Abstract
Mål
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) tyrosinkinasehemmere (TKI) har vist dramatiske kliniske fordeler i avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC); imidlertid motstanden forblir et alvorlig problem i klinisk praksis. Denne studien analyserte mTOR-forbundet signale-pathway forskjeller mellom EGFR TKI-følsom og motstandsdyktig NSCLC cellelinjer og undersøkt muligheten for målretting mTOR med spesifikk mTOR-hemmer i EGFR-TKI motstandsdyktig NSCLC celler.
Metoder
Vi har valgt fire forskjellige typer EGFR TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler: PC9, PC9GR, H1650 og H1975 celler som modeller for å oppdage mTOR-forbundet signale-pathway forskjellene ved western blot og Immunpresipitasjon og evaluerte den antiproliferative effekt og cellesyklus arrest av ku-0063794 ved MTT metode og flowcytometri.
Resultater
i denne studien, observerte vi at mTORC2-forbundet Akt ser473-FOXO1 signalveien i en basal tilstand var svært aktivert i resistente celler.
In vitro
mTORC1 og mTORC2 kinase aktiviteter analyser viste at EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinjer hadde høyere mTORC2 kinase aktivitet, mens sensitive celler hadde høyere mTORC1 kinase aktivitet i basal staten. ATP-konkurrerende mTOR hemmer ku-0063794 viste dramatiske antiproliferative effekter og G1-cellesyklus arrest i både sensitive og resistente celler. Ku-0063794 på IC
50 konsentrasjon effektivt hemmet både mTOR og p70S6K fosforylering nivåer; den sistnevnte er en mTORC1 substrat og ikke oppregulere Akt ser473 fosforylering som vil bli indusert av rapamycin og resulterte i partiell hemming av FOXO1 fosforylering. Vi observerte også at EGFR TKI-sensitive og -resistente kliniske NSCLC vevsprøver hadde høyere total og fosforylerte p70S6K uttrykk nivåer.
Konklusjon
Våre resultater tyder mTORC2-assosiert signal-veien ble hyperactivated i EGFR TKI-resistente celler og målretting mTOR med spesifikke mTOR-hemmere er sannsynligvis en god strategi for pasienter med EGFR muterte NSCLC som utvikler EGFR-TKI motstand; de potensielle spesifikke roller mTORC2 i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler fortsatt var ukjent og bør undersøkes nærmere
Citation. Fei SJ, Zhang XC, Dong S, Cheng H, Zhang YF, Huang L, et al . (2013) Targeting mTOR å overvinne epidermal vekstfaktor reseptortyrosinkinasehemmer Resistance i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 8 (7): e69104. doi: 10,1371 /journal.pone.0069104
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 14 februar 2013; Godkjent: 05.06.2013; Publisert: 16.07.2013
Copyright: © 2013 Fei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddene fra Natural Science Foundation National of China (nr 30772531 og nr 81071699, www.nsfc.gov.cn), Guangdong sosial utvikling av vitenskap og teknologi planlegge prosjekter (No: 2011A030400010, www.gdstc.gov .cn /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne fikk Gefitinib fra Astrazeneca for in vitro eksperimenter i laboratoriet sitt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signalveien spiller en sentral rolle i utviklingen og progresjon av lungekreft [1]. EGFR tyrosinkinasehemmere (TKI) gefitinib og erlotinib er effektive kliniske behandlinger for pasienter med avansert NSCLC som har EGFR-aktivert mutasjoner, sammenlignet med standard førstelinje cytostatika [2] – [4]. Men til tross for disse dramatiske fordelene av EGFR TKI, alle disse pasientene uunngåelig utvikle resistens mot gefitinib og erlotinib, vanligvis 6-12 måneder etter oppstart av TKI behandling [5]. Flere mekanismer, inkludert en T790M mutasjon i EGFR, MET forsterkning, og overekspresjon av hepatocytter vekstfaktor (HGF), indusere ervervet resistens mot reversible EGFR-TKI for NSCLC med EGFR-aktive mutasjoner [6] – [8]. En måte å overvinne TKI motstand er fortsatt en utfordring i klinisk praksis. Vanligvis strategier for å overvinne motstanden vurdere motstanden mekanismen i seg selv [7], [9], [10], mens en alternativ strategi er å identifisere nye molekyler eller mekanismer som overvinne motstanden, slik som mTOR.
mTOR er et konservert serin /treonin-kinase som forekommer i mTORC1 og mTORC2 komplekser [11]. Den integrerer signaler fra vekstfaktorer, næringstilgang og energistatus for å aktivere cellevekst, og er oppregulert i ulike kreft [12]. Derfor har studier rettet mot mTOR for kreftbehandling fått oppmerksomhet de siste årene. Imidlertid har klinisk respons på rapamycin og dets analoger vært svak [13]. Mange studier har vist mekanismene for sin dårlig respons både
in vitro
og
in vivo product: [14] – [16]. Vår forrige rapport viste også at alle NSCLC cellelinjer i vårt laboratorium er resistente mot RAD001 (en rapamycin analog) [17]. Faktisk, rapamycin bare delvis hemmer mTORC1 funksjoner, og i stedet indusere Akt ser473 fosforylering [16], og inhiberer ikke i det hele tatt mTORC2 [18]. Nyere studier har indikert at mTORC2 regulerer celle overlevelse og cytoskeletal organisasjon ved å regulere fosforylering av sine underlag, Akt hydrofobe motiv (HM) nettsted (ser473) og PKCα HM hotellet (ser657) [19], [20]. mTORC2 kinase aktiviteten øker i enkelte svulster; Således kunne målretting mTORC2 hemme kreftcellevekst og proliferasjon [21] – [23]. Derfor hypotese vi at mTORC2 spiller en viktig rolle i cellevekst og spredning, og at målretting mTOR med spesifikke mTOR-hemmere vil gi bedre anti-tumor effekter etter TKI-ervervet resistens.
Vi først analysert forskjeller i mTOR- tilhørende signalveier mellom EGFR TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler i en basal tilstand
in vitro
. Da vi analyserte mTORC1 og mTORC2 kinase aktivitet
in vitro
. Til slutt, vurderte vi antiproliferative effekter og cellesyklus arrest av ku-0063794 og analysert uttrykk for total og fosforylert p70S6K i vevsprøver.
Materialer og Metoder
Antistoffer og Regents
Ku-0063794 (Tocris, Minneapolis, Minnesota, USA) og ren gefitinib, vennlig levert av Astrazeneca, ble utarbeidet i DMSO og fortynnet med dyrkingsmedium før bruk. mTOR (# 2983), p-mTOR (# 2971), Rictor (# 2114 og # 5379), Raptor (# 2280 og # 5382), Akt (# 9272), p-Akt ser473 (# 4060), p-p70S6K (# 9208), p-4EBP1 (# 9459), FOXO1 (# 2880) og p-FOXO1 (# 9461) antistoffer for western blot og immunoprecipitation ble alle kjøpt fra CST (Beverly, MA, USA). p70S6K (# ab47504) og p-p70S6K (# ab60947) antistoffer for western blot og immunhistokjemi ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Inaktiv akt1 /PKB1 (# 14-279) og 4E-BP1 (# 10022-H07E) ble kjøpt fra Millipore (Bedford, MA, USA) og Sino Biological (Beijing, Kina), henholdsvis.
Cellelinjer
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer PC9, H1650 og H1975 (ATCC, Manassas, VA, USA) ble vennlig levert av Dr. Tony Mok, Chinese University of Hong Kong. PC9 celler havn en EGFR ekson 19-frame sletting og er svært følsomme for EGFR-TKI. H1650 celler havn en EGFR ekson 19-frame sletting og er motstandsdyktig mot EGFR-TKI. H1975 celler bære EGFR L858R-T790M mutasjon og er motstandsdyktig mot EGFR-TKI. PC9GR ervervet gefitinib motstand ved kronisk eksponering av PC9 celler til medium med økende gefitinib konsentrasjoner. Kort sagt ble PC9 cellene eksponert for 10 nM gefitinib i medium inneholdende 10% FBS, og konsentrasjonen ble øket på en trinnvis måte. Celler som var i stand til å vokse i 1 mikrometer gefitinib ble oppnådd 6 måneder etter første eksponering.
Western Blot analyse
Cellene ble dyrket i 25 cm
2 kulturflasker uten noen medikamenter og høstet i log-vekstfase for protein utvinning. Celler ble lysert i RIPA-lyseringsbuffer inneholdende 1 x PMSF og 1 x fosfatase-inhibitor cocktail. Proteinkonsentrasjonen av hvert lysat ble bestemt ved å bruke bicinchoninic syre analysen. Prøvene ble underkastet SDS-PAGE. Proteiner ble påvist ved hjelp av den forbedrede chemiluminescence kit (Thermo, Rockford, IL, USA).
For kvantifisering av protein nivåer ble filmer skannet og analysert med labwork programvare. De relative proteinnivåer ble telt ved bruk av en sammenligning med PC9 celle.
Immunoutfelling og kinasebestemmelser
celler i log-vekstfase ble lysert i 0,5 ml iskald lyseringsbuffer (40 mM Hepes pH 7,5, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 x fosfatase-inhibitor cocktail, 1 x EDTA-fri protease inhibitor cocktail inneholdende 0,3% [w /v] CHAPS) [24]. Supernatanten ble overført til et nytt rør. En 10 ul aliquot av immobilisert perle-konjugatet med det angitte antistoff ble tilsatt og inkubert under rotasjon i 90 minutter ved romtemperatur. Immunopresipitater ble vasket fire ganger med CHAPS lyseringsbuffer og en gang med den Rictor-mTOR-kinase-buffer (25 mM Hepes pH 7,5, 100 mM kaliumacetat, 1 mM MgCl
2). Immunopresipitater ble inkubert i et endelig volum på 15 ul i 20 minutter ved 37 ° C i Rictor-mTOR-kinase-buffer inneholdende 500 ng inaktivt akt1 /PKB1 eller 4E-BP1 i nærvær av ATP for kinasereaksjonen. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 200 ul iskald enzymfortynningsbuffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,01% [vekt /volum] Brij 35, 5% glycerol, 0,1% 2-merkaptoetanol, og 1 mg /ml BSA). Etter en kort sentrifugering ble supernatanten fjernet fra Sepharose vulsten konjugat og analysert ved immunblotting. Immunpresipitatene var denaturert og løses ved hjelp av SDS-PAGE, og gelen ble farget med en sølvfarging kit.
Evaluering av Antlproliferative Effects
Celleviabilitet ble bestemt via MTT analysen, i samsvar med fremgangsmåten ifølge Mosmann og Carmichael [25], [26], og linearitet mellom celletall og optisk tetthetsverdier ble fastslått. Den antiproliferative aktivitet av enkelt-middel behandling ble vurdert i enkelt monolag med celler dyrket i 96-brønners plater. Antall celler per brønn var 2000 PC9, 2000 PC9GR, 1200 H1650, og 3000 H1975 celler. IC
50 verdien var den konsentrasjon som resulterer i 50% inhibering av celleveksten etter en 72-timers eksponering for medikamentet, sammenlignet med den i ubehandlede kontrollceller.
flowcytometrisk analyse av Cell Cycle Distribution
Celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
5 per brønn og igjen å stå over natten. Da celler ble behandlet i 72 timer med ku-0063794 ved IC
50 konsentrasjon. Cellene ble trypsinert, tellet, vasket og resuspendert. Cellene ble deretter pelletert og festet ved dråpevis tilsetning av 70% iskald etanol, som er lagret i PBS, og deretter resuspendert i propidiumjodid oppløsning (180 pg /ml) og analysert ved hjelp av strømningscytometri.
pasienter med NSCLC
vevsprøver fra gefitinib eller erlotinib-behandlede pasienter ble hentet fra Guangdong General Hospital (Guangzhou, Kina). Studien ble godkjent av etisk komité i Guangdong General Hospital. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke. Nærværet av EGFR mutasjon i hver prøve ble bekreftet ved exon-spesifikke amplifiseringsprodukter (eksoner 18-21), etterfulgt av direkte sekvensering eller Scorpion forsterker ildfaste mutasjon system [27]. MET forsterkning ble analysert ved kvantitativ relativ sanntid polymerase chain reaction [28].
p70S6K Immunohistochemistry
Immunhistokjemi for total og fosforylert p70S6K ble utført på positivt ladede glass som inneholder 5-mikrometer deler av formalinfiksert, parafininnebygd vev. Lysbilder ble deparaffinized, etterfulgt av rehydrering med serielt avtagende etanolkonsentrasjoner, og deretter nedsenket i 3% H
2o
2 for å hemme endogen peroksidase aktivitet. Etter antigen gjenfinning i 1 mM EDTA-buffer, pH 8,0, ble vevssnittene inkubert med blokkeringsbuffer (TBST /5% normalt geiteserum) i 1 time ved romtemperatur. Seksjonene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff fortynnet 1:100 i antistoff-fortynningsmiddel. Envision Detection System ble brukt for visualisering, i henhold til produsentens instruksjoner. Seksjoner ble kontra med Harris hematoxylin, dehydrert, og montert permanent.
Evaluering av immunhistokjemisk farging
Alle lysbildene ble evaluert uavhengig av to patologer som var blindet for sakene. Saker med flekker i 10% av cellene ble vurdert positivt. Immunhistokjemiske reaktivitet ble gradert på en skala fra 0-3 i henhold til fargeintensitet og prosentandelen av immunopositive celler som følger: 0 = ingen farging; 10% positive celler; 1, svak farging i 10% av tumorceller eller moderat farging i 10-40% av tumorceller; 2, moderat farging i 40% av tumorceller eller sterk farging i 10-40% av tumorceller; 3 sterk farging i 40% av kreftceller [29]
statistikker
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil på minst tre eksperimenter
Resultater..
Akt ser473-FOXO1 signalveien i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler ble høyt aktivert i Basal State
Forstå mTOR-forbundet signale-pathway forskjeller mellom EGFR TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler er avgjørende for målretting mTOR å overvinne pasientens motstand etter TKI behandling. Imidlertid er kjennskap til forskjellene i signalveiene mellom EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC-celler mangler. Her har vi først valgt ut fire forskjellige NSCLC cellelinjer som havn ulike EGFR mutanter, og at ulik følsomhet for TKI, som cellemodeller for analyse av signal-pathway forskjeller i en basal tilstand av western blot. Som vist på fig. 1, er den totale og fosforylerte mTOR, Raptor, og Rictor proteiner hadde høyere basal uttrykk nivåer i alle fire NSCLC-cellelinjer. Da vi har oppdaget forskjeller i mTORC2-assosierte signalveien ved å bestemme fosforylering status for Akt ser473 og FOXO1. Interessant, fant vi at EGFR-TKI-resistente cellelinjer spesielt H1650 celler (husing EGFR sletting i 19 ekson og motstandsdyktig mot TKI) hadde høyere p-Akt ser473 nivåer enn gjorde TKI-sensitive celler (PC9 celler) og p-Akt ser473 uttrykk nivå i PC9GR-celler (gefitinib-ervervet resistent cellelinje) var også ganske høy. Dette resultatet var forenlig med en rapport som PC9GR celler har redusert fosfatase og tensin homolog uttrykk, noe som førte til oppregulering av p-Akt ser473 nivåer [30]. FOXO1 fosforylering status, noe som er positivt regulert av Akt HM området (ser473) fosforylering status og inhiberer celle apoptose [31], var nesten i samsvar med p-Akt ser473 nivåer i de fire cellelinjer. Vi har også oppdaget at ekspresjonen av fosforylert og total p70S6K som er substratet for mTORC1 og funnet at alle de fire cellelinjene hadde høyere p70S6K fosforylering nivåer. Til sammen våre data tydet på at EGFR muterte NSCLC cellene hadde høyere basal uttrykk nivåer av mTOR, Rictor og Raptor og mTORC2-assosiert Akt ser473-FOXO1 signalveien ble hyperactivated i resistente celler.
Cellene ble dyrket i fullstendig media uten medikamentell behandling. Proteiner ble ekstrahert fra celler i log-vekstfase, og cellelysater ble immunoblottet for å påvise de angitte proteiner. Eksperimentet, gjentatt tre ganger, ga lignende resultater.
EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinjer hadde Høyere mTORC2 Kinase aktivitet, mens sensitive celler hadde Høyere mTORC1 kinase aktivitet i Basal State
Basert på de ovenfor angitte resultater, hypotese vi at EGFR-TKI-sensitive og -resistente celler har forskjellig mTORC2 kinaseaktivitet. Vi har analysert deretter mTORC2 kinase-aktivitet i de fire NSCLC-cellelinjer ved immunutfelling. Først brukte vi den spesifikke Rictor antistoff til å trekke ned mTORC2 inn immunpresipitatet. SDS-PAGE sølvfarging (fig. 2A) viste at immunoutfellinger var vellykket, som også ble kontrollert ved western blot av immunopresipitatene (fig. S1). Akt ser473 var en av de identifiserte substrater av mTORC2 og flere aviser brukte det som et surrogat for å representere mTORC2 aktivitet [21], [24]. Så, vi brukte den inaktive rekombinante protein, akt1 /PKBα, som et substrat for å reagere med immunpresipitatet
in vitro
, og deretter detektert p-Akt ser473. Som vist på fig. 2B, selv om cellelysat proteinkonsentrasjonen i H1650 celle immunpresipitatet var lavere enn for de andre tre cellelinjer, mTORC2 kinaseaktivitet var høyest. Fra fig. 2B, vi kunne også se at mTORC2 kinase aktivitet i PC9 celler var lavest, og at det i PC9GR og H1975 cellene hadde mellom kinase aktivitet. Disse resultatene var nesten i samsvar med den p-Akt ser473 nivåer som er nevnt ovenfor. Vi oppdaget også mTORC1 kinase aktivitet
in vitro
å sammenligne forskjellene mellom mTORC2 og mTORC1 kinase aktiviteter i EGFR-TKI-sensitive og resistente NSCLC celler. Fig. 2C viste at vi også lykkes trukket ned mTORC1. Som vist på fig. 2D, selv om proteinkonsentrasjonen i PC9 celle immunpresipitatet var lavere enn i de andre tre celler, mTORC1 kinaseaktivitet var høyest. mTORC1 kinase aktiviteten var lavest i H1650 og H1975 celler. Fra fig. 2B og 2D, kan vi også se at i de samme cellene når mTORC2 kinase aktivitet ble oppregulert i mTORC1 kinase aktiviteten ville bli nedregulert indikerer at om mTORC1 og mTORC2 eksistere i dynamisk likevekt. Til sammen våre resultater viste at selv om både EGFR TKI-sensitive og -resistente NSCLC cellene hadde høyere mTORC1 og mTORC2 uttrykk i basal staten, EGFR-TKI-resistente celler hadde høyere mTORC2 kinase aktivitet, mens EGFR-TKI-sensitive celler hadde høyere mTORC1 kinase aktivitet.
(A, C) SDS-PAGE protein sølvfarging av mTORC2 og mTORC1 immunpresipitatene fremstilt fra PC9 cellelysater med Rictor (D16H9) Rabbit mAb (sefarosekule konjugat) (# 5379) og Raptor (24C12 ) Rabbit mAb (sefarosekule konjugat) (# 5382) kjøpt fra CST, henholdsvis. (B, D) Den første kolonnen representerer Rictor og Raptor proteinkonsentrasjoner, henholdsvis i cellelysatene. De relative proteinnivåer telles ved hjelp av en sammenligning med PC9 celle som er definert som 1,00. Immunopresipitatene ble anvendt i kinasebestemmelser med full-lengde, villtype rekombinant human akt1 /PKB1 og 4E-BP1 som substrater. Immunoblotting ble anvendt til å påvise Akt /PKB fosforylering ved ser 473 og 4E-BP1 på thr 37/46, respektivt. Forholdet verdier av p-Akt ser473 /t-Rictor og p-4EBP1 /t-Raptor representerer kinase aktivitet mTORC2 og mTORC1 hhv. Eksperimentet, gjentatt tre ganger, ga lignende resultater.
Ku-0063794 hemmet Cell Proliferation og resulterte i G1 cellesyklus arrest i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC Cells
Selektiv mTOR-inhibitorer, slik som ku-0063794, hemmer både mTORC1 og mTORC2 i forskjellige cellelinjer [32]. I denne studien, vurdert vi de antiproliferative virkningene av ku-0063794 i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC-celler sammenlignet med de av gefitinib som tidligere er rapportert i vårt laboratorium [17], [33]. Data indikerte dose-respons veksthemming virkninger i PC9, PC9GR, H1650 og H1975 celler. Tabell 1 og fig. 3A viste at ku-0063794 hemmet celleproliferasjon i både EGFR TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler ved nanomolar (nM) konsentrasjoner, mens gefitinib hemmet bare PC9 celler på nM konsentrasjoner. Større gefitinib konsentrasjoner (mm) var nødvendig for å nå IC
50 verdi i EGFR-TKI-resistente celler, som i stor grad overstiger de maksimale plasmakonsentrasjoner hos pasienter [34]. Vi vurderte også cellesyklusen etter behandling med ku-0063794 ved IC
50 nivå av flowcytometri og fant ut at alle de fire cellelinjer ble blokkert i G1 fasen etter en 72-timers ku-0063794 behandling, spesielt PC9 og PC9GR celler , sammenlignet med den i kontrollceller uten noen behandling (fig. 3B).
(A) Inhibering effektiviteten av ku-0063794 i de fire NSCLC-cellelinjer. (B) Ku-0063794 indusert cellesyklus arrest i både EGFR TKI-sensitive og -resistente celler. Det øvre panel representerer basalcellesyklus fordelinger av den PC9, PC9GR, H1650 og H1975 cellelinjer, henholdsvis, og det nedre panel representerer de cellesyklus fordelinger av PC9, PC9GR, H1650 og H1975-celler etter behandling med IC
50 konsentrasjoner av ku-0063794 for 72 timer.
Fordi ku-0063794 utstilt dramatiske antitumor effekter, vi analyserte sin antiproliferativ aktivitet på IC
50 konsentrasjon av western blot videre. Først må vi har oppdaget mTOR-fosforylering status etter behandling med ku-0063794 på IC
50 konsentrasjoner i alle fire cellelinjer, henholdsvis (fig. 4A). Da videre analysert vi fosforylering status av mTOR signalveien assosierte proteiner (Fig. 4A). Gjennom proteinet kvantitative labwork programvare, analyserte vi forholdet mellom fosforylert protein i løpet av totalt protein i den basale tilstand og etter behandling med ku-0063794 på IC
50 konsentrasjoner i alle fire cellelinjer (Fig. 4B). Som vist på fig. 4A og 4B, ku-0063794 effektivt inhiberte mTOR fosforylering status og deretter sterkt hemmet fosforylering av p70S6K som er et substrat for mTORC1. Fra fig. 4B, vi kunne også se at ku-0063794 på IC
50 konsentrasjoner ikke stiger markert p-Akt ser473 uttrykk spesielt i PC9 og PC9GR celler som kan bli indusert av rapamycin [16]. Egentlig forholdene mellom p-Akt ser473 /t-Akt i H1650 og H1975-celler ble redusert som resulterer i lavere prosenter av p-FOXO1 /t-FOXO1 i disse cellene i forhold til den i den basale tilstand. Dermed ku-0063794, som en roman ATP konkurranse mTOR-hemmer, viste merkede antiproliferative effekter og indusert G1 cellesyklus arrest både i EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler
in vitro
.
(A) Cellene ble behandlet i 72 timer med ku-0063794 på IC
50 konsentrasjoner, og cellelysater ble immunoblottet for å påvise de angitte proteiner. Forsøket, gjentatt tre ganger, ga lignende resultater. (B) Forholdet mellom mTOR signalveien forbundet fosforylerte proteiner enn total proteiner i basal staten og etter behandling med ku-0063794 på IC
50 konsentrasjoner i alle fire cellelinjer.
Analyser of Clinical EGFR TKI-følsom og motstandsdyktig Lung Adenocarcinoma Vev viste høyere Total og Fosforylert p70S6K Expression i både følsom og Resistente Kreft
Siden ku-0063794 på IC
50 konsentrasjon effektivt hemmet p70S6K fosforylering nivåer i både sensitive og resistente NSCLC-celler, disse resultatene indikerte at ku-0063794 kan utøve større antitumoreffekter i tumorer som uttrykker høye nivåer av total eller fosforylert p70S6K. Vi undersøkte vevsprøver fra gefitinib- eller erlotinib-behandlede pasienter med EGFR-mutant NSCLC (Fig. 5). Alle pasientene hadde en delvis klinisk tumor respons på gefitinib eller erlotinib behandling og senere utviklet kliniske legemiddelresistens. Vi evaluerte uttrykk for total og fosforylert p70S6K i fem pasienter ved immunhistokjemi; ett med parvise prøver innhentet før og etter geftinib behandling, to med narkotika-sensitive prøver, og to med multiresistent prøver. Vi oppdaget status for T790M mutasjon og MET forsterkning i alle resistente prøver. Både narkotika-sensitive og resistente vevsprøver hadde høyere total p70S6K uttrykk (Fig. 5B og 5C). Vi har også funnet høyere fosforylert p70S6K uttrykk i disse svulstene. Disse funnene tyder på at både narkotika-sensitive og -resistente kreft hadde høyere total og fosforylert p70S6K uttrykk, og at p70S6K kan være en god prediktor for en respons på ku-0063794.
(A) Oppsummering av svulstene i gefitinib og erlotinib-behandlede pasienter, inkludert tre narkotika-sensitive og -resistente tilfeller, henholdsvis. Sak 3 var en paret prøve før og etter TKI behandling. ADC representerer adenokarsinom. (B) Uttrykk for total og fosforylert p70S6K i EGFR-TKI-sensitive saker. Den øvre panel representerer total p70S6K, og den nedre platen representerer fosforylert p70S6K. (C) Uttrykk for total og fosforylert p70S6K i EGFR-TKI-resistente tilfeller. Den øvre panel representerer total p70S6K, og den nedre platen representerer fosforylert p70S6K. ADC representerer adenokarsinom; S og R representerer følsom sak og bestandig tilfelle hhv. Skala barer, 50 mikrometer.
Diskusjoner
EGFR-signalveier er involvert i utvikling og progresjon av lungekreft. Binding av EGFR til sin EGF ligand fører til dimerisering og initierer en rekke nedstrøms signal kaskader gjennom PI3K-Akt-mTORC1, Erk, og Stat3 trasé [35]. Tidligere studier har vist at signaleringsmønstrene aktiveres av EGFR-mutanter skiller seg fra ligand-aktiverte villtype EGFR, og at EGFR-sensitive mutanter som følge av EGFR-signalisering konstitutivt aktivere og unngå negativ regulering [36] – [39]. EGFR-sensitive mutasjoner ble den helbredende effekten prediktorer for TKI, og de dramatiske kliniske fordelene med TKI er i stor grad basert på en dyp forståelse av EGFR-sensitive mutante signalveier. Derfor forstå endringer i signalveier etter pasienter utvikler resistens mot EGFR TKI er ganske viktig å overvinne motstand. Flere TKI resistensmekanismer har blitt vist i de siste årene, blant annet T790M mutant [40], MET forsterkning [7], og HGF overekspresjon [8]. De fleste aktuelle strategier for å overvinne TKI-ervervet resistens involverer rettet mot motstanden mekanismen selv. For eksempel, den andre generasjonen av irreversible TKI som BIBW 2992 for pasienter med en T790M mutasjon og MET-hemmere i kombinasjon med EGFR TKI for MET forsterkning [7], [9] – [10]. Her har vi gitt et nytt perspektiv for å søke nye molekylære mål for å overvinne motstanden ved systematisk å analysere signalveien forskjeller mellom EGFR TKI-sensitive og -resistente NSCLC celler
in vitro
. Våre data viste at mTORC2-forbundet Akt ser473-FOXO1 signalveien ble sterkt aktivert i EGFR-TKI-resistente NSCLC cellene i basal staten og
in vitro
mTORC1 og mTORC2 kinase aktiviteter bekreftet disse resultatene. (Fig. 1 og 2). Disse resultatene indikerer at målretting mTOR inkludert mTORC2 kunne oppnå bedre antitumoreffekter
mTOR er en sentral styreenhet av cellevekst, proliferasjon, metabolisme, og angiogenese.; imidlertid gjeldende mTOR inhibitorer, slik som RAD001, viser bare beskjeden klinisk aktivitet mot forbehandlet NSCLC [14]. Faktisk, rapamycin målrettet bare en undergruppe av de intracellulære aktiviteter mTORC1. Rapamycin hemmer allosterisk mTORC1 kinase-aktivitet ved å binde FKBP12 cellulært protein distalt til den aktive sete-kinase [15]. I noen tilfeller er mTORC1 følsom for rapamycin og helt hemmer mTORC1-mediert S6K1 fosforylering. Som rapportert tidligere, induserer rapamycin Akt ser473 fosforylering som reduserer dens antitumor effekt gjennom Akt ser473-FOXO1 signalveien på grunn av lindring av tilbakemeldinger fra S6K-IRS-PI3K signale [16], [41]. Egentlig er Akt thr308 fosforylering positivt regulert av PI3K-PDK1 og Akt ser473 fosforylering er positivt kontrollert av mTORC2 [20], noe som tyder på at om hemming av mTORC1 ville fremme mTORC2 kinase aktivitet. Våre data tyder på en dynamisk balanse mellom mTORC1 og mTORC2 som bør ytterligere bekreftet i løpet av de neste studiene (Fig. 2B og 2D) og forklar hvorfor RAD001 medierte effekter er svak i alle NSCLC cellelinjer
in vitro
. Resultatene tyder på at både mTORC1 og mTORC2 bør være målrettet.
De nye ATP-konkurrerende mTOR-hemmere (
e
.
g
., Torin1, PP242, ku-0063794 og WAY-600), som hemmer både mTORC1 og mTORC2, utøve markerte effekter på proteinsyntese, cellevekst og celledeling, og sterkt fremme autofagi i ulike kreftcelletyper
in vitro product: [32], [ ,,,0],42]. Disse mTOR-hemmere er fortsatt i en tidlig fase av evalueringen; dermed fortsatt usikker deres terapeutiske potensialet for kreft. Faktisk nye mTOR-inhibitorer, slik som Torin1 og PP242, ha antiproliferative virkninger som medieres primært ved fullstendig inhibering av mTORC1, men ikke mTORC2 [43], [44]. Vår forrige papir og papir fra La Monica har begge vist at EGFR-TKI-resistente NSCLC celler var ufølsomt overfor everolimus (RAD001), og everolimus kan synergize med gefitinib som ga et annet alternativ strategi for å overvinne EGFR-TKI motstand [17], [45] . I vår studie fant vi at målretting mTOR med ku-0063794 også produsert bedre antitumor effekt og redusert G1 cellesyklus arrest i både sensitive og resistente celler gjennom MTT analyse og flowcytometri analyse som bør styrkes ytterligere av kolonidannelse kapasitet (CFC) analyser i fremtiden; Vi fant ikke signifikant G1-cellesyklus arrest selv celleproliferasjon ble hemmet i H1975 celler ved ku-0063794 som kanskje først og fremst på grunn av andre former for celledød som apoptose eller autofagi. Indikatorer av apoptose og /eller autofagi vil undersøkes nærmere i fremtiden (figur 3B.); følgende antiproliferative virkningene av målretting mTOR indikerte at ku-0063794 ikke bare hemmet p70S6K fosforylering nivåer, men også delvis hemmet FOXO1 fosforylering nivåer og ikke oppregulere Akt ser473 fosforylering nivåer (Fig. 4). Til sammen våre data og de fra en tidligere rapport [46] tyder på at mangelen på en økning i Akt ser473 fosforylering nivåer kan ha vært på grunn av hemming av mTORC2; dermed fremme antitumor effekt. Egentlig de potensielle spesifikke roller mTORC2 i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler fortsatt var ukjent og bør videre studert i løpet av de neste studiene. I tillegg fant vi at EGFR-TKI-resistente celler hadde høyere Akt ser473 fosforylering. Som rapportert tidligere, har Akt inhibitor perifosine vist bedre antiproliferative effekter i residiverende /Ildfast Walden makroglobulinemi [47] og Jeong et al rapporterte også at Akt inhibitor og mTORC1 inhibitor synergi økt celledød hos NSCLC celler [48]. Alle disse tyder på at Akt hemmere kan være et annet godt alternativ behandling for TKI ufølsomme svulster.
