Abstract
Bakgrunn
To signalmolekyler som er attraktive for målrettet terapi er epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor gamma (PPARy). Vi undersøkte mulig crosstalk mellom disse 2 veier, spesielt i lys av den siste bevis implicating PPARy for kreftbehandling.
hovedfunnene
Som evaluert av MTT-analyser, gefitinib (EGFR-hemmer) og dim C (PPARy agonist) hemmet veksten av 9 blærecancercellelinjer på en doseavhengig måte, men med variabel følsomhet. I tillegg kombinasjonen av gefitinib og DIM-C viste maksimal inhibering av celleproliferasjon sammenlignet med hvert legemiddel alene. Disse funnene ble bekreftet
in vivo
, hvor kombinasjonsbehandling maksimalt hemmet tumorvekst i motsetning til hver behandling alene når sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,04). Induksjon av PPARy uttrykk sammen med atom akkumulering ble observert i respons til økende konsentrasjoner av gefitinib via aktivering av transkripsjonsfaktoren CCAT /enhancer-bindende protein-β (CEBP-β). I disse cellelinjene, DIM-C signifikant sensitivblærecancercellelinjer som var resistente mot EGFR-inhibering i en tidsplan-spesifikk måte.
Konklusjon
Disse resultater antyder at PPARy agonist DIM-C kan være et utmerket alternativ til blære svulster som er resistente mot EGFR hemming og kombinasjonen effekt kan oppnås på en tidsplan-spesifikk måte
Citation. Mansure JJ, Nassim R, Chevalier S, Szymanski K, Rocha J, Aldousari S, et al. (2013) En ny mekanisme av PPAR gamma Induksjon via EGFR Signale Utgjør Rational for kombinasjonsbehandling i blærekreft. PLoS ONE 8 (2): e55997. doi: 10,1371 /journal.pone.0055997
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 21 september 2012; Godkjent: 03.01.2013; Publisert: 8. februar 2013
Copyright: © 2013 Mansure et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Cancer Research Society. (https://www.src-crs.ca/en-CA) W. Kassouf er en mottaker av en klinisk stipendiat pris fra FRSQ. (https://www.frsq.gouv.qc.ca/en/index.shtml). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nesten alle pasienter med metastatisk blærekreft dør av sykdom, med median overlevelse på 18 måneder, selv med de beste tilgjengelige kjemoterapeutiske regimer. Som forståelse av biologi urothelial karsinom (UC) forbedrer, nye tilnærminger må undersøkes. To signalmolekyler som er attraktive for målrettet terapi er den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR), og peroksisom proliferator-aktivert reseptor γ (PPARy). Hemming av EGFR-funksjonen er svært attraktiv blant det brede utvalget av biologiske mål innblandet i urothelial karsinom (UC) progresjon. Selv om mekanismen ved hvilken EGFR regulerer tumorbiologi i blærekreft ikke er klart definert, har det blitt demonstrert at EGFR-signalering regulerer celleoverlevelse, proliferasjon, differensiering og invasjon [1]. Videre er EGFR implisert i tumorindusert angiogenese og metastase [2]. Men kliniske studier med EGFR-hemmere i hode og hals, lunge og tykktarm kreft viste at bare et mindretall av pasientene syntes å dra nytte av denne tilnærmingen. I sammenheng med ikke-Lie Cancer lungeceller (NSCLC), ble det vist at klinisk respons var knyttet til aktivering av mutasjoner innenfor EGFR-tyrosinkinase-domene, hvilket antyder at bedre forståelsen av de biologiske effektene av EGFR-inhibitorer for kreft vil bidra til å identifisere tumorer som responderer på terapi [3], [4]. Selv om ingen av 17 menneske UC cellelinjer eller noen av 75 primærsvulster evaluert ved M. D. Anderson Cancer Center inneholdt aktivering av EGFR kinase domene mutasjoner [5], EGFR-hemmere blokkeres cellecyklusprogresjonen i 6/17 UC cellelinjer. Vi har vist at høy EGFR-ekspresjon er assosiert med en aggressiv fenotype [6], og at modulering av GSK-3β kan være en prediktor for respons på EGFR-inhibitorer i blærekreft [7]. Vi tror at EGFR er fortsatt en sterk signalaksen i utviklingen av blærekreft der dens hemming kan ha nytte selekterte pasienter.
En annen reseptor av interesse er PPARy, en ligand-reseptor og et medlem av den nukleære reseptor superfamily av transkripsjonsfaktorer [8], [9]. Viktigere, spiller PPARy en viktig rolle i kreftutvikling. PPARy er sterkt uttrykt i tumorprøver fra forskjellige nettsteder, inkludert blærekreft (anmeldt i referanse [10]). PPARy er en interessant mål for cancerterapi, ikke bare på grunn av sin forhøyet ekspresjon i tumorer, men også fordi PPARy aktivering resulterer i nedsatt celleformering, redusert G
0 /G
1 til S-fasen progresjon, økt terminal differensiering, og apoptose [11], [12], [13]. Videre, PPARy-agonister er potente angiogeneseinhibitorer
in vitro
og
in vivo
, delvis på grunn av nedregulering av VEGF [14], [15]. Nylig ble en ny klasse av PPARy-agonister, 1,1-bis (3′-indolyl) -1 – (
p
-substitutedphenyl) metaner (PPARy-aktiv DIM-Cs), har blitt utviklet og vist til være betydelig mer potent enn den forrige generasjonen av narkotika. Vi publiserte den første rapporten om betydelig antitumorigenic aktivitet av PPARy-aktiv DIM-Cs i UC celler
in vitro Hotell og
in vivo product: [16]. Bruk av potente PPARy-aktiv DIM-Cs var attraktiv og garanterer videre evaluering i behandling av UC.
En tidligere studie har vist at PPARy-agonister øke gefitinib er antitumor aktivitet, muligens mediert gjennom induksjon av PTEN uttrykk
i vitro product: [17]. I tillegg curcumin ble vist å indusere PPARy uttrykk og hemme spredning i leverstel celler [18]. Andre har vist at curcumin kan også hemme EGFR aktivering og disse funnene ytterligere underbygge potensialet crosstalk mellom de to signal akser av interesse.
Formålet med denne studien er å undersøke crosstalk mellom disse to signal akser som de deler noen vanlige nedstrøms signal effektorer og vurdere om kombinasjon av PPARy agonist og en EGFR-hemmer kan overvinne motstand mot EGFR terapi i blærekreft.
Materialer og metoder
Cell Culture
UC cellelinje 253J BV ble generert fra 253J humane UC cellelinje som tidligere beskrevet [19] og ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Colin PN Dinney fra M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas. UM-UC serie urothelial kreft cellelinjer brukt i denne studien ble genotypisk preget og levert av prøven Kjerne i urin spesialiserte programmer for Research Excellence i blærekreft ved MD Anderson Cancer Center [20].
Drugs
Gefitinib (Iressa ZD1839) ble levert av Astrazeneca, London, Storbritannia) og muntlig tilgjengelig PPARy-aktiv DIM-C ble sjenerøst gitt av Dr. S. Trygg, Houston, TX som tørt pulver.
Cell Proliferation Assay
blærekreft-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av gefitinib (0,001 uM til 100 uM) og DIM-C (0,01 uM til 10 uM) i EMEM er supplert med 10% FBS i 48 hs Celleproliferasjon ble evaluert ved anvendelse av MTT-analyser (Sigma-Aldrich, Canada). Den GI50-verdien ble definert som den midlere konsentrasjon av medikament som genererte 50% av veksthemning.
Western Blot analyse
Cellene ble høstet ved ca 75% til 80% konfluens i lyseringsbuffer (RIPA ) og en cocktail av fosfatase og proteasehemmere (Roche Diagnostics, Tyskland). Proteiner ble underkastet SDS-PAGE, overført på nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA) ved semidry elektroblotting. Primære monoklonale antistoffer [EGF reseptor (15F8), tubulin og b-aktin (Cell Signaling Technology, New England, MA)] og PPARy (sc-7273, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) ble brukt til å oppdage band av interesse. I tillegg ble de følgende kanin-antistoffer fra cellesignalisering brukt: Akt; fosfor-Akt (Ser473); GSK-3β; fosfor-GSK-3β (Ser9); p21 Waf1 /Cip1; p44-42 MAPK (ERK1 /2); fosfor-P44 /42 MAPK (ERK1 /2). Anti-kanin og anti-mus immunoglobuliner (IgG) som er koblet til HRP /pepperrot ble anvendt som sekundære antistoffer i henhold til det primære antistoff.
Immunofluorescence
Celler dyrket i åtte-brønns plastikk kamre ble vasket på isen med kald PBS som inneholder proteasehemmere (Roche Diagnostics, Tyskland) og festes med 3,7% paraformaldehyde. Celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av gefitinib (0, 2, 4 og 8 pM) i 24 t og deretter inkubert med muse-monoklonalt PPARy primære antistoff (1:50) over natten. Immunfluorescens ble avslørt ved hjelp av anti-mus-antistoffer koblet til FITC (Alexa Fluor 488) eller rhodamin (Cy3; Invitrogen). 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ble anvendt for å farge kjernene. Photomicrographs ble tatt med en omvendt Olympus IX-81 mikroskop utstyrt med en CoolSnap HQ digitalkamera og ImagePro + programvare (versjon 5.0.1, Media kybernetikk).
RNA Isolation og Real Time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), i henhold til protokollen gitt av produsenten. Syntesen av cDNA ble utført ved anvendelse av Quantitec Reverse Transcription Kit (Qiagen, Mississauga, ON). For RT-PCR forsterkning, ble validert primere fra Qiagen (Hs_CEBPB_2_SG QuantiTect Primer analysen QT00998494) brukes. Ingen genomisk DNA-forurensning eller pseudogener ble detektert ved PCR uten revers transkripsjonstrinn i den totale RNA brukes. β aktin ble benyttet som en intern kontroll. Reaksjonene startes ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 10 s, 60 ° C i 20 sek. Smelte toppene av PCR-produktene ble bestemt ved hjelp av varme-denaturering i løpet av en 35 ° C temperaturgradient på 0,2 ° C /s 60-95 ° C. Syklus tall som krysser en vilkårlig terskel (
C
t) ble bestemt med MyIQ systemprogramvaren, versjon 1.0.410 (BioRad, CA, USA). Brett endring i mål mRNA i forhold til p aktin ble beregnet som følger: Brett endring = 2
-ΔΔ
C
t der ΔΔ
C
t = (
C
t
mål –
C
t β aktin)
tid
X Anmeldelser – (
C
t
mål –
C
t β aktin)
tiden 0 tid
X
er tidspunkt etter 3 hs gefitinib. Tid 0 representerer eksperimentet starttid (ingen narkotika tilføyd).
Blære tumorxenotransplantater
Kvinne hårløse mus (kjøpt fra Charles Rivers, Wilmington, MA) ble injisert subkutant med KU-7 celler (10
6 celler per injeksjon). Dyrene i hver serie (10 mus pr gruppe) ble randomisert og overdratt til behandling og et placebo. DIM-C ble gitt 60 mg /kg 3 ganger per uke og gefitinib ble gitt 2 mg /dag, 5 ganger per uke. Alle legemidler og placebo ble gitt ved oral sonde. Behandlingen ble fortsatt i 4 uker, og hvorpå tumorer ble høstet og veiet. Svulster var snap-frosset i flytende nitrogen for videre analyse.
Denne undersøkelsen ble utført i henhold til Standard Operating Procedures for Pleie og bruk av forsøksdyr i McGill University Animal Care Committee. Protokollen ble godkjent av Facility Animal Care komité for forskning McGill University Health Center (Permit Number: 5428). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Immunohistochemistry
Serie deler av tumorxenotransplantater fra mus behandlet med placebo og kombinasjonsbehandling (gefitinib pluss DIM-C ) ble inkubert over natten ved 4 ° C, med primære spesifikke antistoffer mot PPARy (sc-7273 monoklonalt IgG
1 antistoff 1:1000 fortynning, Santa Cruz, CA, USA), p21 (12D1 kanin antistoff 1:100 fortynning, cellesignalering, MA, USA). Polyklonalt geit-anti-kanin-IgG sekundært antistoff, konjugert med HRP ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Color utvikling ble utført med DAB substrat (Sigma Aldrich, Canada), i henhold til produsentens instruksjoner. Immunfarging ble evaluert i en semikvantitativ metode basert på gjennomsnittet av fem foci på prosentandel av levedyktige celler som viser positiv uttrykk. Prøvene ble scoret basert på intensiteten av antistoff kjernekraft og cytoplasma farging i hvert lysbilde. Verdier ble sammenliknet med uparet Student t-test.
Microarray analyse
blæren svulster xenografter, ble sectored farget av hematoksylin og eosin og svulstene ble kartlagt for ytterligere isolasjon. Totalt RNA ble ekstrahert som tidligere beskrevet. RNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop-ND1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) og kvalitet ble overvåket med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Genome Quebec Innovation Center, CA). Microarray analyser ble utført ved McGill University og Genome Quebec Innovation Center, ved hjelp av Illumina BeadArray ™ -teknologi. Den HumanHT-12 Expression BeadChip ™ ble brukt, og inneholdt mer enn 22.000 prober fra NCBI RefSeq database, noe som gir høyere gjennomstrømning behandling av 12 prøver per brikke. Det er en dekning av 99,99% av alle kuletyper på en gitt HumanHT-12. TotalPrep RNA Amplification kit fra Ambion ble brukt til å utføre en runde med forsterkning 50-500 ng av total RNA. CDNA syntese og
in vitro
transkripsjon forsterkning ble etterfulgt av hybridisering. De BeadChips ble fotografert ved hjelp av Illumina er BeadArray eller iscan leseren. Statistisk analyse og visualisering av data fra microarray eksperimenter ble utført ved hjelp av programvarepakken FlexArray versjon 1.6 utviklet og levert av Genome Quebec. Funksjonelle og signalveien analyser ble vurdert ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare.
Statistical Analysis
Alle data ble analysert ved hjelp av Stata versjon 10.0 programvare. Resultater fra
in vivo
ble sammenliknet med gjentatt tiltak ANOVA og Fischer eksakte test. P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Baseline Expression of PPARy og EGFR i et panel av urothelial carcinoma cellelinjer
Vi har tidligere rapportert at hemming av. EGFR-signalisering akse og aktiveringen av PPARy aksen både er effektive i signifikant inhibering av proliferasjon av humane karsinomceller via forskjellige reaksjonsveier, delvis konvergerende til PI3K /Akt, cyklin D1, og cyklin-avhengige kinase-inhibitorer [7], [16]. I vårt tidligere arbeid, har vi vist betydelig uttrykk av hennes familiemedlemmer på tvers av ulike UC cellelinjer [7]. For ytterligere å undersøke for interaksjon mellom de to signalerings akser, vi først siktet for å karakterisere nivåer av EGFR og PPARy uttrykk på tvers av et panel av 9 UC-cellelinjer. Som avslørt i figur 1 A, alle cellelinjene som ble testet uttrykt ulike nivåer av EGFR og PPARy. Vi viste ikke en sammenheng mellom baseline nivå av uttrykk og stadium av sykdommen, hvorav de 9 cellelinjer ble avledet fra (fra overfladisk til invasiv til metastatisk). Vi har også bestemt doseresponsen blant urothelial carcinoma cellelinjer (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, UM-UC13, RT4, 253JP, 253J-BV, KU7) til forskjellige konsentrasjoner av EGFR inhibitor (gefitinib) og PPARy agonist (DIM-C) etter 72 t behandling (figur 1 B). Vi var i stand til å stratifisere flere UC cellelinjer som strekker seg fra svært følsomme for relativt motstandsdyktig mot EGFR hemming, mens ble ikke observert noen signifikante endringer for å rettferdiggjøre en lagdeling som svar på DIM-C. Av notatet, UC5, den mest sensitive cellelinje til gefitinib, er forskjellig fra resten av cellelinjene som det inneholder EGFR-genet forsterkning.
(A) Uttrykk for PPARy og EGFR forhold til endogene nivåer av β- aktin og tubulin, henholdsvis, og er representert i enheter blant ni blære kreft cellelinjer som gjenspeiler ulike stadier av sykdommen (fra overfladisk til Invasive ingen metastaser, invasiv og lymfatiske metastase). (B) Dose-respons av blærekreft cellelinjer til PPARy agonist (DIM-C) og EGFR-hemmer (gefitinib). Den GI50 verdien ble definert som gjennomsnittlig konsentrasjon av stoffet som genererer 50% av veksthemming sammenlignet med kontroller.
Effekter av Combined EGFR-hemmere og PPARy agonister Therapy
Vi undersøkte antiproliferative effekter av kombinasjonsbehandling, gefitinib og DIM-C, sammenlignet med hvert medikament alene på blærekreft cellevekst
in vitro
. Vekst og celleproliferasjon ble overvåket av MTT analyser og gjennomført på to relativt EGFR-resistente cellelinjer (KU7 og UM-UC13). Celler ble behandlet i 72 t og brukt et gitt forhold av ulike fraksjoner av GI50 (0,25, 0,5, 1,0 og 2,0) av hvert medikament alene, i henhold til median virkning metode. Maksimal inhibering av celleproliferasjon ble demonstrert i den kombinerte behandling sammenlignet med hvert legemiddel alene (figur 2). DIM-C gjengitt de resistente cellene følsomme for EGFR hemming.
Vekst ble overvåket av MTT-analyser. Cellene ble behandlet med gefitinib fem mikrometer og DIM-C 3 mikrometer og sammenlignet med hvert medikament alene. Red: gefitinib; Gul: DIM-C; Blå: gefitinib + DIM-C
Effekt av Kombinasjon av EGFR Nedstrøms alarm og PTEN Expression
Binding av EGFR til sin ligand fører til aktivering av ulike signaler, inkludert Ras. /Raf /mitogen-aktivert protein kinase pathway (MAPK) [21]. Derfor, undersøkte vi effekten av kombinasjon i fosforyleringen status av p42 /44 MAPK (ERK1 /2). Som vist i figur 3A, ble en betydelig tidsforløp deaktivering av Erk veien observert, sammenlignet med kontroll, blant celler behandlet med gefitinib 5 uM og DIM-C 3 uM. I tillegg, som tidligere nevnt, ekspresjon av PTEN økninger i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ble behandlet med PPARy-agonister, rosiglitazon [17]. Derfor undersøkte vi også effekten av kombinasjonsbehandling i PTEN uttrykk. Som vist i figur 3B, ble observert noen forskjell i PTEN uttrykk, sammenlignet med kontroll, når cellene ble behandlet med kombinert gefitinib og DIM-C i 24 t.
(A) Fosforylering mønster av p42 /44 MAPK (ERK1 /2) i celler behandlet med gefitinib fem mikrometer og DIM-C 3 mikrometer for 5, 15 og 30 minutter. T0 er den ubehandlede kontroll. Hel-cellelysater ble immunoblottet med phosho-p42 /44 MAPK og p42 /44 MAP. GAPDH ble brukt som lasting kontroll på Western blotting. (B) Sammenligning av PTEN uttrykk i cellelinjer behandlet med gefitinib fem mikrometer og DIM-C 3 mikrometer for 24 hs. T0 er ubehandlet kontroll.
Effekter av behandling på Blære tumorvekst in vivo
For å vurdere om disse funnene kan oversettes
in vivo
, nakne mus var inokulert subkutant med forholdsvis resistente blærekreftceller (KU-7 celler). Musene ble behandlet med målrettede midler via oral sonde (PPARy-aktiv DIM-Cs gitt 60 mg /kg 3 ganger per uke, gefitinib gitt 2 mg /dag 5 ganger per uke, eller begge deler) i 4 uker. Som vist i figur 4, ble tumorvekter markert redusert i kombinerte gruppe i motsetning til hvert medikament alene, sammenlignet med kontroll (
p
0,02). Disse funnene tyder kombinert behandling har en bedre antitumor aktivitet. Videre genekspresjon profilering analyse av blæren tumorxenografter, viste at flere gener som er involvert i cellesyklus, celledød, cellevekst og proliferasjon ble uttrykt på en annen måte i den kombinerte behandlingsgruppe sammenlignet med kontrollgruppen. (Tabell 1). Bemerkelsesverdig, cyklin-avhengig kinase inhibitor (CDKN1A eller p21), som fungerer som en regulator av cellesyklusutvikling ved G1, var signifikant oppregulert (endring 2,6,
p
verdi 0,02), og dette ble validert ved immunhistokjemi viser høyere prosentandel av p21-positive celler i den kombinerte arm
in vivo plakater (66% vs 15%, p 0,001) (figur 5A) så vel som
in vitro plakater (figur 5B) . Interessant nok er det blitt
blære tumor vekst rapportert at PPARy spiller en viktig rolle mediere differensieringen-avhengige kaskade ekspresjon av cyklin-avhengige kinase-inhibitorer, for derved å tilveiebringe en molekylær mekanisme koblingsvekststans og adipocyttdifferensiering [22]. av kombinasjonsbehandling armen sammenlignet med kontrollarmen (P 0,02). Ti mus per gruppe ble behandlet med placebo; DIM-C ble gitt 60 mg /kg 3 ganger per uke; Gefitinib ble gitt 2 mg /dag, 5 ganger per uke. Alle legemidler ble administrert av oral sonde. Behandlingen ble fortsatt i 4 uker.
(A) Immunohistochemistry (IHC) farging for p21 i tumor xenograft vev. Mus ble behandlet med placebo eller kombinasjonsbehandling (Gefitinib 2 mg /dag, 5 ganger per uke og DIM-C 60 mg /kg, 3 ganger per uke). Grafikk på høyre side representerer kvantifisering av positive flekker celler. (B) In vitro uttrykk for p21 i Western blot av lysat celler behandlet med gefitinib fem mikrometer og DIM-C 3 mikrometer for 24 hs. Grafikk på høyre side, representerer kvantifisering av p21 uttrykk knyttet til GAPDH.
EGFR Hemming induserer Gene Expression of PPARy i en doseavhengig måte
Vi har evaluert effekten av gefitinib på medlemmer av PPARy signal akser. To resistente celler (KU-7 og UM-UC13) ble behandlet med ulike konsentrasjoner av EGFR-hemmer for 24 hs. PPARy-ekspresjon ble bestemt ved Western-blotting analyser som beskrevet tidligere. Som vist i figur 6A, ble en dramatisk induksjon av PPARy ekspresjon observert i begge cellelinjer, på en doseavhengig måte, etterfulgt EGFR hemming. Interessant, en kjernefysisk akkumulering av PPARy ble også observert etter sin oppregulering, som faktisk er den aktive formen av reseptoren. (Figur 6B). Disse funnene ble bekreftet
in vivo
, som vist i Figur 7, som viser PPARy uttrykk er høyere blant de xenografttumorer behandlet med gefitinib sammenlignet med placebogruppen. Av notatet, ble en nukleær farging også observert, noe som tyder på en kjernefysisk translokasjon av PPARy etter induksjon av sitt uttrykk.
(A) Brett økning i forhold til kontroll ble bestemt etter normalisering med β-actin som ekstern lasting kontroll. (B) Oppregulering og kjernekraft opphopning av PPARy etter behandling med gefitinib (24 hs).
Grafikk på lavere nivå representerer kvantifisering av positive flekker celler. Svarte piler indikerer atom farging.
Schedule spesifikke Effekten av kombinasjonsbehandling
Hvis cellene er sensibilisert for EGFR hemming via induksjon av PPARy uttrykk, da man ville forvente at effekten av kombinasjonsbehandling kan også bli betydelig påvirket og forbedret av sekvens av administrasjon av gefitinib og DIM-C. Faktisk ble det observert markert effekt på proliferasjonen mellom tre relativt motstandsdyktig og én sensitive cellelinjer til gefitinib (KU-7, UM-UC3; UM-UM13) når cellene ble forbehandlet med gefitinib for 24 hs for å tillate induksjon av PPARy ekspresjon sammenlignet med når cellene ble samtidig eksponering for gefitinib og DIM-C (figur 8). Disse funnene sterkt PPARy agonist kunne gi en betydelig bevisst UC cellelinjer, spesielt de som var resistente mot EGFR hemming, i en tidsplan spesifikk måte og gir en utmerket potensial for kombinasjonsbehandling.
Tre relativt resistente cellelinjer til gefitinib (UM-UC3, UM-UC13 og KU-7) og en følsom (UM-UC6). Vekst (MTT-analyser) etter 48 hs behandling. Gefitinib: 2 mikrometer. DIM-C. 2 mikrometer
C /EBPβ Uttrykk etter Gefitinib Induced-PPARy Expression
Betydelig bevis indikerer at CCAAT /enhancer-bindende protein beta (C /EBPβ) fungerer som en transkripsjonen aktivator for PPARy-gener [23], [24]. Denne troen er støttet av det faktum at den proksimale av sine arrangører har C /EBP regulatoriske elementer som er avgjørende for trans av PPARy promoter-reporter transgener. Her kan vi rapportere overbevisende bevis for at sekvensielle induksjon av PPARy-ekspresjon av EGFR inhibering mediert av C /EBPβ (figur 9). Når celler ble forbehandlet med gefitinib ved de samme konsentrasjoner som brukes for å indusere ekspresjon av PPARy, en økning i C /EBPβ ble også observert noe som tyder på gefitinib indusert-PPARy ekspresjon kan være mediert av C /EBPβ.
(A ) RT-PCR av celler behandlet med gefitinib (B) Western blot av CEBPβ uttrykk i KU-7 og UM-UC-13 cellelinjer som svar på ulike konsentrasjoner av gefitinib.
Diskusjoner
Resultatene fra en stor mengde prekliniske studier og kliniske studier tyder på at målretting EGFR representerer et betydelig bidrag til kreftbehandling. Men spørsmålet om konstituerende motstand i et stort antall pasienter og utvikling av ervervet resistens i de reagerer fortsatt et uutforsket gjenstand for etterforskning. Kreft celle motstand mot EGFR-antagonister kan skyldes flere årsaker, for eksempel genetiske endringer, noe som gjør dem i stand til å ha en iboende motstand mot kreft narkotika. I tillegg kan flere ulike molekylære endringer viktige i EGFR avhengige eller-Uavhengig cellulær signalveier være ansvarlig for utvikling av resistens mot disse hemmere. For eksempel har vi tidligere vist frakobling av EGFR med mitogene veier kan føre til resistens mot EGFR-antagonister [7]. Foreløpig har kombinert terapi blitt et gjennombrudd i behandling av kreft. I en rekke tumor enheter, har en slik tilnærming produsert imponerende resultater. Kombinasjonsterapi av PPARy-agonister og andre midler som har vist seg å være mer effektiv enn anvendelse av enten middel alene. [25], [26]. I blærekreftceller
in vitro
og blære tumor
in vivo
, vi demonstrert at PPARy aktiv DIM-Cs viste signifikant anti-tumorigen aktivitet og var mer potente hemmere av blærekreft vekst sammenlignet med rosiglitazon, den tiden brukes syntetiske PPARy agonist [16]. Tatt sammen, kombinert satsing på både EGFR og PPARy aksene kan avsløre lovende molekyler for å målrette i blærekreft. Imidlertid har våre resultater viser at menneske uroteliale kreftcellelinjer vise markert heterogenitet mot følsomhet for EGFR-hemmere. Av stor interesse, nivåene av uttrykk av EGFR og PPARy variert betydelig mellom de ulike cellelinjer, men ikke korrelerer med sykdomsstadium (varierer fra overfladisk papillær til invasiv til metastatiske svulster). Videre denne sammenhengen ble ikke perfekt også til følsomhet enten til EGFR-hemmer eller PPARy agonist med unntak av UM-UC5 som viser høye nivåer av EGFR uttrykk og vise høy følsomhet for EGFR-hemmer. Disse funnene underbygge resultatene fra andre grupper som har rapportert, i et panel av 17 humane blærekreft cellelinjer, at til tross for den sterke korrelasjonen mellom gefitinib-respons, EGFR overflate uttrykk og p27Kip1 protein uttrykk i de mest responsive linjer, gefitinib-respons var ikke som tett knyttet til overflate EGFR uttrykk innenfor panel av cellelinjer som en helhet [27]. Disse resultatene er oppsiktsvekkende, men er fortsatt uklart om baseline uttrykk kunne forutsi EGFR avhengig vekst i blærekreft. Omvendt, når to-resistente cellelinjer (KU-7 og UM-UC13) ble behandlet med fast-forhold på ulike fraksjoner av GI50 av hvert legemiddel alene (gefitinib eller DIM-C), kombinasjonsterapi potensielt utøver additiv inhibering av UC celleproliferasjon. Disse resultatene gitt ytterligere innsikt i potensialet av kombinert terapi for å overvinne motstanden til hvert av legemidlene alene, spesielt til EGFR inhibitor. Faktisk våre
in vivo
funn viste positivt virkningene av kombinerte EGFR-inhibitorer og PPARy agonister på veksten av humane tumorer urothelial. Faktisk, xenotransplantater i nakne mus med forholdsvis resistente blærekreftceller (KU-7 celler) viste en markert redusert tumorvekt i kombinasjon gruppe, i motsetning til hver behandling alene sammenlignet med kontroll. Disse funnene tyder på at selv relativt resistente celler,
in vitro
, viste følsomhet
in vivo
i den kombinerte behandlingen, noe som tyder PPARy agonist kan potensielt brukes til å bevisstgjøre blærekreft cellelinjer som var resistente mot EGFR-hemming.
Nylig curcumin ble vist å indusere PPARy uttrykk ved leverstelceller og hemmer celledeling potensielt
via
hemme EGFR aktivering [28]. I denne studien Zhou et al, rapporterte at avbrytelsen av PDGF og EGF signalveier med curcumin, stimulerer gen ekspresjon av PPARy i aktiverte leverstel celler (HSC), som fører til reduksjon i cellevekst, inkludert induksjon av celle og apoptose . På samme måte, observerte vi en induksjon av PPARy ekspresjon ved inhibering av EGFR i resistente KU-7 og UM-UC13-celler. Dette var et attraktivt resultat, ettersom induksjon av PPARy-ekspresjon ble observert i en doseavhengig måte, og ble etterfulgt av en kjernefysisk akkumulering av PPARy, som er, faktisk, funksjonell form av reseptoren. Vår roman observasjon gjenspeiler at effekten av kombinasjonsbehandling kan også bli betydelig påvirket og forbedret av sekvensert administrasjon av gefitinib og PPARy agonist. I virkeligheten PPARy agonist markert sensibilisert blærecancercellelinjer, spesielt de som var resistente mot EGFR-inhibering, i en tidsplan-spesifikk måte, noe som tyder det kan være et utmerket alternativ når cellene er resistente mot de nevnte monoterapiene. Mekanismen for induksjon av PPARy genuttrykk av gefitinib er fortsatt ikke klart. Under adipogenesen betydelige bevis tyder på at CEBP /β fungere som en transkripsjonen aktivator av PPARy gener [23]. Denne troen er støttet av det faktum at proksimale arrangører av PPARy besitter C /EBP regulatoriske elementene avgjørende for sin trans. Videre har det vist seg at CEBP /β uttrykkes på et tidlig stadium deretter til behandling med differensieringsinduse [29], etterfulgt av ekspresjon av PPARy. Faktisk viser våre funn EGFR inhibering indusert CEBP /β ekspresjon og interessant, dens oppregulering ble også observert på et tidlig stadium etter behandling gefitinib, en prosess svært lik aktivering av adipogenic gener under differensiering, og som går forut for induksjon av PPARy genekspresjon. Imidlertid er fremtidige studier nødvendig for å bestemme den direkte rolle C /EBPβ i induksjon av PPARy ekspresjon mediert av gefitinib. Ved tolkning av resultatene, er det viktig å kjenne begrensningene av prekliniske studier.
