Abstract
Bakgrunn
Nesten 20% av kreft hos mennesker over hele verden har en infeksiøs etiologi med de mest fremstående eksempler er hepatitt B og C-virus-assosierte leverkreft og human papilloma virus-assosiert cervikal cancer. Det er et presserende behov for å finne nye tilnærminger til behandling og forebygging av virus-assosiert kreft.
metodikk /hovedfunnene
virale antigener ikke tidligere har vært ansett som mål for behandling eller forebygging av virus -associated kreft. Vi antok at det var mulig å behandle eksperimentelle HPV16-assosiert cervikal cancer (CC) og hepatitt B-assosiert hepatocellulært karsinom (HCC) ved å målrette mot virale antigener uttrykt på kreftceller med radiomerkede antistoffer mot virusantigener. Behandling av eksperimentell CC og HCC tumorer med
188Re-merket mAb til E6 og HBX virale proteiner, henholdsvis, resulterte i signifikant og doseavhengig forsinkelse av tumorvekst i sammenligning med ubehandlede mus eller mus behandlet med umerkede antistoffer.
Konklusjon /Betydning
Denne strategien er fundamentalt forskjellig fra tidligere bruk av radioimmunterapi i onkologi, som målrettet tumor-assosiert humane antigener og løfter økt spesifisitet og minimal toksisitet av behandlingen. Det reiser også en spennende mulighet til å hindre virus-assosiert kreft i kronisk infiserte pasienter ved å eliminere celler infisert med onkogene virus før de forvandle seg til kreft
Citation. Wang XG, Revskaya E, Bryan RA, Strickler HD, Burk RD, Casadevall A, et al. (2007) Behandling av kreft som en infeksjonssykdom-virale antigener som Novel Mål for behandling og potensial Forebygging av svulster i Viral etiologi. PLoS ONE 2 (10): E1114. doi: 10,1371 /journal.pone.0001114
Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 5 oktober 2007; Akseptert: 10. oktober, 2007; Publisert: 31 oktober 2007
Copyright: © 2007 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. E. Dadachova støttes av NIH bevilgning AI60507; A. Casadevall – ved NIH tilskudd AI33774, AI33142, AI52733, HL59842, og U54 AI157158; R. D. Burk av NIH stipend CA078527. Dette arbeidet ble støttet delvis av Albert Einstein College of Medicine Comprehensive Cancer Center og Center for AIDS forskning ved Albert Einstein College of Medicine og Montefiore Medical Center finansiert av National Institutes of Health (NIH AI-51519).
Konkurrerende interesser: patentsøknad for denne teknologien har blitt arkivert med amerikanske PTO
Innledning
Det har blitt anslått at nesten 20% av kreft hos mennesker over hele verden har en smittende etiologi [1]. De fleste av disse svulstene er av viral opprinnelse, og inkluderer fast etablerte sammenslutninger av hepatitt B-virus (HBV) og hepatitt C-virus (HCV) med leverkreft; og av humane papillomavirus (HPV) -med kreft i livmorhalsen, anus, vulva, vagina; samt sammenslutninger av oropharynx Epstein-Barr virus (EBV) med lymfom og nasofaryngeal karsinom; human T lymfotropt virus type 1 (HTLV-1) -med voksen T-celle leukemi /lymfom, og human herpes virus 8 (HHV-8) -med Kaposis sarkom [2] – [7]. I kombinasjon, disse virus-assosiert svulster representerer en byrde på ca 1,3 millioner tilfeller av kreft hvert år, med HBV /HCV-forbundet leverkreft regnskap for 523,000 tilfeller, og HPV-assosiert svulster regnskap for 561,000 tilfeller [8]. Behovet for å finne nye metoder for behandling og forebygging av virusassosierte kreftformer er åpenbare og presserende.
radioimmunterapi (RIT) benytter antigen-antistoffbinding til å avlevere cytotoksiske doser av partikkelstråling til tumorceller [9], [10]. RIT, for eksempel, har blitt brukt til å behandle ildfast og tilbakevendende lymfomer, med to radiomerkede monoklonale antistoffer (mAb) rettet mot CD20 (Zevalin® og Bexxar®) etter å ha fått FDA-godkjenning for dette formål. Det er sannsynlig, faktisk, at RIT blir en første linje behandling av follikulære lymfomer [11]. Denne «tradisjonelle» kreft RIT er rettet mot «selv» antigener. Nylig demonstrerte vi at RIT har også bred potensiale for behandling av fungale og bakterielle infeksjoner ved målretting av mikrobielle antigener med radiomerkede mAb i eksperimentelle modeller fra sopp- og bakterieinfeksjoner [12], [gjennomgått i 13]. I tillegg har vi funnet at HIV-1-infiserte celler kan elimineres in vitro og in vivo ved å målrette gp120 og gp41 virale glykoproteiner uttrykt på overflaten av infiserte celler med radiomerkede virale protein-spesifikke mAbs [14].
Vi antok at RIT rettet mot virale antigener kan benyttes i behandlingen av et bredt spekter av virale infeksjonssykdommer og virus-assosierte tumorer [15], [16]. Mange virus-assosiert kreft uttrykke virale antigener enten internt eller på deres overflater. Det er viktig å merke seg at selv virale antigener uttrykt intracellulært er potensielle mål for RIT, siden tumor cellefornyelsen vil sannsynligvis resultere i frigjøring av disse proteinene inn i mellomrommet av svulsten. Denne tilnærmingen er fundamentalt forskjellig fra de tidligere beskrevne anvendelser av RIT som er rettet mot tumorassosierte antigener som er «selv» (dvs. menneske) proteiner. Ved å målrette viral og ikke «selv» proteiner, er det å håpe at radiomerkede mAbs kan være mer spesifikt konsentrert innenfor svulstvev, noe som resulterer i større effekt og mindre toksisitet. Her beskriver vi proof-of-prinsippet eksperimenter som tar sikte på å demonstrere gjennomførbarheten av å behandle eksperimentell HPV16-forbundet livmorhalskreft (CC) og hepatitt B-forbundet leverkreft (HCC) ved å målrette virale antigener uttrykt på kreftceller med radiomerkede antistoffer mot virale antigener .
Resultater
Valg av en cellelinje-antigen kombinasjon for å fungere som en eksperimentell livmorhalskreft (CC) modell
for å vurdere potensialet i RIT å målrette virale antigener i kreft i viral etiologi, trengte for å identifisere tumorcellelinjer som uttrykte målantigenet, og kan også bli implantert i nakne mus. Vi valgte HPV16 og HPV18 cellelinjer, siden disse to HPV-typene står for ca 70% av livmorhalskreft og en betydelig andel av hode og nakke svulster [17], [18]. E6- og E7-oncoproteiner ble ansett som de beste potensielle antigene mål, ettersom disse proteiner er uttrykt i det vesentlige alle cervikale kreftceller, mens andre virale gener kan gå tapt. Mutasjonsanalyse har vist at E6 og E7 virale oncoproteiner er nødvendig og tilstrekkelig for immortalisering av humane celler med HPV. Derfor har vi vurdert av Western blot uttrykk for E6 og E7 i tre menneskelige livmorhalskreft cellelinjer-HPV16-positive CasKi og Siha cellelinjer og HPV18-positive HeLa S3 cellelinje. Mens CasKi cellene uttrykte både E6 og E7 antigener (Fig. 1a, b), Siha og HeLa S3 cellelinjer hadde ingen målbar uttrykk for E6 antigen (resultater ikke vist), men gjorde uttrykkelig E7 protein (fig 1d, e.); riktignok, nivået av ekspresjon E7 var lav i Siha celler
a) E6 fra proteinekstrakter av CasKi celler behandlet med MG132 i 3 timer (figur 1d.).; b) E7 fra proteinekstrakter av CasKi celler behandlet med MG132 i 3 timer; c) E6 fra proteinekstrakter av CasKi celler behandlet med MG132 for 6 timer; d) E7 fra proteinekstrakter av Siha celler behandlet med MG132 i 3 timer; e) E7 fra protein ekstrakter av HeLa S3 celler behandlet med MG132 i 3 timer; f) HBX fra proteinekstrakter av Hep 3B2.1-7 celler behandlet med MG132 for 3 timer.
proteasominhibitor MG132 reduserer nedbrytning av ubiquitin-konjugert proteiner i pattedyrceller uten å påvirke ATPase eller isopeptidase aktiviteter. MG132 har blitt rapportert å resultere i økte nivåer av E6- og E7-proteiner i cervikale kreftceller [19], [20]. Som høyere mengder målet antigener kan potensielt forbedre RIT resultater, undersøkte vi påvirkning av forbehandling av CC celler med proteasominhibitor MG132 på nivåene av E6 og E7 uttrykk. Fig. 1 a og b viser at i CasKi celler forbehandling med MG132 medført en økning i ekspresjon av både E6 og E7, med det høyeste nivået av ekspresjon oppnådd ved bruk av 2 og 5 ug /ml av MG132 som avtok når høyere doser ble anvendt. Forlengelse av inkubasjonstiden for CasKi celler med MG132 ikke resultere i større E6 uttrykk. Faktisk, observerte vi redusert E6 uttrykk med langvarig CasKi celle eksponering for MG132 (Fig. 1c), som kan gjenspeile en økning på protein degradering etter mer enn tre timers inkubasjon. Lignende eksperimenter ble utført for E7-proteinet i Siha og HeLa S3 cellelinjer (Fig. 1d, e). Siha celler viste ikke en vesentlig økning i nivået for E7 (figur 2d.); mens, E7 nivåer gjorde øke litt for HeLa S3 celler behandlet med 1 og 2 ug /ml MG132 (fig. 1E). Gitt pålitelig og høy uttrykk for E6 i CasKi celler samt deres evne til å produsere svulster i nakne mus-vi valgte CasKi celler og E6 protein for ytterligere in vitro og in vivo eksperimenter.
a, b) immunfluorescens av faste og permeabilized kreftceller. Venstre panelene viser lysmikroskopi bilder av cellene. Tungt skadede celler er merket med piler. Høyre panel viser immunfluorescens-bilder av de samme objektglass som ble behandlet med virale protein-spesifikke mAbs fulgt av FTIC-konjugert polyklonalt antistoff mot mus IgG: a-CasKi celler og E6-spesifikke mAb C1P5, b-Hep 3B2.1-7 celler og HBx- spesifikk 4H9 mAb; c) immunhistokjemi av CasKi svulster. Venstre panel viser binding av E6-spesifikke mAb C1P5. Høyre panel viser fravær av binding av kontroll mAb 18B7; d) western blot av Hep 3B2.1-7 tumor med HBX-spesifikk mAb 4H9.
Valg av en cellelinje-antigen kombinasjon å virke som en eksperimentell Hepatitt B-assosiert hepatocellulært karsinom (HCC) modellen
Vi har evaluert to Hepatitt B-assosiert virale proteiner som potensielle mål for RIT-HBX og preS2. HBX er mistenkt for å ha en rolle i hepatocarcinogenesis og, i motsetning til andre mulige valg, har HBX ingen homologi med vertsproteiner. Videre, det genet som koder for HBX beholdes selv når HBV-genomet blir integrert i HCC, mens andre HBV-gener, kan gå tapt [21], [22]. PreS2 er også mistenkt for å ha en rolle i hepatocarcinogenesis (dvs. ved transaktivering av cellulære gener som er viktige for vekstkontroll) [22]. HBX protein ble gående påvist ved Western blot av HCC cellelinje Hep 3B2.1-7 ved hjelp 4H9 mAb, og dens ekspresjon var uavhengig av forbehandling med MG132 proteasominhibitor (Fig. 1f), mens preS2 ikke ble detektert (resultater ikke vist ). Derfor valgte vi Hep 3B2.1-7 cellelinje og HBX protein kombinasjon for videre forsøk.
Binding av antistoffer mot virale antigener i ikke-levedyktige celler
For å finne ut om antistoffer mot virusproteiner som ble identifisert som mål for RIT vil være i stand til å binde til virale proteiner i ikke-levedyktige tumorceller, utførte vi immunfluorescens av faste og permeabilisert CasKi og Hep 3B2.1-7 celler med mAb C1P5 til E6 og 4H9 til HBX proteiner , henholdsvis, fulgt av FITC-konjugert polyklonalt antistoff mot mus IgG. Mens bindingen av mAb C1P5 til cellene som var nesten intakt var svak, er sterkt skadede celler med gjennomtrengelige membraner som viste fluorescens lys som peker til binding av C1P5 til E6 (fig. 2a). Fikseringen og permeabiliseringen også gjort mulig for mAb-4H9 for å bindes til HBX-proteinet (fig. 2b). Ingen binding av kontroll IgG1 mAb til faste og permeabilized CasKi eller Hep 3B2. 1-7 celler ble observert (resultater ikke vist).
Uttrykk av virusproteiner i svulstene
For å bekrefte at CasKi og Hep 3B2.1-7 cellene fortsatte å uttrykke E6 og HBX viral antigener, henholdsvis i svulstene indusert i nakne mus, utførte vi immunhistokjemi og immunoblot for E6 og HBX, respektivt. Western blot ble valgt for Hep 3B2.1-7-indusert svulster basert på litteratur rapporterings vanskeligheter pålitelig detektering HBX protein i organer ved immunhistokjemi [23]. Det var intens farging av E6 med spesifikk mAb C1P5 i CasKi svulster (Fig. 2c, venstre panel) med ingen farging observert med kontroll IgG1 mAb (Fig. 2c, panel til høyre). Western blot av Hep 3B2.1-7-induserte tumorer viste nærvær av HBX protein (Fig. 2d). Tilstedeværelsen av målet virale proteiner i CC og HCC eksperimentelle tumorer gitt muligheten for å rettet mot disse antigener in vivo med radiomerkede mAb’er for scintigrafisk avbildning og terapi.
Biofordeling av radioaktivt merkede mAb’er mot virale proteiner i CasKi og Hep 3B2.1-7-svulst bærende hårløse mus
Vi utførte bildebehandling og biofordelingsstudier eksperimenter med
188Re-radiomerket C1P5 og 4H9 mAb’ene i CasKi og Hep 3B2.1-7-tumor bærende nakne mus, henholdsvis for å fastslå lokaliseringen av mAb’er mot svulster. På 24 timer etter injeksjon av CasKi svulsten var synlig på scintigrafer bilde av en mus injisert med
188Re-C1P5 mAb (Fig. 3a) i motsetning til bildet av en mus injisert med irrelevant
188Re-18B7 mAb (fig. 3b). Vi har også beregnet svulsten til muskelprosent blant de 48 hr biofordelingsstudier resultater som var 10:01 for
188Re-C1P5 versus 03:01 for
188Re-18B7. Den samlede opptak av
188Re-C1P5 mAb i tumorene ved 48 timer etter injeksjon var 2,0 (± 0,3)% av injisert dose pr gram tumor. Andre organer som lever, milt og blod viste nivåene av opptak karakteristisk for IgG1 mAbs. For Hep 3B2.1-7 benyttet vi en annen tilnærming til å bevise spesifisitet av mAb opptak i svulsten ved hjelp av en modell når en mus bærer to forskjellige svulster-en den kreft av interesse og en annen-irrelevant kontroll svulst. Nude mus gjennomført A2058 menneske metastatisk melanom svulst på høyre flanke og Hep 3B2.1-7 på venstre side (Fig. 3c). Musene ble injisert med
188Re-4H9 mAb og avbildes scintigrafisk ved 24 timer etter injeksjon. Antistoffet lokalisert til Hep 3B2.1-7 tumor i motsetning til det irrelevant kontroll melanom tumor (fig. 3d). Evnen til radiomerkede mAbs til virale antigener å lokalisere disse svulstene hos mus begrunnet vurdering av RIT i disse in vivo kreft modeller.
RIT av CasKi og Hep 3B2.1-7-tumor bærende naken mus
for å evaluere den terapeutiske effekten av
188Re-C1P5 mAb i CasKi tumorbærende mus, ble dyrene injisert med enten 350 pCi
188Re-C1P5 mAb, eller matchende mengder (30 mikrogram per mus) av umerket ( «kald») C1P5 mAb eller venstre ubehandlet. Fig. 4a viser den forandring i tumorvolum hos de behandlede og kontrollgruppene. RIT med 350 pCi
188Re-C1P5 mAb fullstendig arrestert tumorveksten og førte til dets volumreduksjon (Fig. 4a og b), mens ubehandlede tumorer vokste aggressivt (fig. 4a og c) og ubehandlede kontrollmus måtte ofres på dag 20 etter behandling (P 0,01). Interessant, administrasjon av «kald» C1P5 mAb resulterte også i signifikant forsinkelse av tumorveksten, som kan være på grunn av induksjon av betennelse og utfyller kaskader av mAb
a) endringer i tumorvolum.; b) mus behandlet med 350 pCi
188Re-C1P5 mAb; c) kontroll mus (både mus vist på dag 20 etter behandling).
For RIT av Hep 3B2.1-7 svulster i nakne mus vi først benyttet samme eksperimentell design som for CasKi svulster ved bruker 350 uCi
188Re-4H9 mAb, «kalde» mAb-behandlede kontroller og ubehandlede grupper. Administrasjon av 350 uCi
188Re-4H9 mAb resulterte i lavere tumorvekst, men ikke arrestere den som i tilfelle CasKi svulster. «Cold» 4H9 mAb ikke har en effekt på tumorvekst. For å finne den mest effektive dose radioaktivt merket mAb til å hemme veksten av meget aggressive Hep 3B2.1-7 et doseresponsforsøk ble utført. Den terapeutiske effekten av
188Re-4H9 mAb begynte å manifestere seg selv i en dose på 280 uCi og effekten øker med hver påfølgende økning i dose (figur 5a). (P 0,02). Ved fullførelsen av forsøket ble tumorene fra kontroll ubehandlede mus og mus i det høyeste 600 uCi gruppe ble analysert histologisk. Kontrollen svulst besto av moderat differensierte hepatoid celler med spredte små foci av nekrose, fibrin trombose og blødning. Neoplastiske celler hadde rikelig eosinofil til fint vacuolated cytoplasma og mellomstore kjerner til svært store og anaplastiske kjerner som inneholder flere store eosinofil nucleoli med multinucleated celler tidvis tydelig. Den mitotisk indeks var høy, og det ble spredt apoptotiske celler (fig. 5b). I motsetning til dette RIT-behandlede tumorer hadde signifikant mer nekrose og blødning enn sett i kontrollene. Den morfologiske utseendet på kreftceller ofte hadde en mer vacuolated cytoplasma tyder degenerasjon (Fig 5c.)
a) endringer i tumorvolumet.; b) kontrollere ubehandlet mus; c) mus behandlet med 600 pCi
188Re-4H9 mAb. Både mus er vist på dag 18 etter behandling. I b og c nedre panelene viser H E farget svulster ved avslutningen av forsøket
Diskusjoner
Vi utførte proof-of-prinsippet in vitro og in vivo eksperimenter for å etablere. muligheten for målretting virale antigener i svulster viral etiologi med radiomerkede antistoffer for terapi. For å oppnå dette, studerte vi eksperimentelle livmorhalskreft (CC) og leverkreft (HCC) modeller, siden disse kreftformene er etiologisk relatert til HPV og HBV /HCV, henholdsvis, og har store konsekvensene for folkehelsen verden over.
den første utfordringen var valget av mål virale antigener i CC og HCC. I HPV-assosiert CC identifiserte vi E6 og E7 teinene som potensielle mål for RIT, fordi de antas å være uttrykt i alle livmorhalskreftceller; mens, kan andre virale gener går tapt i løpet av flere trinn med tumorgenese. Tilsvarende, i HCC, er HBX ekspresjon antas å bli opprettholdt. Det er imidlertid en viktig bekymring i målretting disse tre proteiner med radiomerkede mAbs-deres subcellulære plassering. Både E6 og E7 er lokalisert i kjernen, og HBX er funnet i kjernen og tidvis i cytoplasma. Som en konsekvens kan de radiomerkede mAb’er mot disse proteinene binder bare til sine respektive antigener når de er frigjort fra de døde celler, eller når tumorceller blir permeabilisert. For å gjennomføre disse eksperimentene, valgte vi CasKi cellelinjen som en modell CC, siden vi har funnet det uttrykte E6 og E7 ved høye nivåer in vitro og tumorene vokste aggressivt i nakne mus etter den latente periode. The Hep 3B2.1-7 cellelinjen ble valgt som en HCC modell, etter at vi observert at det uttrykt HBX på et høyt nivå og vises rask tumorvekst i mus.
immunfluorescens av tumorceller og immunhistokjemi og Western blot av tumorene viste rikelig mengder E6 og HBX antigene mål i CasKi- og Hep 3B2.1-7-induserte tumorer, henholdsvis (fig. 2). Tilstedeværelsen av antigen tilgjengelig for de radiomerkede mAb’er er sannsynligvis et resultat av protein-frigjøring fra tumorceller som gjennomgår hurtig omsetning. Følgelig er de radiomerkede antistoffer akkumuleres i svulstvevet slik at de kunne bli avbildet scintigrafisk (fig. 3). En av fordelene med å målrette virale antigener i svulster som de bare finnes i ondartede celler. I motsetning til dette, Chen og medarbeidere ikke observert noen forskjeller i tumoropptak for både spesifikke og ikke-spesifikke radiomerkede antistoffer i deres biofordelingsstudier eksperimentene når de målrettede intranuclear histoner [24].
Evnen av radioaktivt merkede mAbs mot virale proteiner til levere cytotoksisk radionuklide 188-rhenium til tumorcellene tilrettelagt de vellykkede utfall av RIT med disse mAb’er i tumorbærende mus. Administreringen av 350 uCi dose på E6-bindende
188Re-C1P5 mAb til CasKi tumor-bærende mus fullstendig stoppet tumorvekst og til og med ført til sin regresjon (fig. 4). Det er også sannsynlig at det var litt ekstra terapeutisk effekt fra selve antistoffet som umerkede antistoffer kan megle betennelsesreaksjoner og aktiverer kompliment. I fremtiden vil det være verdt å undersøke hvorvidt økte cellulære nivåer av E6- og E7-oncoproteiner kan oppnås med forbehandling bruk av MG132 in vivo, og om dette resulterer i en terapeutisk effekt. Doserespons eksperimenter i mus med Hep 3B2.1-7 HCC-tumorer klart demonstrert en doseavhengighet for den terapeutiske virkning (fig. 5). Det faktum at høyere doser av radioaktivt merket mAb var nødvendig for å produsere en terapeutisk effekt i HCC enn i livmorhalstumor kan gjenspeile aggressivitet av Hep 3B2.1-7 og den kjente radioresistance levertumorer i forhold til de forholdsvis radiosensitive cervikale karsinomer [25] . Det er også verdt å merke seg at terapeutiske gevinster i både eksperimentelle tumorer ble oppnådd med doser av radioaktivitet som er godt under den maksimalt tolererte dose på omtrent 800 pCi for
188Re-merket IgG1s i mus [26], og som sådan dosene som ble brukt var forventes ikke å gi noen kortsiktige eller langsiktige toksisitet.
det er viktig å understreke at ved behandling av virusassosiert kreft ved å målrette virusantigen ikke hver celle i svulsten trenger å uttrykke virale antigener for en terapeutisk effekt . Lang rekkevidde emittere for eksempel
188Re (emisjonsspekter i vev 10 mm) sender ut stråling i et 360 ° sfære, og følgelig kan drepe celler i nærheten av antigenet sted. Videre er en høy konsentrasjon av det målrettede virusantigen sannsynligvis ikke nødvendig for levering av en terapeutisk dose til tumor, i henhold til vår siste modell av RIT for melanom (rettet mot melanin som også er et intracellulært antigen). Denne modellen viste at stråledosen levert til svulsten er i stor grad uavhengig av melanin konsentrasjon (antigen) [27].
Denne tilnærmingen har også løftet for å hindre virus-assosiert kreft i kronisk infiserte individer, for eksempel, vedvarende HPV-infeksjon hos HIV-infiserte individer setter dem i betydelig risiko for å utvikle HPV-assosiert kreft. Mens det er immunterapi for HBV og HCV, er det mange pasienter som ikke oppnår viral klaring og behandlingen er forbundet med betydelig sykelighet. Det er heller ingen vaksine for HCV, og mange millioner av mennesker verden over er smittet med HBV til tross for tilgjengeligheten av en effektiv vaksine. Celler vedvarende smittet med HPV, HBV, HCV eller andre virus kan potensielt bli eliminert med RIT rettet mot virale antigener før de forvandle seg til ondartede fenotype.
I konklusjonen, vi utført in vitro og in vivo eksperimenter for å vurdere en roman strategi for å behandle virus assosiert svulster ved hjelp av radiomerkede mAbs rettet mot virale proteiner. Denne strategien er fundamentalt forskjellig fra tidligere bruk av RIT i onkologi som er rettet mot tumorassosierte humane antigener og dermed resulterer i betydelig opptak av radioaktivt antistoff i normalt vev, som fører til forgiftning. Resultatene av vår undersøkelse antyder at ved å målrette istedenfor virale og ikke selv-proteiner kan det være mulig for radiomerkede mAb’er til å konsentrere seg mer spesifikt i tumorvevet, noe som resulterer i større effektivitet og lavere toksisitet. Denne strategien reiser også en spennende ekstra mulighet til å hindre virus-assosiert kreft i kronisk infiserte pasienter ved å eliminere celler infisert med onkogene virus før de forvandle seg til kreft.
Metoder
Antistoffer
mus mAbs fra Abcam C1P5 til HPV16 E6 + HPV18 E6 og TVG 701Y til HPV16 E7 ble brukt i CC eksperimenter. Mouse mAb 4H9 å HBV HBX (Aviva, Cat # AVAMM2005) og mus mAb S26 til HBV protein Hbs (Gene Tex Inc. Cat # GTX18797) som kryssreagerer med HBsAg preS2 antigen ble brukt i HCC eksperimenter. Murine 18B7 mAb (IgG1) til
C. neoformans
[28] ble anvendt som et irrelevant kontroll for alle spesifikke antistoffer. Kanin polyklonale antistoff konjugert med alkalisk fosfatase til mus IgG H L ble kjøpt fra Abcam og brukes som sekundært antistoff i Western blot
cellelinjer og celledyrkings
Tre menneskelivmorhalskreft cellelinjer. Hela S3, Siha og CasKi ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). Celler ble dyrket rutinemessig i DMEM /HAM F-12K (Sigma, 01:01) inneholdende 10% FBS (Sigma) og 1% penicillin-streptomycin-løsning (Sigma, penicillin 10 000 U streptomycin og 10 mg /ml) ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. Cellelinjen Hep 3B2.1-7 (
Homo sapiens
hepatatocellular karsinom) ble kjøpt fra ATCC. Den inneholder en integrert hepatitt B-virus-genomet og er avledet fra leverkreft vev av 8 år gammel sort gutt. Celler ble dyrket rutinemessig i Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC) inneholdende 10% FBS (Sigma) ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. Cellelag i 75 ml kolbe ble dispergert ved tilsetning av 2 ml 1 x Trypsin-EDTA-løsning (Sigma, 0,25% (vekt /volum) trypsin-0,53 mM EDTA) ved romtemperatur i 15 minutter. A2058 cellelinje avledet fra en lymfeknutemetastase fra pasient med malignt melanom ble erholdt fra ATCC. Cellene ble opprettholdt som monolag i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 4 mM L-glutamin, 4,5 g /l glukose, 1,5 g /l natriumbikarbonat, supplert med 10% føtalt bovint serum og 5% penicillin-streptomycin-løsning ved 37 ° C og 5% CO
2, og høstet ved å bruke 0.25% (w /v) Trypsin-EDTA-løsning. Regelmessig vedlikehold av alle cellelinjer ble utført i henhold til protokollene ATCC.
Western blot
Cellepelletene ble suspendert i lyseringsbuffer (4% SDS, 20% glyserol, 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,002% bromfenolblått og 10% β-merkaptoetanol). Proteinprøver ble kokt i vann i 15 minutter før kjøring av SDS-PAGE. Tyve halv seks ul proteinoppløsning ble anbragt i hver brønn av 12% forstøpt SDS-PAGE-gel (Bio-Rad). SDS-PAGE ble anvendt for å overvåke de relative mengder protein i prøvene. Tolv prosent SDS-PAGE-gel ble anvendt for å skille proteiner, og elektroforese ble utført ved anvendelse av mini-Protean® tre cellesystem (Bio-Rad). Etter elektroforese ble gelen overført til PVDF overføringsbuffer (25 mM Tris, 190 mM glycin og 2,5% (v /v) metanol) i 5 minutter. Deretter, proteiner ble overført fra gelen til den Immun-Blot ™ PVDF-membran (Bio-Rad) på halvtørr elektroforetisk overføring Cell (Bio-Rad) ved 15 V i 17 min. Membranen ble fuktet i blokkerende buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA og 150 mM NaCl) i 5 min, og deretter overført til den blokkerende løsning (5% ikke-fett tørrmelk i blokkeringsbuffer) og rister forsiktig i en time. Membranen ble inkubert i TBST-oppløsning (0,1% Tween-20, 25 mM Tris-HCl (pH 7,6) og 500 mM NaCl) som inneholdt 1:3000 fortynnet primært antistoff ved romtemperatur i 1 time med forsiktig risting. Deretter ble membranen vasket med TBST tre ganger (10 minutter per vask). Membranen ble hybridisert med det sekundære antistoff konjugert med alkalisk fosfatase (kanin polyklonalt til mus IgG H & Co. L (alkalisk fosfatase)) i TBST med en 1:100,000 fortynning. Etter tre vaskinger med TBST, ble membranen inkubert i CDP-Star ™ kjemiluminescerende substrat-oppløsning (Sigma) i 5 minutter, og deretter utsatt for CL-Xposure ™ film (Pierce). Filmen ble utviklet i henhold til produsentens anvisninger.
MG132 behandling av celler
MG132 (Z-LLL-CHO, MW = 457,6) som er kjøpt fra Calbiochem er en potent, reversibel og celle-gjennomtrengelig proteasome inhibitor (Ki = 4 nM). MG132 ble først oppløst i en dråpe av 100% etanol, etterfulgt av DMEM /HAM F-12K medium uten tilsetning av FBS, og stamløsningen ble lagret ved 4 ° C. Cellekulturen ble innhøstet og overført til sterile 6 reagensglass. Hvert rør inneholdt 0,5-1 ml cellekultur (cellekonsentrasjon var ~ 10
6 celler /ml), og cellene ble tillatt å vokse ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator over natten. Deretter ble MG132 løsning tilsatt til rørene for de endelige konsentrasjoner på 0, 1, 2, 5, 10 eller 25 ug /ml (0, 2,1, 4,2, 10,5, 21 eller 52 uM, henholdsvis). Cellene ble inkubert under de samme betingelser i ytterligere 3 eller 6 timer. Til slutt, ble cellene høstet ved sentrifugering og klaret ved vasking med PBS.
radioisotop og radiomerking av antistoffer
beta-emitter
188Re med en halveringstid på 16,9 timer ble eluert i form av natrium perrhenate Na
188ReO
4 fra en
188W /
188Re generator (Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN). Antistoffer ble merket med
188Re direkte gjennom binding av redusert
188Re til det genererte-SH-gruppe på antistoffene som tidligere beskrevet [11].
Immunofluorescent deteksjon av virale antigener i tumorceller
tumorceller ble dyrket i skyvekamre ved 37 ° C i 12 timer. Mediet ble fjernet og cellene ble vasket med PBS tre ganger. Gjennom hele prosedyren ble cellene vasket 3 ganger med PBS etter hver behandling. De ble fiksert med 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 20 minutter etterfulgt av permeabiliseringen med 0,3% Triton-X100 i PBS ved romtemperatur i 10 min. Faste og permeabiliserte celler ble blokkert med 5% BSA pluss 0,1% Triton X-100 i PBS ved romtemperatur i 30 min. Virusantigener-spesifikke mAb ble fortynnet 1:200 med den ovenfor angitte BSA og Triton X-100-løsning og inkubert med cellene ved romtemperatur i 60 min. FTIC-konjugert kanin-polyklonalt antistoff mot mus IgG i 1:300 fortynning ble tilsatt til cellene i 60 min inkubasjon ved romtemperatur i mørket. Glassene ble sett på med et Olympus AX70 mikroskop (Melville, New York) er utstyrt med en FITC filter.
tumormodeller
Alle dyrestudier ble utført i samsvar med retningslinjene fra Institute for Animal studier ved Albert Einstein College of Medicine. Menneskelig livmorhalskreft CasKi og menneskelig leverkreft Hep 3B2.1-7 cellelinjer ble valgt som tumormodeller basert på dens uttrykk for henholdsvis E6 og HBX, og deres tumorigenecity i nakne mus. Seks-ukers-gamle hunn nu /nu CD1-nakne mus som er kjøpt fra Charles River ble sprøytet inn i høyre flanke med 10
7 CaSki eller Hep 3B2.1-7 celler i 0,1 ml DMEM-medium inneholdende 10% føtalt kalveserum. CasKi svulster begynte å dukke opp rundt 60 dager etter injeksjon, Hep 3B2.1-7 svulster-10 dager etter celleinjeksjon. For biodistribusjon av HBX-spesifikke mAb, ble nakne mus inokulert med 10
7 A2058 humane metastatiske melanomceller og 10
7 Hep 3B2.1-7 celler i høyre og venstre flankene, henholdsvis. Biodistribusjon og terapi eksperimenter ble igangsatt da svulstene nådd 0,3-0,7 cm i diameter.
Immunhistokjemisk påvisning av HPV E6 protein i CasKi svulster
Svulstene tatt fra CasKi tumorbærende mus ble løst i
