen analysen på kallikrein overekspresjon kloner, brukte vi HTS Transwell 96 system® (Corning, Lowell, MA). Kort fortalt ble transwells belagt med basalmembranekstrakter som instruert av produsenten, og 5 × 10
4 celler i 50 mL serumfritt medium ble deretter tilsatt til toppen kammeret, mens 150 ul medier med 10% serum var tilsatt til reservoaret. Platen ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 atmosfære i 24 timer. Cellene som migrerte til bunnen av innsatsen ble farget med hematoksylin i henhold til produsentens protokoll, og membranene ble montert på objektglass, skannes ved hjelp av ScanScope (Aperio, Vista, CA), og mengden av blå piksler ble kvantifisert ved å bruke Aperio programvare (Aperio, Vista, CA). Data ble plottet som% invasjon, når sammenlignet med mengden av celler på en kontrolltranswell membran ikke er belagt med basalmembranekstrakter.
Xenotransplantat
Alle dyreforsøk utført i denne studien var i samsvar med
Retningslinjer for omsorg og bruk av dyr
etablert av den kanadiske Council on Animal Care, og ble godkjent av Animal Care Utvalget ved Universitetet i Ottawa (Protocol ME-196). Kvinne CD-en nu /nu mus (Charles River Laboratory, Wilmington, MA, USA) i alderen 5-6 uker ble plassert sammen med mat og vann
ad libitum
, på en 12 timers dagslys syklus. Tumorcelle IP-xenograft fremgangsmåte ble tidligere beskrevet [39]. Kort fortalt, etter en uke med akklimatisering, ble musene injisert intraperitonealt (IP) med 10
7 ES-2 celler, eller en av dens avledede kloner valgt tilfeldig fra cellelinjer stabilt transfektert med KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, Vektor enkel styreanordning, eller vektor dobbelt kontroll, resuspendert i 0,8 ml fosfat-bufret saltvann. Gruppene ble deretter blindet for ionvestigators til slutten av eksperimentet på dag 56. sykdomsprogresjon ble overvåket daglig, basert på et sett av generelle velvære kriterier satt av dyr omsorg komiteen, og kroppsmasse ble spilt to ganger i uken til en forhåndsbestemt endepunkt var nådd. Tidspunktet for når symptomene på sykdommen først dukket opp, slik som mild oppblåst mage, eller lite håndgripelig masse ble registrert. Endepunkter inkluderte: dehydrering og /eller vekttap på over 15% til tross for væsketerapi, noen bevis for pustevansker, kroppsvekt økning på over 5 g fra gjennomsnittlig kroppsvekt kontroll mus på samme alder i samme befolkning, tilstedeværelse av en følbar abdominal masse som hemmer mobilitet, fôring eller påvirker velvære og til slutt nærvær av oppblåst mage som svekker mobiliteten eller påvirker velvære eller forårsaker betydelig misfarging tydelig på dorsal eller ventral hud.
Ved obduksjon ble tumorprøver veid og fordelt å være enten umiddelbart flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -20 ° C, eller fiksert i 10% bufret formalin (VWR, Mississauga, ON, Canada) i 24 timer og lagret i 70% etanol før prosessering i parafin-innleiret blokker, som ble skåret i 5 um seksjoner for hematoksylin og eosin (H E) farging. Ascites volum ble målt, og prøvene ble vurdert mikroskopisk for å bestemme tilstedeværelsen av cellulære aggregater. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 2500 x g i 10 minutter for å samle supernatanten for lagring ved -20 ° C for påfølgende målinger av klk nivåer ved ELISA.
Blodprøvetaking
For overlevelse eksperimentet blod~~POS=TRUNC prøvene~~POS=HEADCOMP ble tatt en uke før injeksjon, og hver uke inntil enten dyret nådd endepunktet eller den eksperimentelle periode ble avsluttet på dag 56. blod ble også tatt før obduksjon når det er mulig. For det rekombinante KLK10 blodklaring og toksisitet eksperiment, hvor hver dose gruppe (0, 0,2, 1 og 5 mg) hadde en dyr per endepunktet (-1 t, 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 8 timer, 12 h, og 24 h). For å gjenopprette plasma, ble 100-200 mL blod kjøpt av saphenous vene punktering med en 25G5 /8 gauge nål (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) og samlet inn microvettes® CB300LH (Sarstedt, Tyskland) belagt med heparin, sentrifugeres 5 minutter ved 2000 g, og plasmalaget ble separert for å bli lagret ved -20 ° C inntil de ELISA-er ble utført.
ELISA av kallikreins
for det panel av ovarian cancer cellelinjer cellene ble dyrket i 24-brønners plater med 5 x 10
4-celler og 1 ml av media per brønn. Medieprøver ble oppsamlet etter inkubering ved 37 ° C i 3 dager. ELISA for KLK5 [46], KLK6 [47], KLK8 [48], KLK10 [49], KLK13 [50], og KLK14 [51] ble utført i henhold til protokollene som er publisert tidligere. ELISA for KLK5, 6 og 10 ble utført på media av ES-2 kloner etter 24 timer med kultur på dagen for xenograft implantasjon. Tilsvarende ELISA ble utført på både humane ascites prøver og museserum og ascites prøvene fortynnet fra 5-fold til 8000 ganger, avhengig av KLK konsentrasjon, i en fortynningsbuffer (50 mM Tris-Cl pH 7,8, med 60 mg /ml BSA og 0,5 mg /ml natriumazid).
Rekombinant KLK10 produksjon
KLK10 cDNA ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av oligonukleotider KLK10FP (TATACGTAGCGCTGCTCCCCCAAAACGACAC) og KLK10RP (GTCCTAGGATCGATTGGAGCGTATGAC) [44] fra en pCMV-neo vektor som bærer KLK10 cDNA. Etter dobbel fordøyelse med
SNAB
jeg og
Avr
II ble forsterket DNA fragment inn i pPIC-9, pre-fordøyd med
SNAB
jeg og
Avr
II. Det resulterende plasmid, pPIC-KLK10, ble deretter forvandlet til
Pichia pastoris
vertsstammen KM71 av elektroporering (
Pichia
Expression kit, Invitrogen livs teknologier).
Fermentering av 15-liter rekombinant KLK10 ble utført med en biostatens ® ED fermenter (B.Braun Biotech International, Allentown, PA, USA) og en prosess basert på Pichia Retningslinjer gjæringsprosessen fra Invitrogen. I korthet fermentor ble inokulert med gjær fremstilt i en 2800 ml rysteflaske for et utgangs OD
600 av ~0.3. Etter en 20 timers satsfase glyserol, ble en 4-timers glycerol matefase fulgt. Induksjon ble initiert ved å starte glycerol mating og varte i ca. 40 timer. Celler ble fjernet ved sentrifugering og supernatanten ble oppsamlet.
Rensing av KLK10 fra supernatanten ble utført ved anvendelse av en CM-Sepharose kolonne (Amersham Biosciences, ON, Canada) som tidligere beskrevet [49].
Behandling med rekombinant KLK10
for det blodclearance forsøket, vi først testet enkel bolus IP doser av rekombinant KLK10 (0, 0,2, 1 og 5 mg i 1 ml) med 5 nu /nu mus pr dose og samplet blod ved forskjellige tidspunkter, som beskrevet ovenfor. Dyrene ble nøye overvåket for de første 12 timer, og deretter med jevne mellomrom for 15 dager før han ble ofret.
For giftig forsøket vi testet doser på 0, 50, 200, og 800 mikrogram i 1 ml KLK10, administrert daglig IP i 3 dyr per gruppe i 7 dager, etterfulgt av 7 dager daglig overvåking med ingen behandling før de ble ofret. Ved obduksjon ble lever, lunge, hjerte og nyre fjernet og delt for å være enten umiddelbart flash-frosset og lagret ved -20 ° C eller fiksert i 10% bufret formalin (VWR, Mississauga, ON, Canada) i 24 timer og lagret i 70% etanol før prosessering i parafininnstøpte blokker, som ble skåret i 5 um seksjoner for H E farging. Snitt ble analysert for tegn på inflammasjon og skade.
For det terapeutiske forsøk, ble nakne mus tilfeldig delt inn i en kontroll- og to behandlingsgrupper (8 dyr /gruppe). Behandlingstid var 14 dager og studien endte på 8 uker etter xenograft. Dyr fortsatt i live ved slutten av studien ble ofret. På dag 1, ble dyrene injisert IP med 0,2 ml PBS-buffer eller 0,2 ml PBS inneholdende 5 mg av KLK10 umiddelbart etterfulgt av en injeksjon av 10
7 ES-2-celler resuspendert i 0,8 ml PBS-buffer. Fra da av 1 ml PBS-buffer eller 1 ml PBS inneholdende 5 mg av KLK10 ble injisert IP til hvert dyr enten daglig eller to ganger daglig (som indikert) fra dag 2 til dag 14.
I
in vitro
behandling eksperiment, 10
5 ES-2-celler per brønn ble sådd i en 12-brønners plate inneholdende enten serumfritt DMEM eller DMEM med 10% føtalt kalveserum, og suppleres med 4 doser eller rekombinant KLK10 (0, 300 ng /ml, 3000 ng /ml og 30000 ng /ml) i 96 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon, og celler ble tellet ved bruk av en ViCell Counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA).
Overlevelseskurver og statistiske analyser
Kaplan-Meier-overlevelseskurver ble plottet ved hjelp GraphPad Prism 4.0-programvaren (Graphpad Software, San Diego, CA, USA) og sammenlignet ved hjelp av en logrank test. Patofysiologiske parametere slik som ascites volum og tumorbelastning (total tumormasse spaltet) og resultatene fra
in vitro
forsøkene ble sammenlignet med en-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey innlegget til test. Proporsjoner som forekomst av aggregater eller ascites ble sammenlignet med CHI torget. Statistisk signifikans ble utledes ved p. 0,05
Resultater
Utskillelse av kallikreins 5, 6 og 10 korrelater med redusert aggressivitet i et panel av eggstokkreft cellelinjer, men kan påvises i ascites av kreftpasienter på eggstokkene
uttrykk for kallikrein klyngen inkludert KLK4 å KLK14 har tidligere blitt rapportert i eggstokkreft [37]. Men det har også blitt rapportert at forskjellige kallikreins kan ha diametralt motsatte virkninger på pasienten prognose i en rekke kreftformer [37]. For å kontrollere at kallikrein uttrykket rekapitulert i eggstokkreft cellelinjer, et panel av tretten eggstokkreft cellelinjer (CAOV-3, ovčar-3, ovčar-4, OV2008, C13, OVCA433, Skov-3, OVCA429, Hey, ES- 2, OCC-1, A2780cp, A2780s) ble undersøkt for sekresjon av KLK 5, 6, 8, 10, 13 og 14 inn i kulturmedia ved hjelp av ELISA (tabell S1). På grunnlag av kallikrein ekspresjon, kunne cellelinjene bli separert i ikke-uttrykkere (SKOV-3, OVCA429, Hey, ES-2, OCC-1, A2780cp, A2780s) og uttrykkere (CAOV-3, OVCAR-3, OVCAR -4, OV2008, C13, OVCA433). I den sistnevnte gruppen, alle delte felles uttrykk for KLK5 /6, og fem av seks uttrykt KLK10, fire av seks KLK8, tre av seks KLK13 og ingen uttrykt KLK14. For å undersøke noen sammenheng mellom kallikrein uttrykk og aggressivitet av cellelinjene, ble disse to gruppene i forhold til deres evne til å invadere i matrigel, skjema kolonier i myk agar og utvikle svulster intraperitonealt i hårløse mus (data ikke vist). En løs korrelasjon ble observert, om enn med noen unntak, at i motsetning til de ikke-uttrykkere, cellene som uttrykker kallikreins ikke invadere matrigel, dannet ikke kolonier i myk agar, og som tidligere er rapportert av oss [39], var meget dårlig på å danne svulster i nakne mus (tabell 1).
Stabil overekspresjon av KLK 5, 6 og 10, alene eller i par, i kloner av kallikrein-manglende ES-2 cellelinje, resulterer i endret forankringsuavhengig vekst, men påvirker ikke celleproliferasjon eller invasive potensielle
KLK5, 6 og 10 var de mest uttrykt kallikreins i mindre aggressive eggstokkreft cellelinjer tyder på en sammenheng mellom uttrykket av disse kallikreins og tumorigen potensial. For å erte hverandre rollene til hver kallikrein og deres interaksjoner på tumourigenicity, ble ES-2 celler som ikke uttrykker noen av de testede kallikreins (tabell 1) stabilt transfektert med ekspresjonsvektorer for KLK5, 6, 10 alene eller i par. 3 eller flere kloner av KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10, 6/10 sammen med tomt plasmid kontroll og ikke-modifiserte ES-2-celler ble sammenlignet for forankrings-uavhengig vekst, proliferasjon og invasjon (fig. 1). Ekspresjon av KLK5, 5/6, 5/10, 6/10 og var tilstrekkelig til å redusere muligheten for ES-2-celler til å danne kolonier i myk agar i forhold til vektor-bare kontroll, men ikke forandre graden av spredning mer enn 96 timer, eller modulere evnen av klonene for å invadere i en transwell assay.
Tre eller flere kloner av ES-2-cellelinje som overuttrykker KLK5, 6 eller 10, eller par av KLK5 /6, KLK5 /10 og KLK6 /10 ble sammenlignet med foreldre ES-2 celler eller vektor transfektert kontroller
in vitro
for sin tumorigen potensial. A) Kloner ble dyrket i myk agar, og antall kolonier ble tellet, og er representert som prosentandel av celler som dannet kolonier. B) Klonene ble dyrket i 96 timer i serumholdig medium og celle tall ble talt. C) Klonale cellene resuspendert i serumfrie media ble avsatt i en innsats belagt med basalmembran ekstrakt og tillatt å invadere transwell bading i medium med 10% serum i 24 timer og migrerende celler ble kvantifisert. Resultatene er vist som gjennomsnittet av 3 eller flere kloner +/- SEM, og signifikans utledes ved en-veis ANOVA med etterprøve dersom p 0,05. Ulike små bokstaver over hver søyle angir statistisk signifikante forskjeller mellom verdier (p 0,05). I C, dataene er normalisert til foreldrekontroll.
Stabil overekspresjon av KLK 5, 6 og 10, alene eller i par, i kloner av kallikrein-mangel ES-2 cellelinje, resultater i endret overlevelse av en mus xenograft modell
for å undersøke om differensial kallikrein uttrykk kunne regulere aggressivitet eggstokkreft celler
in vivo
, ble en intra-peritoneal (IP) xenograft modell ansatt. For dette formål ES-2 ovarian cancer-cellelinje er ideell, fordi den ikke uttrykker kallikreins 5, 6 og 10 (tabell 1) og lett danner hurtig-progresjon tumorer IP i nakne mus som er ledsaget av ascites, således etterligne sykdomsprogresjon hos mennesker [39]. Kloner avledet fra denne cellelinje, stabilt sekresjon KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10 og 6/10 i kulturmediet sammen med de passende tom vektorkontroll (tabell 2) ble injisert IP i immunsvikt nu /nu-mus . Musene ble injisert med 10
7 celler av hver klon per dyr i grupper på åtte, som så ble blindet, og nøye overvåket for endepunkter. Median overlevelse tider for foreldre linjen var 16d, mens singelen uttrykker kontroll var 19.5d og dobbel uttrykker kontrollen var 15d. Overlevelsen av gruppen som uttrykker KLK5 (24.5d) var ikke forskjellig fra kontrollgruppen (fig. 2), mens overlevelse av gruppene som uttrykker KLK10 (32.5d), KLK5 /6 (25,5), KLK5 /10 (23,5), og KLK6 /10 (23,5) var betydelig lenger enn sine hensiktsmessige kontroller av logrank test (fig. 2). Survival of the gruppen overekspresjon KLK6 (15d) alene var betydelig kortere enn kontrollcellelinje, men ikke foreldrelinjen. Gruppene KLK5, KLK10, KLK5 /6 og KLK5 /10 hver hadde en sykdomsfrie overlevende mus, mens gruppe KLK6 /10 hadde to, ved å studere avslutning på dag 56, mens alle musene i kontrollgruppen utviklet sykdom.
a) kloner av ES-2 cellelinje overekspresjon KLK5, 6 eller 10 eller B) par av KLK5 /6, KLK5 /10 og KLK6 /10 ble injisert IP i nakne mus og overlevelse ble sammenlignet med kontroll mus xenopodet med de passende vektor ryggraden kloner. Resultatene er vist som en Kaplan-Meier plot, og signifikans ved anvendelse av en logrank test versus passende kontroll ble utledet ved p 0,05. * Betyr p 0,05, ** betyr p 0,01, og *** p. 0,001
Mus xenopodet med kallikrein-sekresjon svulster viser endringer i patofysiologien
For å klargjøre sammenhengen mellom KLK sekresjon og overlevelse, ble flere sykdomsrelaterte beregninger sammenlignet på tvers av alle grupper ved obduksjon (tabell 3). Den mest utbredte punktet var oppblåst mage (82%) som følge av ascites opphopning, etterfulgt av åndenød (8%) forårsaket av plevravæske, dehydrering og vekttap (7%), og til slutt nedsatt mobilitet (3%). Enkelte dyr ble ikke målt i endepunktet statistikk på grunn av fravær av sykdom ved studium terminering (N = 8), eller fordi de døde av sykdommen før den endpointed (N = 6). Tumor histologi, spre og områder av metastaser var lik blant grupper, med en preferanse for omentum, bukhinnen, pessar, reproduktive organer, lever og tarm. Både tumorbelastning og ascites volum ble registrert i dyr som har nådd endepunktet, og ikke-null verdier ble brukt til å beregne gjennomsnittet (tabell 3). Mean ascites volumet ikke skiller mellom grupper med unntak av kontroll-dobbel som utviklet seg forbi sine oppblåst endepunkt før de ble ofret på grunn av sin raske frekvensen av sykdomsprogresjon. En statistisk signifikant redusert insidens av ascites ved obduksjon ble observert i dyrene i grupper KLK5 /10 (p 0,01) og KLK6 /10 (p 0,01) med bare 37,5% forekomst frekvens sammenlignet med kontrollgrupper som alle utviklede ascites. Paradoksalt KLK6 /10 gruppen hadde også i gjennomsnitt en høyere tumorbelastning (p 0,01), sannsynligvis på grunn av lengre ascites overlevelse. Blant de dyrene som fikk utvikle ascites innenfor gruppene av KLK5, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, en signifikant lavere forekomst av flercellede frittflytende aggregater i ascites ble notert (tabell 3). Aggregatene som er tilstede i ascites var kompakte kuler av celler av ensartet størrelse (~ 1 mm
3) er synlig for det blotte øye. De kallikrein konsentrasjoner målt med ELISA i ascites viste nivåer av KLK6 (tabell 3) for å være sammenlignbare med nivåene i pasient ascites, mens nivåene av både KLK10 og KLK5 ble forhøyet i forhold til pasientprøver, særlig i kombinasjon grupper.
overlevelsestid for hver gruppe av mus kan deles inn i en periode forut for inntreden av symptomer, etterfulgt av en symptomatisk periode som munner ut ved endepunktet. Variasjon mellom grupper er allerede til stede når man ser på utbruddet av symptomene (tabell 3), kan tyder kallikreins påvirke tidlig sykdomsprogresjon. For å følge den tidlige utvikling av sykdommen, ble plasmakallikrein nivåer målt ved ELISA i hvert dyr hver uke og ved obduksjon, for å tjene som en surrogatmarkør for tumorbyrden. Kallikreins var påvises i plasma godt før utbruddet av de første symptomene i alle mus, noe som tyder på at asymptomatisk spor sykdom kan påvises ved å måle sirkulerende kallikreins.
