Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall og jakten på prognostiske biomarkører som kan forbedre behandling beslutninger er garantert. MicroRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA-molekyler er involvert i regulering av genekspresjon og er blitt foreslått som mulige biomarkører i CRC. For å karakterisere miRNA transkriptomet, ble en stor kohort inkludert 88 CRC svulster med langsiktig oppfølging dyp sekvensert. 523 modne miRNAs ble uttrykt i vår årsklasse, og de viste stort sett ensartet uttrykk mønstre på tvers av tumorprøver. Få sammenhenger ble funnet mellom kliniske parametre og miRNA uttrykk, blant dem, lavt uttrykk av MIR-592 og høy uttrykk for Mir-10b-5p og MIR-615-3p ble assosiert med svulster som ligger i høyre colon forhold til venstre colon og rektum. Høy uttrykk for MIR-615-3p var også assosiert med dårlig differensierte svulster. Ingen prognostiske biomarkører kandidater for generelle og metastasering overlevelse ble identifisert ved å bruke lasso-metoden i en Cox-modell eller univariate Cox. Undersøkelse av de fem mest rikelig uttrykt mirnas i kohort (MIR-10a-5p, MIR-21-5p, MIR-22-3p, MIR-143-3p og MIR-192-5p) avslørte at deres kollektive uttrykk representert 54% av de detekterte miRNA sekvenser. Pathway analyse av målgener reguleres av de fem mest høyt uttrykte mirnas avdekket et betydelig antall gener involvert i CRC-reaksjonsveien, inkludert APC, TGFp og PI3K, og dermed tyder på at disse mirnas er relevante i CRC.
Citation : Schee K, Lorenz S, Worren MM, Günther CC, Holden M, Hovig E et al. (2013) Deep Sekvensering av mikroRNA transkriptomet i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (6): e66165. doi: 10,1371 /journal.pone.0066165
Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, Storbritannia
mottatt: 17 februar 2013; Godkjent: 02.05.2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Schee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Helse Sør-Øst Norge RHF og fra den norske Kreftforening. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (miRNA) er evolusjonære konserverte små (~20-22 nt lang), ikke-kodende RNA som regulerer genuttrykk ved å binde seg til 3’UTR av mRNA, og dermed begrenser oversettelse [1]. De kan binde med delvis komplementaritet til mRNA til potensielt nedregulere flere mRNA. Dette gjør nedstrøms studiene litt utfordrende med flere potensielle mål for hver miRNA. I dag er det ca 1500 mirnas kommenterte i miRNA database (miRBase) [2], og det er anslått at opptil 60% av proteinkodende gener kan være regulert av mirnas [3]. Mirnas er avgjørende for normal pattedyr utvikling og er involvert i finjustering mange biologiske prosesser, slik som celledeling, differensiering, apoptose og metabolisme, og deres engasjement i kreft har skapt økt interesse for miRNA biologi [4] – [6]. De har blitt foreslått som mulige biomarkører på grunn av sine tilsynsfunksjoner, kjemisk stabilitet og mulighet for å måle miRNA i serum, plasma, avføring og vevsprøver [7] -. [10]
Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste kreftformene i vestlige land og en ledende årsak til kreft dødsfall. Det er en heterogen sykdom karakterisert ved akkumulering av genetiske og epigenetiske hendelser, og som påvirkes av livsstil [11], [12]. Behandlings beslutninger er fortsatt i hovedsak basert på den anatomiske omfanget av sykdommen ved diagnose, og søken etter bedre biomarkører er berettiget. Mirnas er kontrollert for deres potensielle rolle som diagnostiske, prognostiske og terapeutiske biomarkører i CRC bruker hybridisering basert array-teknologi og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) [13] – [16]. Ved hjelp av uttrykk mikromatriser, kan ekspresjon av et stort antall forhåndsvalgte mirnas skal detekteres, og miRNA deteksjon er basert på signalstyrker. Relativ ekspresjon kan beregnes ved hjelp QRT-PCR, men ved utvidelse til flere parallelle analyser, til antallet mirnas mulig å analysere og RNA-mengder kan representere begrensninger. Deep sekvensering har dukket opp som en attraktiv tilnærming for global miRNA analyse, fordeler, inkludert pooling av prøver for high-throughput formål, et bredt påviselig uttrykk utvalg, evnen til å analysere uttrykk for alle kommenterte miRNAs og muligheten til å oppdage nye miRNAs.
i dette arbeidet ble dypt sekvensering brukes til å bestemme miRNA uttrykket i 88 CRC tumorprøver, og assosiasjoner mellom uttrykk nivåer og clinicopathological data og utfallet ble analysert.
Materialer og metoder
pasient~~POS=TRUNC Cohort og Prøvepreparering
i årene 1998-2000 ble 316 pasienter rekruttert fra fem sykehus i Oslo-området [17], og prospektivt inkludert i studien på tidspunktet for primær kirurgi for antatt eller bekreftet kolorektal kreft . Studien ble godkjent av Regional etisk komité (Helseregion II, Norge) og informert samtykke ble innhentet fra pasientene. Resected prøvene ble behandlet rutinemessig for histopatologisk vurdering på tidspunktet for kirurgi og klassifisert i henhold til svulsten metastaser (TNM) staging system. Prøvetaking av ytterligere tumorvev ble utført av kirurgen i operasjonsrommet etter at prøven ble fjernet fra pasienten, og prøvene ble øyeblikkelig hurtigfrosset i flytende nitrogen. Prøvene ble deretter transportert til forskningslaboratoriet og holdt for langtidslagring ved -80 ° C. Biopsiene ble seksjonert ved anvendelse av en cryostat mikrotom og hematoksylin-eosin fargede objektglass ble undersøkt for tumor innhold av en patolog (median tumorinnholdet i prøvene var 50%, område 30-80%). Tumorvevet ble deretter oppskåret i 10 um seksjoner ved anvendelse av en cryostat mikrotom og lagret ved -80 ° C til RNA-isolering. 120 tilfeller ble ikke inkludert i undersøkelsen av følgende grunner: ikke invasiv kreft (25), histologi annet enn adenokarsinom (5), fjern metastase ved tidspunktet for kirurgi (34), preoperativ kjemoradioterapi (2), utilstrekkelig kirurgiske marginer (7 ) og ukjent stadium av sykdommen (1). I tillegg frosne vevsprøver var ikke tilgjengelig i 46 tilfeller. Fra de 196 prøvene i TNM stadium I-III, ble 90 tumorprøver tilfeldig utvalgt for sekvensering dyp. Etter sekvensering, ble to prøver fra kullet anses degradert og ble fjernet fra ytterligere studier, og etterlater en prøve kohort av 88 pasienter (tabell 1). Oppfølgingsdata ble innhentet fra de deltakende sykehus og fra allmennleger (for de pasientene som ikke deltar på planlagte kontroller). Metastase ble verifisert ved radiologisk undersøkelse og overlevelsesdata ble hentet fra folkeregisteret Norge og oppdatert innen 1. oktober 2008.
RNA Isolation og Deep Sekvense
RNA ble isolert fra svulstvev ved hjelp av TriReagent (Ambion Inc, TX) i henhold til produsentens protokoll og den totale RNA-konsentrasjonen ble målt ved hjelp av Nanodrop (ND-1000). Kvaliteten ble bedømt ved den Agilent 2100 Bioanalyzer og prøver med en RIN-verdi på 7 og ovenfor ble anvendt for videre analyse. Små RNA sekvense bibliotekene ble opprettet etter den Illumina®TruSeq ™ små RNA Prøvepreparering protokoll. I korte trekk, 3` og 5` RNA adapter, spesielt modifisert for å målrette mot endene av små RNA molekyler, ble ligert til 1 ug av høy kvalitet total RNA. Revers transkripsjon ble utført for å generere cDNA biblioteker og PCR ble brukt til å forsterke og legge til unike indeks sekvenser til hvert bibliotek.
Små RNA bibliotek ble samlet og 32 baser ble sekvensert for hver cDNA molekyl ved hjelp av en Illumina® Genome Analyzer IIx . Indekser ble sekvensert for å identifisere kilden til hver leser. Den første løp, som inneholder 48 prøver ble hemmet av delvis formålsløse baner i flyten celle og ble derfor gjentatt. Dataene for forsøk 1 og kjøre to ble slått sammen for nedstrøms uttrykk analyse, samt analysert separat for å fastslå den tekniske reproduserbarhet av eksperimentene.
Sequencing dataanalyse og Normalisering
Real-time analyse , basen kall og filtrering av lav kvalitet leser ble gjort av Illumina sin programvarepakker (SCS2.9 /RTA1.9 og Off-line Basecaller v1.9). Novoalign (V2.08.01 Novocraft 2010; www.novocraft.com) ble brukt til å skjære rester adapter sekvens og kartlegge leser til referanse menneskelige genom (hg19). Alle leser kartlegging til 10 eller flere genomiske regioner ble ekskludert fra videre analyse. Den kartlagt leser ble kommentert ved hjelp av kjente databaser. miRBase database utgivelsen The 18 (november 2011) ble brukt til å identifisere mirnas, ved hjelp BEDTools Version-2.16.2 [18]. NCBI bygge «Homo_sapiens.NCBI.36.58» ble brukt til å identifisere andre små RNA arter og mRNA.
For å beregne lese teller for mirnas, leser at kartlagt unikt innenfor en moden miRNA sekvens med maksimum en mismatch var ansett treff. Leser kartlegging til mer enn en moden miRNA sekvens ble tildelt i henhold til frekvensen av entydig kartlagt leser funnet for disse miRNAs. Det betyr at når to mirnas delte et gitt antall multiple kartlagt leser, identifiserte vi forholdet mellom unike leser mellom disse to mirnas. Dette forhold ble anvendt for å dele antall multiple kartlagt leser og tilordne dem. Hvis flere treff ble funnet å være perfekt kartlagt til en genomisk region og kartlagt med mismatch til en annen, ble bare perfekt treff vurdert.
For normalisering av lese tellinger ble fire ulike tilnærminger testet. Vi beregnet normaliseringsfaktoren for alle prøvene ved å dividere totalt antall leser, antall leser justert til genomet, slik at flere treff, eller at kartet unikt, eller antall leser tilordnet kommenterte modne mirnas med 1 million. De normaliserte uttrykk verdiene for hver miRNA ble generert ved å dele lese telling av miRNA med henhold normaliseringsfaktor. Etter normalisering, alle mirnas med lese teller mindre enn 10 over alle pasientprøver ble satt til 0. Datasettet normalisert mot kommenterte modne miRNAs ble valgt for de resterende analyser. Normaliserte og un-normaliserte lese teller for alle prøvene er gjort tilgjengelig på Array Express nettsted, sjonsnummer E-mtab-1649 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/).
Kvantitativ real Time PCR
QRT-PCR ble tidligere utført for hele kullet av 196 prøver fra hvor fersk frosset vev var tilgjengelig for å bestemme uttrykket av seks mirnas: Mir-21, MIR-31, MIR-92A , MIR-101, MIR-106a og MIR-145 [19]. Kort fortalt ble cDNA syntese og QRT-PCR utføres ved hjelp av TaqMan mikroRNA analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens protokoll. Alle prøver ble kjørt i duplikater. Ct-verdier for mirnas ble normalisert mot RNU44 og den relative uttrykket ble beregnet ved hjelp av to
-dCt metoden [20]. Resultater for disse seks mirnas fra de 88 prøvene som hadde blitt analysert med begge metoder ble brukt for sammenligning av data fra dyp sekvensering med QRT-PCR. Assosiasjoner mellom resultatene fra de dype sekvensering og QRT-PCR ble undersøkt ved lineær regresjonsanalyse.
Hierarkiske Clustering and Statistical Analysis
hierarkisk clustering ble utført for å visualisere uttrykk mønstre av alle miRNAs. De normaliserte uttrykk verdiene ble log2 transformert og uten tilsyn toveis hierarkisk clustering ble utført ved hjelp Euklidsk avstand og vektet gjennomsnitt kobling (WPGMA) til å klynge mirnas og prøver samtidig.
To klasse uparet betydning analyse med multippel testing (10000 permutasjoner ) (SAM) [21] ble brukt til å identifisere mirnas forbundet med clinicopathological parametere, ved hjelp av J-Express (2012 versjon) [22]. Inngangen for SAM ble normalisert og log2 transformert og clinicopathological parametre ble brukt som responsvariabler. Ti tusen gjentatte permutasjoner av dataene ble anvendt for å bestemme om ekspresjon av mirnas var signifikant assosiert med en av de følgende clinicopathological parametere: TNM, pt, pn, tumorlokalisering, differensiering, perinodal infiltrering, vaskulær invasjon og nevrale infiltrasjon. Den falske funnraten uttrykt som q-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Totalt og metastasering overlevelse ble beregnet fra tidspunktet for kirurgi før dato for død eller diagnostisering av metastaser. Å identifisere mirnas forbundet med generelle og metastasering overlevelse univariate Cox proporsjonal hazard regresjon ble brukt til hver miRNA, testing for foreninger med metastase-fri eller total overlevelse. Å ta hensyn til flere tester, ble justert p-verdiene beregnet ved å styre den falske funnraten (FDR), ved hjelp av Benjamini-Hochberg prosedyre [23]. Så, for alle de mirnas samtidig, lasso metoden i Cox modell [24], som gjennomførte tidligere [25], ble brukt til å oppdage et sett av miRNAs forbundet med endepunktene. «I LASSO analysen ingen mirnas ble valgt. Ingen mirnas var betydelig i univariate Cox analyse etter korreksjon for multippel testing. I denne siste analysen, syv mirnas (MIR-339-5p, MIR-7-1-3p, MIR-365b-3p, MIR-454-3p, MIR-194-3p, MIR-15b-3p og HSA-speil 4461) hadde p-verdi under 0,01 med metastaser utvikling som endepunkt, mens tre mirnas (MIR-101-5p, HSA-MIR-873-5p og HSA-MIR-3144-3p) hadde p-verdi under 0,01 med endepunkt total overlevelse . Alle disse ti mirnas ble uttrykt på svært lave nivåer i vår kohort med høyest median uttrykk observert for MIR-454-3p med 187 leser til det laveste for MIR-873-3p med 0 leser.
Pathway Analysis for målgener av de fem mest høyt uttrykt mirnas
for å undersøke den biologiske påvirkningen av de mest høyt uttrykte mirnas, ble målet gener identifisert ved hjelp TarBase 6.0 [26]. Denne databasen inneholder målgener som har eksperimentell støtte i tillegg til sekvens-basert prediksjon. Genet identiteter ble lastet inn i web-baserte DAVID funksjonell annotering verktøy for pathway analyse bruker KEGG databasen [27], [28].
Resultater
Små RNA sekvensering og annotering
lengden av de detekterte sekvensene varierte mellom 13 og 29 nukleotider etter fjerning av adaptersekvensen (lesninger ble lenger er fjernet). Den viktigste delen av lyder, 97,9%, var mellom 19 og 23 baser. I gjennomsnitt, 2,6 millioner leser tilordning til det humane genomet ble oppnådd pr tumorprøve (figur 1A). Vi identifiserte frekvenser av lyder som faller inn i ulike klasser av små RNA eller andre genomiske regioner og beregnet median frekvensene sammenligner alle 88 tumorprøver. Hyppigheten av lyder kartlegging for å modne mirnas varierte 37-77% i bibliotekene og ga en median på 61% (figur 1B). For intronic /intergeniske regioner en median lese frekvens på 33% ble funnet, og for premature mirnas og snoRNAs, median lese frekvensene var 4% og 2%, henholdsvis (figur 1C). I tillegg er en liten brøkdel av lesninger tilordnet snRNA, miscRNA, tRNA, rRNA, og mRNA, samt omfattende en frekvens på ~0.05%. Mirnas med mindre enn 10 leser på tvers av alle pasientprøvene ble ansett ikke uttrykt. I alt ble 523 mirnas uttrykt i datasettet.
A. Antall leser (x10
6) kartlagt til det menneskelige genom (hg19) for alle prøvene. Disse inkluderer alle RNA arter (for tidlig miRNA, snoRNA, snRNA, miscRNA, rRNA, tRNA og mRNA) .De sekvenser som ikke samsvarer kjent sekvens ble matchet mot databaser av intergeniske og intronic regioner av det menneskelige genom. B. Frekvensene leser tilordnet kommentert modne mirnas for alle prøver ved hjelp av mikroRNA database (miRBase frigjøre 18). C. Pie-diagram som representerer prosentandeler av de ulike RNA-klasser som finnes i datasettet.
Normalisering og teknisk gjentak
Generelt sammenligne uttrykk verdier mellom prøvene er det nødvendig å normal mot lese telle ved å beregne en normaliseringsfaktor. De fire ulike normaliseringsmetoder ga svært like resultater når du sammenligner gjennomsnittsendringen beregnet av forskjellen i prosent for hver miRNA lese teller per miRNA (data ikke vist). Figurene 2B og 2C viser fordelingen av log2 transformert unormalisert lese tellinger og lese tellinger normalisert mot modne mirnas i fem tilfeldige pasientprøver. De nedre leseTallet var ikke så påvirket ved normalisering i forhold til de høyere verdier. Til sammen normalisering generert relativt likt fordelt lese teller for de fleste miRNAs tvers av alle prøvene.
A. Sammenligning av de tekniske replikater mellom løp 1 og løp 2. Hver prikk representerer det totale uttrykket av en enkelt miRNA fra alle pasientprøvene. MiRNA uttrykket data ble normalisert og log2 forvandlet. B. unormalisert miRNA lese tellinger (log2) for fem tilfeldig utvalgte pasienter. C. Normalisert miRNA lese tellinger (log2) for de samme fem pasientene som i B.
48 prøver ble dypt sekvensert to ganger, betegnet kjøre en og kjøre to, og disse datasettene ble brukt for å sammenligne resultatene fra de enkelte løper. Resultatene viste en meget god korrelasjon mellom de tekniske replikater vist ved null skråningen linjen (figur 2A).
De fem mest høyt uttrykt mirnas
De fem mest rikelig uttrykt mirnas i dette kullet var MIR-10a-5p, MIR-21-5p, MIR-22-3p, MIR-143-3p og MIR-192-5p (figur 3). Lese teller for disse mirnas utgjorde 53,7% av det totale antall miRNA sekvenser påvist i pasientprøvene, mens de 20 beste mirnas sto for 82,6% av lyder (tabell S1). De resterende 503 mirnas utgjorde 17,4% av den leser. Av de fem øverste miRNA, MIR-192-5p hadde høyest median uttrykk (156413 lesninger) mens MIR-22-3p hadde den laveste (35284 Lest).
Differensial uttrykk for de fem mest rikelig uttrykt mirnas i vår CRC kohort. De totale antallet miRNA leser er log2 forvandlet. Sirklene representerer uteliggere og stjernene representerer ekstreme uteliggere.
Mange miRNA gener ligger i umiddelbar nærhet til andre miRNA gener i gensamlingene, og to av de fem mest aner uttrykt mirnas (MIR-143 -3p og MIR-192-5p) er en del av slike klynger. MiR-143-3p og MIR-145-5p er begge plassert på kromosom 5 10kb hverandre, mens MIR-192-5p og MIR-194-5p er plassert på kromosom 11 10kb hverandre. Expression nivåer av MIR-143-3p og MIR-192-5p og to mirnas tilhører sine respektive gensamlingene er avbildet i figur 4. Ingen co-uttrykk var tydelig for de mirnas tilhører disse gensamlingene, som er i samsvar med tidligere resultatene [29].
A. MiR-143-3p er funnet i det samme genet klynge som MIR-145-5p på kromosom 5 (posisjonerer 148808481-148808586 og 148810209-148810296, henholdsvis). MiR-192-5p er funnet i det samme genet klynge som MIR-194-5p på kromosom 11 (posisjonerer 64658609-64658718 og 64658827-64658911, henholdsvis). Selv om mirnas i hvert gen klynge er 10kb hverandre, co-uttrykk ble ikke observert
Pathway Analysis for de fem mest høyt uttrykt mirnas
1490 målgener ble identifisert som. potensielt regulert av MIR-10a-5p, MIR-21-5p, MIR-22-3p, MIR-143-3p og MIR-192-5p. Banene med den mest signifikante gen-anrikning er vist i tabell 2, og inkludert «Pathways i cancer» (55 gener; p = 3,3 x 10
-7), «Cell cycle» (28 gener; p = 2,2 x 10
-6), og «Colorectal cancer» (21 gener; p = 1,0 × 10
-5). Fokus på CRC veien, fant vi ut at genene reguleres av de fem mest uttrykt mirnas inkludert onkogener (
KRAS, PI3K
), tumor suppressors (APC og TGFβRII), og DNA-reparasjonsgener (hMSH6) og gener tilhørighet til wnt og MAPK signalveier (figur 5).
pathway analyseresultater for målgener av de fem mest uttrykt mirnas i kolorektal kreft veien. Illustrasjonen er hentet fra den KEGG database og mirnas ble lagt i blå skrift for å angi målene regulert av disse mirnas.
Sammenheng mellom QRT-PCR og Deep Sekvensering av data
Expression verdier for seks miRNA MIR-21, MIR-31, MIR-92a, MIR-101, MIR-106a og MIR-145, ble tidligere bestemt ved hjelp QRT-PCR [19]. MiRNA ekspresjon målt ved QRT-PCR ble sammenlignet med de dype sekvenseringsdata ved hjelp av lineær regresjonsanalyse av normaliserte Ct-verdier (QRT-PCR) og log2-transform dyp sekvenseringsdata. R
2 verdier for de 6 mirnas testet var 0,06, 0,38, 0,10, 0,001, 0,03, og 0,28 for MIR-21, MIR-31, MIR-92a, MIR-101, MIR-106a, og MIR-145 hhv. Summen av totale ekspresjonsnivåer ble også beregnet for disse mirnas for hver metode, og de relative nivåer er vist i figur 6. Den relative uttrykk mellom de enkelte mirnas var rimelig overensstemmelse mellom fremgangsmåter for fire av de mirnas (MIR-21, MIR-31 , MIR-92a og MIR-106a), mens det var klare avvik for MIR-101 og MIR-145. MiR-101 var knapt påvisbare med QRT-PCR, men viste påvisbare uttrykk verdier med dyp sekvensering, mens MIR-145 ble oppdaget av QRT-PCR og neppe oppdages ved hjelp av dyp-sekvensering.
De normaliserte uttrykk verdiene ble log2 forvandlet og analysert av unsupervised toveis hierarkisk clustering bruker vektet gjennomsnitt kobling (WPGMA). Den globale kartet inneholder alle uttrykt mirnas vist vertikalt og pasientprøver horisontalt.
Hierarkiske Clustering og foreninger mellom miRNA uttrykk og Clinicopathological Parametere
miRNA uttrykk mønstre observert med hierarkisk clustering vises i Figur 7 med mirnas på den vertikale akse og pasientprøver på den horisontale aksen. De fleste av miRNAs utstilt svært lignende uttrykk nivåer på tvers av pasientprøver. I deler av tomten, noen mirnas syntes å være forskjellig uttrykt, men disse ble nesten utelukkende plassert mellom miRNA som hadde svært lav uttrykk. SAM analyse av uttrykk data og clinicopathological parametere viste at høyt uttrykk for Mir-10b-5p og MIR-615-3p og lavt uttrykk av MIR-592 var assosiert med svulster som ligger i høyre colon (inkludert stigende og tverrgående tykktarmen) sammenlignet med den venstre colon og rektum (tabell 3). Ekspresjonen av disse mirnas viste 2,4 ganger, 41,4 ganger og 3,9-ganger forskjellen, henholdsvis (q 0,05 for alle mirnas) (figur 8). Høy uttrykk for MIR-615-3p var også assosiert med dårlig differensierte svulster sammenlignet med et mellomliggende og godt differensierte tumorer (endring 44,4, q 0,05).
Uttrykk av seks mirnas (MIR-21, speil 31, MIR-92a, MIR-101, MIR-106a og MIR-145) er vist fra dypt sekvensering og QRT-PCR for 88 pasientprøver som ble analysert med begge metodene. A. Stolpene representerer summen av det totale antall lese (x10
6) for hver miRNA fra dyp-sekvensering. B. Stolpene representerer summen av den relative uttrykk (2
-dCt) fra QRT-PCR.
Høy uttrykk for Mir-10b-5p og MIR-615-3p og lavt uttrykk av MIR-592 var assosiert med tumor lokalisert i høyre colon forhold til venstre tykktarm og endetarm (q 0,001 og p 0,001).
foreninger mellom miRNA uttrykk og Outcome
i lASSO og univariate Cox analyse, 5 mirnas (MIR-339-5p, MIR-7-1-3p, MIR-365b-3p, MIR-454-3p, MIR-194-3p og speil 15b-3p) med metastase utvikling som endepunkt dukket opp, og en miRNA (MIR-101-5p) med endepunkt total overlevelse ble identifisert, men ingen av disse forble signifikant assosiert med enten total-eller metastase overlevelse etter justering for multippel testing. Alle mirnas identifisert av disse analysene ble uttrykt på svært lave nivåer i vår kohort med høyest median uttrykk observert for MIR-454-3p med 187 leser til det laveste for MIR-194-3p med bare 19 leser.
diskusjon
i dette arbeidet, var dypt sekvensering brukes for å kvantifisere miRNA uttrykk i en stor kohort av CRC tumorprøver. Denne tilnærmingen kan bidra potensielle fordeler i global miRNA uttrykket analyse, men innebærer også nye utfordringer når det gjelder dataanalyse, som mengden av data som samles inn etter dyp sekvense inneholder millioner av lyder som må tilordnes til genomet og normalisert [30]. I de 88 CRC pasienter med hell analysert, ble 523 modne miRNAs oppdaget. Andre små RNA sekvenser ble også påvist, men de lave frekvensene deteksjon av andre RNA klasser og genomiske regioner viste at seleksjon for mirnas hadde vært vellykket, og i overensstemmelse med tidligere resultater [29], [31]. I tillegg har utmerket avtalen observert mellom tekniske replikater foreslått tilstrekkelig reproduserbarhet.
De fem mirnas mest rikelig uttrykt i undersøkes CRC kohort var MIR-10a-5p, MIR-21-5p, MIR-22-3p, MIR-143-3p og MIR-192-5p, og alle disse har tidligere vist seg å være dysregulerte i CRC [32] – [38]. Disse mirnas var også blant de høyest uttrykt mirnas i en tidligere studie utført ved hjelp av dyp sekvensering av 8 CRC prøver og tilsvarende normale vev [39]. Interessant, de fem mest uttrykt mirnas sto for så mye som 54% av det totale antall miRNA sekvenser oppdaget. Dette er i overensstemmelse med en tidligere dyp sekvense undersøkelse utført på perifere blodprøver, karakterisert ved at ekspansjons 7 familie utgjorde 77% av den totale miRNA lese tellinger [29]. Den relative betydningen av høy versus lav miRNA uttrykket er vanskelig å tolke, siden fravær eller rikelig nærvær av miRNAs kan representere like viktige biologiske reguleringssignaler. Imidlertid kan overrepresentasjon av et lite antall mirnas innebærer at disse miRNA spiller viktige roller som negative regulatorer av nedstrøms mål og de biologiske veier som berøres av disse målene. De spådde målene for de 5 mest uttrykt mirnas var signifikant assosiert med kreft-relevant trasé, inkludert CRC veien. Blant de forutsagte målene i CRC veien var onkogener, tumor-suppressorer og DNA-reparasjonsgener som er involvert i flere viktige signalbaner blant Wnt, MAPK, cellesyklus, TGF-β, og p53. Forut mål (hMSH2 og hMSH6) var også involvert med downregulating DNA-reparasjonsgener som påvirker mikro og er dermed involvert i mikro ustabilitet veien. Disse resultatene tyder på at det identifiserte fem mest uttrykt miRNA er kreft relevant og sannsynligvis relevant i CRC, men videre undersøkelser er nødvendig for å validere målene og vurdere nedstrøms effekter.
En av de antatte fordelene med dyp sekvense sammenlignet med mikromatriseanalyse og QRT-PCR er forbedret spesifisitet og følsomhet, noe som tyder på at denne fremgangsmåten vil returnere mer korrekte målinger av hver miRNA enn de andre metodene. Når man sammenligner våre tidligere resultater, måling uttrykk for seks miRNA bruker QRT-PCR med dype sekvense data, korrelasjon på den enkelte prøvenivået var dårlig for alle mirnas undersøkt. Deep sekvensering er ofte validert ved QRT-PCR, men omfattende sammenligninger mellom de to tilnærmingene er ikke utført. I en dyp sekvense studie på 9 blærekreft prøver, ble valgt mirnas fra dypt sekvense validert av QRT-PCR, og rapporteres å korrelere godt analysert ved fold uttrykk forskjeller i en bar plott [40]. I en annen studie utført på 10 neuroblastom prøver, koeffisienter sammenheng mellom 0,1 og 1 ble funnet ved å sammenligne summen av miRNA uttrykk fra QRT-PCR og dyp sekvensering [41]. De største avvikene i vår sammenligning mellom QRT-PCR og sekvensering ble funnet for MIR-101 og MIR-145. Den test som benyttes for QRT-PCR og sekvensering var begge i stand til å detektere, men ikke til å skille mellom kjente isoformer av disse mirnas. I sekvense data, ble det ikke nukleotidvariasjoner funnet som kan forklare avvik. I teorien kan fravær av deteksjon av MIR-101 ved QRT-PCR være en følsomhet problemet, mens for MIR-145, mangel på spesifisitet for QRT-PCR-assay kan forklare avvik. Dermed virker det uklart om QRT-PCR kan brukes til validering, siden QRT-PCR og dype sekvense data er generert med ulike metoder og vises på ulike skalaer med variable uttrykk områder, noe som gjør det vanskelig å sammenligne de to datasettene på en pasient -til-pasient.
Et av målene med denne studien var å undersøke sammenhengen mellom miRNA uttrykk og clinicopathological parametere og utfall. Gitt den lave variasjonen hos mellom prøvene, er det ikke overraskende at noen slike foreninger ble oppdaget. Ved hjelp av univariat Cox proporsjonal hazard regresjon ble det ikke mirnas funnet å være assosiert med metastase utvikling eller total overlevelse etter korreksjon for multippel testing. Ingen miRNA ble valgt i LASSO analyse. Lav uttrykk for MIR-592 og høy uttrykk for Mir-10b-5p og MIR-615-3p var assosiert med svulster som ligger i høyre colon forhold til svulster i venstre tykktarm og endetarm. Høy uttrykk for MIR-615-3p var også assosiert med dårlig differensierte svulster. MiR-10b ble tidligere rapportert å være nedregulert i CRC og høy uttrykket var forbundet med avansert pT-stadium [42], men ingen slike foreninger ble påvist i vår kohort. MiR-592 er tidligere blitt funnet å være nedregulert i tumorer med mangelfull mismatch reparasjon sammenlignet med mismatch repair dyktige tumorer [43], [44]. Mangelfull mismatch reparasjon gir opphav til mikro ustabilitet, og i sporadiske CRC, blir mikro ustabil tumorer ofte lokalisert i den høyre side av colon [45], [46]. Dermed vil lav uttrykk for MIR-592 i svulster i høyre kolon i denne studien være i samsvar med tidligere funn, men siden svært lite for tiden kjent om målene i miRNA, avklare dette spørsmålet ville kreve videre studier. MiR-615 utviste den mest slående forskjellen i uttrykket mellom høyre og venstre colon i denne kohorten, og det ble også sterkt uttrykt i dårlig differensierte svulster. Det er få rapporter om uttrykk og funksjon av denne miRNA, men i en studie, ble Mir-615 uttrykk nedregulert når den foreslåtte tumor suppressor NGX6 ble eksperimentelt introdusert i menneske CRC cellelinjen HT29. I vår kohort, 7 av de 10 dårlig differensierte svulster ble plassert i riktig kolon.
