Abstract
Prostata epiteliale celler fra både normale og cancervev, dyrket i tre-dimensjonal (3D) kultur som sfæroider, representerer lovende
in vitro
modeller for studier av normale og kreft -relevant mønstre av epitelial differensiering. Vi har utviklet den mest omfattende panel av miniatyriserte prostata cellekultur modeller i 3D oppdatert (n = 29), inkludert mange ikke-transformert og mest for tiden tilgjengelig klassiske prostatakreft (PRCA) cellelinjer. Hensikten med denne studien var å analysere morfogenetiske egenskaper av PRCA modeller i 3D, for å sammenligne fenotyper, genuttrykk og metabolisme mellom 2D- og 3D-kulturer, og å vurdere deres relevans for pre-klinisk medisiner, sykdom modellering og grunnforskning. Primære og ikke-transform prostata epitelceller, men også flere PRCA linjer, dannet godt differensierte runde kuler. Disse viste sterke celle-celle-kontakter, epitelial polarisasjon, en hul lumen og var dekket av en komplett basal lamina (BL). De fleste PRCA linjer, men dannet store, dårlig differensierte kuler eller aggressivt invaderende strukturer. I PC-3 og PC-3M-celler, godt differensiert sfæroider ble dannet, som så ble spontant transformert til sterkt invasive celler. Disse cellelinjene kan som tidligere har gjennomgått en epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), som er midlertidig undertrykkes til fordel for epitelisk modning av signaler fra den ekstracellulære matriks (ECM). Induksjon av lipid og steroidmetabolisme, epigenetisk omprogrammering, og ECM ombygging representerer en generell tilpasning til 3D-kultur, uavhengig av transformasjon og fenotype. I motsetning til dette ble PI3-kinase, AKT, STAT /interferon og integrinsignalveier spesielt aktivert i invaderende celler. Spesifikke lavmolekylære inhibitorer rettet mot PI3-kinase blokkert invasiv cellevekst mer effektivt i 3D enn i 2D monolagskultur, eller veksten av normale celler. Vår panel av cellemodeller, som strekker seg over et bredt spektrum av fenotypisk plastisitet, støtter undersøkelse av forskjellige moduser av cellemigrering og tumor morfologi, og vil være nyttig for prediktiv testing av anti-cancer og anti-metastatiske forbindelser.
Citation: Härmä V, Virtanen J, Mäkelä R, Happonen A, Mpindi JP, Knuuttila M, et al. (2010) En omfattende panel av tredimensjonale modeller for studier av prostatakreft vekst, invasjon og Drug Responses. PLoS ONE fem (5): e10431. doi: 10,1371 /journal.pone.0010431
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 24 januar 2010; Godkjent: 31 mars 2010; Publisert: 03.05.2010
Copyright: © 2010 Härmä et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning på det finske akademiet til MN (nr 111597). Ekstra midler til OK og JV ble levert av FP6 og FP7 Integrerte Prosjekter PRIMA og EPITRON av EU-kommisjonen. Virkemiddelapparatet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
To-dimensjonale (2D) monolag cellekulturer representere meget reductionist modeller av epitelceller og epiteliale kreftformer, på grunn av tap av fysiologisk ekstracellulære matriks (ECM) på kunstige plastflater, og høye serumkonsentrasjoner. Følgelig cellene mister relevante egenskaper, slik som differensiering, polarisering, celle-celle-kommunikasjon og ekstracellulære matriks-kontakter, mens sårheling, inflammatoriske prosesser, og hyper-proliferasjon er kunstig fremmes. I enlagskultur av prostatakreft (PRCA) linjer, homeostase av udifferensierte tumor stamceller gjennom basal, transitt-forsterkende og terminalt differensiert, hormon-sensitive luminal celler avhenger av celledyrkningsforhold, kalsium og serumkonsentrasjon [1], [2] , og bare dårlig representerer tumorcellebiologi in vivo. Mangelen på en relevant basal lamina (BL), defekte ECM avsetning, og som mangler stromal eller korg komponenter [3] bidra ytterligere til den kunstige natur. Som et resultat av de mest effektive lavmolekylære inhibitorer i monolagskulturer er kjemoterapeutiske midler som er målrettet spredning og mitose. Denne ubalansen bidrar til dårlig prediktiv verdi av sammensatte efficacies mellom
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter. Drug handling som er relatert til celle-celle interaksjon, modning, epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og kreft stamceller (CSC) er sannsynlig å gå ubemerket. Både 3D arkitektur og ECM utøve stor innvirkning på legemidlets effekt [4]. Kjertel epiteliale kreftceller raskt tilpasse seg ulike microenvironments og kan veksle dynamisk mellom alternative veier som regulerer spredning, differensiering og overlevelse.
Utvikling av resistens eller unnlatelse av å svare på cellegifter krever også passende cellekultur modeller. Resistens er ofte knyttet til kreft stamcelle (CSC) hypotese: anti-mitotiske kreft narkotika skåne sakte prolifererende, tumor-regenererende stem- eller stamceller [5] – [7], som til slutt gjen utgjør tumormassen. Dette kan være samtidig med EMT [7] – [10] og øket metastatisk potensiale [8]. Jakten på anti-kreft narkotika har derfor inngått en ny fase der forskere stadig utnytte organotypiske modellsystemer til mer direkte utforske narkotika mål på flercellede organoids, ofte beriket for stamceller [11]. Passende
in vitro
eksperimentelle modeller som er egnet for analyse av CSC homeostase, EMT, invasjon og metastasering, blir stadig mer relevant for kreft medisiner. Disse bør også være kostnadseffektivt og gi tilstrekkelig gjennomstrømming for høyt innhold screening.
Kulturen i kjertel epitel (kreft) celler i renset ECM, som for eksempel kollagen, hydrogeler eller Matrigel, ble etablert for over to tiår siden [12 ]. Matrigel representerer en rekonstituert, laminin-rik basalmembran, som støtter prosesser som celle polaritet, celle-celle- og celle-matriks interaksjoner, og re-ekspresjon av differensieringsmarkører, selv i transformerte linjer [13]. Mammary og prostata epitelceller danne sfæroider, referert til som mammospheres [14] eller prostaspheres [15], respektivt. Normale prostata epitelceller differensieres til godt polariserte hule kuler, et kjennetegn på funksjonelle, glandular epitelceller. Den samme mikromiljøet støtter også cellemigrering, forgrening og dannelse av den karakteristiske acini [16], [17]. I motsetning til kreftceller vises vanligvis et defekt differensiering program, og danner atypiske kuler med uorganisert arkitektur, som demonstrert mest fremtredende for brystkreft [18] – [20]. Genuttrykksmønster av kuler ble vist å korrelere med de karakteristiske fenotyper dannet i 3D kulturer [19], [20] og generell differensiering og aggressiv potensialet for kreft [21], [22]. I likhet med normale epitelceller, kan -PRCA celler også aktivt invadere omgivende Matrigel, selv om deres virkemåte migrasjon er forskjellig fra de normale, fellestrekk eller rør migrasjonsmønster observert i forgrening av normale celler. Fenotypen av kreft invasjon er avhengig av sammensetningen og tettheten til ECM, og kan variere fra amoeboid blebbing, mesenchymale fibroblast-lignende motilitet og flercellede streaming eller kjede migrasjon [23], [24]. Naturligvis invasiv potensialet avhenger også av den genetiske bakgrunnen for -PRCA celler og deres (vanligvis kompromittert) evne til å drive strenge epitel-celle-celle-kontakter. Bryst og andre epiteliale kreftceller danne sylindriske, spindel-lignende celler med potensial til å trekke seg sammen og forlenge, støtte migrasjon gjennom den omkringliggende ECM mesh. Mye mindre er kjent om PRCA. Invasjon er assistert av proteolytiske prosesser og proteaser slik som katepsin [25], matriksmetalloproteinaser (MMP’er [24]), løselige faktorer utskilt av fibroblaster eller tilstedeværelse av fibroblaster seg selv [26], [27], og andre faktorer slik som fibronektin og lysyl oksidase [26]. I denne forbindelse, 3D-modeller av tumor-celle invasjon [28] representere cellulære dynamikk og arkitektur av tumorer langt bedre enn 2D-monolagskulturer i hvilke celler spredt og glir tvers over den plastoverflate. Potensialet for å gjennomgå en EMT og å tilegne seg mesenchymale migrasjon modusene er en annen parameter postulert å bidra til bryst-og PRCA invasjon og bevegelighet [29].
Videre er det uklart om PRCA kuler, spesielt når dyrket i lrECM , viser anrikning av CSC populasjoner (som ofte er forbundet med en EMT), eller utvikle resistens mot kjemoterapi og ioniserende stråling [30], [31]. I det minste ville involvering av CSCs eller EMT forventes å vise en helt annen dynamikk i differensiere 3D kulturer i LrECM, sammenlignet med flytende prostaspheres og 2D monolags forhold [32]. Sist og ikke minst, cellekultur modeller for tumorcelle invasjon er begrenset til noen få mye brukt, potensielt kunstige analyser (Transwell invasjons analyser, ripe sår migrasjon analyser). Siden invasjonen er fundamentalt annerledes under 3D-forhold, noen representative 3D Invasion modeller representerer en veritabel nyhet [26, 28 og 33].
Vi rapporterer her utvikling og morfologiske karakterisering av miniatyriserte 3D cellekultur modellsystemer, utnytte et panel av 29 prostatacellelinjer. Et utvalg av de mest representative linjene ble deretter videre preget av genom-wide transkriptom analyser og systembiologi å identifisere viktige veier, signalmolekyler, Gene nettverk og mulige narkotika mål kritiske for vekst og invasjon av ondartede PRCA celler. Videre bioinformatiske verktøy for bildeanalyse å kvantifisere dynamiske fenotypiske funksjoner som invasive strukturer, spheroid form eller narkotika reaksjoner har blitt utviklet.
Materialer og metoder
Cellelinjer og monokulturer
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP ble kjøpt fra ATCC eller forespurt fra opphavs laboratorier (Tabell S1). Normale epitelceller og derivater (PREC, EP156T, RWPE-en, RWPE-2, RWPE-2 /w99, WPE1-NB14, PWR-1E, PZ-HPV-7 og CA-HPV-10) ble dyrket i keratinocyte serum- Gratis Medium (KSFM, Gibco), supplert med 12,5 mg /l bovin hypofysen ekstrakt og 1,25 mg /l EGF. For 3D-kulturer, ble 2% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) tilsatt. De fleste -PRCA linjene ble dyrket i RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), supplert med 10% FBS. MDA-PCA-2b og NCI-H660-celler ble dyrket i Hams F12-medium (Gibco) med 20% FBS, 25 ng /ml choleratoxin, 10 ng /ml EGF, 5 uM phosphoethanolamine, 0,1 ng /ml hydrokortison, 45 nM selenic syre og 5 ug /ml insulin (alt fra Sigma). Alle celler ble formert ved 37 ° C i cellekulturbetingelser standard (5% CO2, 95% luftfuktighet). Identitet av cellelinjer ble bekreftet av arrayCGH (komparativ genomisk hybridisering) på Agilent 244 k menneskelige genom arrays, etter 10-15 passasjene celler ble avviklet.
miniatyriserte 3D kulturer.
Celler ble innebygd mellom to lag av Matrigel på ubelagte angiogenese u-objektglass (Ibidi GmbH, Tyskland): bunn brønner ble fylt med 10 ul av Matrigel /kulturmedium (01:01; 50%) og polymerisert ved 37 ° C i 30 minutter. Cellene ble deretter sådd ut på 20.000 celler /ml tetthet (~1000 celler /brønn). Etter festing (1-2 timer ved 37 ° C), ble cellene dekket med et andre lag av Matrigel /kulturmedium (1:04, 25%), tillates å polymerisere over natten ved 37 ° C. Cellekulturmedium ble skiftet hver andre dag.
3D bulk kulturer for RNA ekstraksjon.
Prostaspheres ble dyrket i Millicell hengende cellekultur inserts med 1,0 mikrometer PET gjennomsiktige membraner (Millipore) på 6-brønnen plater (Costar). Membranene ble forhåndsbelagt med Matrigel /medium (01:01) og inkubert ved 37 ° C i 1 time, for å forhindre festing til membranen. Cellesuspensjonen ble blandet med 01:04 Matrigel, overført til den belagte brønnen, og polymerisert over natten ved 37 ° C. Cellene ble matet annenhver dag med friskt medium nedenfra.
Cell fiksering, immunfluorescens merking og bildebehandling.
miniatyrisert 3D kulturer ble løst innen mikro, bruker 4% paraformaldehyde, supplert med 0,8% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 5 mM EGTA og 1 mM MgCl
2 i 15-20 minutter ved RT. Faste kulturer ble vasket 3 ganger med PBS og blokkert i 1 time med 20% hesteserum. Kulturer ble inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (som er oppført i Tabell S2), vasket med PBS, og inkubert ved værelsestemperatur i 4 timer med sekundære antistoffer og Hoechst nukleær flekk (1:5000).
3D strukturer ble farget med Calcein AM levende celle fargestoff (Invitrogen). Confocal tredimensjonale bildene ble tatt ved hjelp av Zeiss Axiovert 200 M med roterende disk confocal enhet Yokogawa CSU22 og en Zeiss Plan-Neofluar 5 × objektiv. Z-stabler ble kjøpt med en step-størrelse på 19 mikrometer. Intensitet anslagene ble skapt av SlideBook 4.2.0.7 og NIH ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/), videre analysert med VTT Acca programvare (sensitivitet 10; terskel 5, strukturer mindre enn 500 piksler i området /størrelse filtrert ute). Boksplott ble visualisert med R. 20x fase-kontrast time lapse bilder ble ervervet med Incucyte (Essen instrumenter), pre-behandlet med ImageJ og analysert med VTT Acca (sensitivitet 30; terskel 5, strukturer mindre enn 1000 piksler i området filtrert ut) .
RNA-ekstraksjon og mikromatriser.
3D bulk kulturer ble vasket med iskald PBS, membraner skåret med en skalpell, og kuler overføres til 6-brønns plater. Gelene ble blandet kraftig med 9 ml av 5 mM EDTA i PBS, overført inn i 15 ml Falcon-rør, og inkubert på en bordplate rocker i 45 min for å løsne fra Matrigel. Prostaspheres ble sedimentert ved sentrifugering og lysert med RLT-buffer (Qiagen). Celler formert i monolaget ble lysert ved 90% samløpet, direkte fra 10 cm cellekultur retter med RLT buffer. Total RNA (fra biologisk replikat) ble ekstrahert med RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll. 300 ng RNA ble forsterket med Ambion er Illumina TotalPrep RNA Amplification kit. IVT Reaksjonen ble utført over natten (~16 h) for å gi tilstrekkelig biotinylert cRNA. RNA og Crna konsentrasjoner ble målt med en Nanodrop ND-1000, ble generelle kvaliteten overvåket med BioRad Experion® elektroforese stasjon. 750 ng av cRNA ble hybridisert på Illumina s Sentrix HumanRef-8 v3 BeadChips, ved 58 ° C over natten. Hybridiserte cRNA ble påvist med 1 mg /ml Cyanine3-streptavidin (GE Healthcare biovitenskap), og arrays skannet med Illumina BeadArray Reader. Data ble kvalitetssikret og hentet ved hjelp av Illumina GenomeStudio programvare, uten normalisering eller bakgrunn subtraksjon.
Mikromatrise dataanalyse.
Rå microarray data var quantile-normalisert ved hjelp av bioconductor R pakken «beadarray». Normaliserte data ble videre behandlet ved hjelp av en varians og intensitet filter. Statistisk analyse av differensial genuttrykk ble utført ved hjelp av limma og Lumi R /Bioconductor pakker. Terskelen for dette uttrykket var q 0,05 etter en Benjamini-Hochberg multippel testing korreksjon. Normaliserte Illumina genuttrykk data for hele panelet eksperimenter har blitt sendt til GEO (Gene uttrykk Omnibus) som studerer GSE19426
Data ble så brukt i to forskjellige moduser. Å vurdere relative endringer av genuttrykk mellom 2D og 3D eksperimenter, eller forskjellige tidspunkter i 3D-kultur, betyr normaliserte verdier i 3D, ble subtrahert fra gjennomsnittsverdiene av replikater i 2D monolagskultur og prosenter beregnet. Log (2) forvandlet 2D /3D-forhold ble deretter benyttet for clustering og heatmap generasjon (Cluster 2.11 og Treeview 1,60, Stanford University), og genet ontologi analyse (GO, DAVID, https://david.abcc.ncifcrf.gov/) . K-means ble brukt til å trekke representative varmekart basert på 2D /3D-forholdet data, generere 12 noder (100 iterasjoner). Den Gene Set Analysis (GSA) pakken i R ble brukt til å definere betydelig beriket genet kategorier, her de «Maxmean» statistikk ble brukt til å beregne berikelse score, og permutasjon basert p-verdier ble avledet fra 1000 bootstrap gjentak. En falsk funnrate (FDR) korreksjon ble også brukt som et mål på relevans. Gensettene benyttes for analyse ble oppnådd fra Molecular Signaturer Database (MSigDB, Broad Institute), inkludert posisjon, kuratert, co-uttrykk nabolag, GO, og evolusjonært konserverte transkripsjonsfaktor mål.
For det andre, normalisert men ellers un-behandlet genuttrykk data ble brukt for å definere gen signaturer som korrelerer med fenotypiske egenskaper (rund /normal, masse, stel fenotype). Prinsipal komponent analyse (PCA) og plotting av informative gener som korrelerer med sfæroide morfologi ble utført basert på spesialiserte R skript. Gener som representerer den største andelen av variansen ble valgt basert på ANOVA.
Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) og sammensatte utvalg.
uttrykt forskjellig gensamlingene (2D /3D-forhold) ble lastet opp til IPA til utføre genet nettverk analyser og identifisering av potensielt informative sentrale «hub» gener. Spesifikke lavmolekylære inhibitorer mot visse huber eller hub gener og trasé ble kjøpt fra Tocris og Sigma-Aldrich (se nedenfor). Andre og uavhengige kilder til stoffet /målrette informasjonen ble også brukt til samme formål (DrugBank, https://www.drugbank.ca, Matador https://matador.embl.de)
RT-PCR. validering.
2 mikrogram total RNA ble revers transkribert med Invitrogen Hevet II revers transkriptase i 50 pl. cDNA ble fortynnet 1/10. QRT-PCR ble utført i tre paralleller med 7900HT Fast Sequence Detection System (Applied Biosystems) i 96-brønn eller 384-brønners plateformat, 8 ul /brønn. PCR primere og prober ble utformet basert på Roche Universal Probe Bibliotek, ble oligonukleotider bestilt fra Sigma-Aldrich. Primere ble anvendt ved 300 nM, prober ved 100 nM konsentrasjon; med 2x TaqMan® Universal PCR Master Mix. PCR-kjøringer ble analysert ved bruk av Applied Biosystems SDS programvare
Protein lysat mikromatriser (LMA)
Prostaspheres ble samlet på dag 3, 6, 8, 10 og 14..; i henhold til følgende protokoll: mikrobrønnene ble vasket med PBS, Matrigel blandet med is-kald 5 mM EDTA i PBS, overført til v-bunn 96-brønns plate (Greiner), og inkubert på is i en bord-ryster i 30 minutter. Sfærer ble sedimentert ved sentrifugering og lysert i LMA-buffer (0,2% SDS, 100 mM Tris, 10 mM DTT). Monolags celler ble høstet i LMA-buffer ved 90% konfluens i 10 cm plater. For hvert tidspunkt ble to biologiske replikater trykt på en enkelt tabell. Trykking, farging, scanning, bakgrunn subtraksjon, for å normalisere relativ p-aktin-signalet og dataanalyser ble utført som beskrevet tidligere [34].
Western blotting.
Proteinprøver fra kulturbrønnene var oppsamlet som beskrevet fra mikrobrønnplater, og lysert i WB-buffer (25 mM Hepes pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,3, 0,5% Triton X-100, 20 mM β-glycerofosfat, 100 mM ortovanadat, 0,5 mM PMSF og 1 mM DTT). Proteinkonsentrasjon ble målt ved Bradford-analysen, og proteinene separeres ved SDS-PAGE med ferdigstøpte personsøker-geler (Lonza), overført på nitrocellulose Protran overføringsmembran (Whatman), og blottet med de primære antistoffer som er oppført i Tabell S3. Multiplex inkubasjon med tre antistoffer ble benyttet for å gi plass til den lille totale mengden av proteiner ekstrahert fra miniatyriserte kulturer. Antistoffer ble detektert med Alexa infrarøde dye-konjugert sekundære antistoffer (Invitrogen), og membraner skannet med Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).
Medikamentell behandling i 3D.
forbindelser ble bestilt fra SIGMA eller Tocris Inc., og oppløst i den aktuelle bilen (DMSO, etanol, 1 x PBS) i henhold til produsentens instruksjoner. Rekombinante humane kjemokiner, cytokiner, og funksjons-blokkerende antistoffer ble bestilt fra R 10x objektiv), anskaffe en image /h
celleproliferasjon analyser
Celler ble sådd på 384-.. vel plater 24 timer før medikamentene ble lagt til. Etter 72 h antall levende celler ble vurdert med CellTiter Blue® celleviabilitet Assay (Promega) i henhold til produsentens protokoll. Fluorescerende signal ble kvantifisert med seg Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer).
Resultater
Normal prostata epitelceller og PRCA linjer danner karakteristiske morfologi i Matrigel
Normal prostata og prostatakreft (PRCA) cellelinjer klarer å skille og danne flercellede strukturer i rent kollagen rike ekstracellulære matrise (Figur S1). I kollagen, både normal- og svulstceller dannes bare løse aggregater, med dårlig eller ingen celle-celle kontakter, ofte viser en fibroblast-lignende vekstmønster. I kontrast, Matrigel sterkt støtter både vekst og differensiering av normale og PRCA kuler. Matrigel har dyptgripende virkninger på alle cellelinjene som ble testet, og med få unntak; dannelse av relevante flercellede strukturer støttes. Spheroid formasjonen i Matrigel ble vanligvis initiert av enkeltceller. Sfæroidene som dannes i Matrigel generelt falt inn i fire kategorier, morfologiske tilpasset fra [19], [35] (figur 1. Figur S2).
De fleste konstruksjoner har falt inn i kategoriene rund, masse, stel, eller grape- like. Noen cellelinjer ikke klarte å danne kuler i Matrigel men vedvarte som enkelt levende celler for inntil to uker (enkelt fenotype). De fleste kuler ble fotografert på dager 9-10 etter vaksinasjonen. PC-3 kuler, vist som runde fenotype på dag 9, gjennomgår en metamorfose til invasiv /stel fenotype på dag 13. Det samme skjer til PC-3M på et tidligere tidspunkt (dag 5-8).
Forgrening /Round fenotype.
Normal primære prostata epitelceller (PrECs) og ikke-transform linjer som RWPE-en og EP156T celler dannet runde kuler etter 6-10 dager i kultur (figur 1). Normale PrECs og in-vitro-udødeliggjort cellelinjer så som RWPE-1 og PWR-1E-celler samtidig som dannes forgrenings acinar og runde sfæroide strukturer, aktivt migrere inn i det omgivende ECM i form av store celleaggregater (figur 2a-d). EP156T celler viste ingen eller få forgrening strukturer. Runde strukturer generelt utviklet en robust basal lamina (BL), innkapsling av både kuler og acinar strukturer (figur 2, figur S2, Figur 3g-m). Overraskende, tumorlinjer DU145, PC-3 og PC-3M-celler også utformet rund og godt differensierte, polariserte kuler (figur 2e), omgitt av en komplett BL, og ofte inneholdende et hulrom (PC-3, Figur 3e + r) . I tillegg, PC-3 kuler inneholdt ofte en intern celle masse minner om strukturer sett i PIN (prostata intraepitelial neoplasi). Immunfarging for stram-junction proteiner som ZO-1 (ikke vist) og F-aktin (figur 3a-c) viste generelt svært robust celle-celle-kontakter og cellepolarisering i runde kuler som dannes ved både normale og tumorceller.
A) Fasekontrast bilde av forgrenings strukturer dannet ved RWPE-1-celler, B) acinar struktur dannet ved RWPE-en farget med et antistoff mot laminin B1. C) Forgrening eller klaselignende strukturer dannet av primær prostata epitelceller (prec). D). Blandet forgreninger og masse fenotype strukturer, dannet av PWR-1E celler. E) Rundballe strukturer dannet av PC-3 celler på dag 9, levende celle farging med calcein. F) Morfologisk omskaping av runde kuler i invasive strukturer på dag 13. G) Fase-kontrast bilde av invasive PC-3 strukturer rundt dag 13. H). Farging av PC-3 filopodia med et antistoff spesifikt for den aktive formen av integrin beta 1 (ITGB1), illustrerer tett dekorasjon av spindel-lignende cellestrukturer.
Alexa488-merket phalloidin ble brukt til å oppdage F aktin og Hoechst flekk å merke kjerner (blå). RWPE1, DU145 og PC3 cellene vise uttrykk for EMT-relaterte mesenchymale markører, uavhengig av fenotype (PC-3 celler; runde på dag 9, stel på dag 14)
Mass fenotype
..
flertallet av PRCA (LNCaP, 22rV1, MDA-PRCA 1, UM-SCP1, CWR-r1, LAPC-4) og to
in vitro
transformerte linjer (PWR-1E, RWPE-2) generert store, uregelmessige kuler med ofte ufullstendige eller mangler BL, også mangler en hul hulrom (Figur 3d + k). PWR-1E var den eneste masse-fenotype cellelinje i stand til forgrening /acinar morfogenese (figur 2d). Luminal keratins KRT8 og KRT18 var alltid sterkt uttrykt (tabell S3). Celle-celle-kontakter, modning og polarisering var generelt mindre uttalt sammenlignet med runde kuler, gjenspeiles i de ofte nyreformede uregelmessige kuler (figur 1). Masse fenotype strukturer gjorde vanligvis ikke viser invasjonen av lrECM; Dannelse av filopodia eller pseudopodia ble konsekvent observert i 22rV1 og noen ganger i LNCaP og RWPE-2 cellelinjer. I LNCaP kuler ble cellene ofte observert å forlate sfæroide strukturer på nettstedene til ufullstendig BL dekning (figur S2).
Grape-lignende fenotype.
Bare en cellelinje, 1013L, konsekvent dannet løse klynger av celler med spesielt dårlig celle-celle kontakter, mangler noen BL. LAPC-4 celler dannet både masse og drue-lignende strukturer. Ingen invasive egenskaper ble observert i disse cellelinjene.
stel «invasive» fenotype.
in vitro transformerte cellelinjer RWPE-2 /w99, wpe-1 /NB14, og svulsten linjer ALVA-31 og ALVA-41 dannet stel eller invasive strukturer, preget av spindel-lignende filopodia (figur 2 g) og den raske migrasjon av kjeder av celler gjennom den omkringliggende ECM. Invasive strukturer dannet var nesten utelukkende flercellet og viste en kjede-lignende invasjon modus. Fibroblast-lignende, ble mesenchymale invasjon av enkeltceller observert bare sporadisk.
in vitro
transformerte linjer RWPE-2, RWPE-2 /w99 og WPE1 /NB14 samtidig dannet stel strukturer og runde kuler, som indikerer heterogen sammensetning av disse cellelinjene. Av disse RWPE-2 /w99 representert cellelinjen med den mest konsekvente stel fenotype, og ble valgt for videre eksperimenter. Udødeliggjort prostata stromale celler (WPMY-1) og tumor-avledede, primær stromale celler (ikke vist) som også er dannet stel-lignende strukturer, men mangler hurtig motilitet og invasive egenskaper.
Invasiv bryteren.
Round og godt differensierte, polarisert kuler ble dannet av PC-3 og PC-3M celler, men gjennomgikk en spontan transformasjon mot invasiv morfologi rundt 10-13 og 6-8 dager i 3D, henholdsvis (figur 2e + f, supplerende invasjon Movie S1). Utbruddet av morfologiske transformasjon til stel, invasiv fenotype var avhengig av celletetthet. Transformasjon kan bli midlertidig forsinket og til og med delvis tilbakestilt ved fôring frisk medium, men til slutt fortsatte å utvikle seg til alle strukturer ble grundig transformert og bare stel strukturer forble (figur 2g). Invasive strukturer og filopodia dannes til og med før invasjon sterkt uttrykt den aktive formen av reseptoren laminins-integrin beta-1, noe som indikerer sterke kontakter til den ekstracellulære matriks som en forutsetning for invasive prosesser (figur 2 H). Samtidig blir BL av transformerte strukturer stadig uklar og oppløst (figur 3m). Sterk ekspresjon av mesenchymale markører vimentin VIM og Fibronectin fn1 (figur 3o-y), observert i ikke-invasiv RWPE-1 (heterogene) og DU145, men også i PC-3-celler, ikke korrelerer med stel fenotype. Videre uttrykk for VIM og FN1 ble ikke økt etter invasiv transformasjon av PC-3 og PC-3M celler (figur 3s + y)
«Single» fenotype.
Noen kreft linjer ( Vcap, DuCaP, NCI-H660 og MDA-PCA 2b) ikke klarte å danne kuler, men fortsatte som enkeltceller ( «single» eller «entall fenotype») i inntil to uker. Interessant, var alle disse cellelinjene positivt for ETS-transkripsjonsfaktorfusjonsbegivenheter eller rearrangements (TMPRSS2-ERG i H660, Vcap og DuCaP, en balansert ETV1 omorganisering i MDA-PCA 2b). Genekspresjon analyser av VCap celler i Matrigel indikerte at cellene kan gjennomgå terminal differensiering eller begynnende alderdom når innleiret i Matrigel (data ikke vist). Uttrykk for de TMPRSS2-ERG fusjon genet og spredning relevante gener ble redusert i Matrigel. Men veksten av Vcap og DuCaP var ikke begrenset i kollagen type I gels; og genuttrykksmønster i Col jeg var begrenset (ikke vist).
Dynamiske endringer av genuttrykk i respons til Matrigel korrelere med normal, transformert og invasive egenskapene
LrECM og dannelse av kuler indusere grunnleggende endringer i cellebiologi, protein og mRNA genuttrykk av PRCA celler. Om 3400 mRNA ble uttrykt forskjellig mellom 2D- og 3D-forhold, men ikke konsekvent på tvers av alle cellelinjer og alle tidspunkter. Tre generaliserte mønster av forandret genekspresjon ble observert over platen av cellelinjer (figur 4a + b). Endret uttrykk av utvalgte gener ble validert ved QRT-PCR (figur 4c). Faktorer av differensial uttrykk, noe som bekreftes av QRT-PCR, var generelt høyere i forhold til array data. GO analyser og GSEA avdekket signifikante beriket funksjonelle genet kategorier for de fleste av klynger (Tabeller S4, S5 og S6).
A) Heatmap, illustrerer 12 klynger generert av K-betyr algoritme. Klynger 1 + 2 representerer gener utelukkende rammet i normale celler (PREC, EP156T). Klynger 6-8 representerer gener likeledes indusert eller undertrykt i alle cellelinjene som reaksjon på 3D-cellekultur i Matrigel 3D, uten hensyn til fenotype, eller transformasjon. Klynger 9-12 inneholder gener karakteristiske for stel /invasive typen cellelinjer (ALVA31, PC3, PC3M, RWPE2 /w99), eller som induseres under den spontane konvertering av runde til stel strukturer (f.eks PC3, dag 13 og 15).
