Abstract
fenformin (phenethylbiguanide, en anti-diabetiker agent) pluss oksamat [laktat dehydrogenase (LDH) inhibitor] ble testet som en potensiell anti-kreft terapeutisk kombinasjon. I
in vitro-studier
, fenformin var mer potent enn metformin, et biguanid, nylig anerkjent for å ha anti-kreft effekt, for å fremme cancercelledød i området fra 25 ganger til 15 millioner ganger i forskjellige kreftcellelinjer . Den anti-kreft effekt av fenformin var relatert til kompleks I hemning i mitokondriene og påfølgende overproduksjon av reaktive oksygenarter (ROS). Tilsetning av oksamat inhiberte LDH-aktivitet og laktatproduksjon av celler, som er en viktig bivirkning av biguanider, og induserte raskere cancercelledød ved å redusere ATP-produksjon og akselererende ROS produksjon. Fenformin pluss oksamat var mer effektiv enn fenformin kombinert med LDH knockdown. I en syngene mus modell, fenformin med oksamat økt tumor apoptose, redusert tumorstørrelse og
18F-fluorodeoxyglucose (FDG) opptak på positronemisjonstomografi /computertomografi sammenlignet med kontroll. Vi konkluderer med at fenformin er mer cytotoksisk mot kreftceller enn metformin. Videre fenformin og oksamat ha synergi anti-kreft effekt gjennom samtidig hemmer utskillelsen av kompleks I i mitokondriene og LDH i cytosol, henholdsvis
Citation. Miskimins WK, Ahn HJ, Kim JY, Ryu S, Jung YS , Choi JY (2014) Synergistic Anti-kreft effekt av fenformin og -oksamat. PLoS ONE 9 (1): e85576. doi: 10,1371 /journal.pone.0085576
Redaktør: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Mexico
mottatt: 9 mai 2013; Godkjent: 29 november 2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Miskimins et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet delvis av Susan G. Komen for Cure award nummer KG100497 (WKM), ved National Cancer Institute of National Institutes of Health award nummer 1R01CA180033 (WKM), ved National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health award nummer 015P20GM10358 (WKM), ved Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi award nummer 2011-0013087, og ved Samsung Medical Center tilskuddet award nummer SMR1120911. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Observasjoner at metformin (1,1-dimethylbiguanide), den hyppigst forskrevne legemiddelet for type II diabetes reduserer risikoen for kreft har fremmet en entusiasme for metformin som en anti-kreft terapi [1], [2]. Nå kliniske forsøk i brystkreft ved hjelp av metformin alene eller i kombinasjon med andre behandlinger er underveis [3], [4].
fenformin, en annen biguanid (1-phenethylbiguanide) ble innført ved den samme tid som metformin, i 1950 som en anti-diabetiker narkotika. Fenformin er nesten 50 ganger så potent som metformin, men var også assosiert med en høyere forekomst av melkesyreacidose, en viktig bivirkning av biguanider. Fenformin ble trukket tilbake fra klinisk bruk i mange land på slutten av 1970-tallet da en sammenheng med melkesyreacidose og flere døds kasuistikker ble anerkjent [5]. Derfor har effekten av fenformin på kreft sjelden undersøkt.
For å hindre utvikling av resistente kreftceller, rask og fullstendig dreping av kreftceller ved kjemoterapi er viktig. Det er derfor mulig at fenformin kan være et bedre middel mot kreft enn metformin på grunn av sin høyere potens. I en
in vivo
studie, etablerte brystsvulster behandlet med metformin viste ikke signifikant hemming av tumorvekst, mens fenformin viste signifikant hemming av tumorvekst [6].
De mekanismer som metformin hemmer kreftutvikling og tumorvekst er ikke helt forstått. Foreslåtte mekanismer inkluderer aktivering av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) [7], inhibering av mTOR-aktivitet [8], Akt defosforylering [9], forstyrrelser i UPR transkripsjon [10], og cellesyklus-stans [11]. Nylig ble det vist at den antidiabetiske virkning av metformin er relatert til inhibering av kompleks I i luft kjeden av mitokondrier [12], [13]. Imidlertid har kompleks I aldri vært undersøkt med hensyn til anti-kreft effekt av biguanider.
Derfor, i denne studien vi forsøkte å først teste om fenformin har en mer potent anti-kreft effekt enn metformin og hvis så , undersøke anti-kreft mekanisme. Vi antok at fenformin har en mer potent anti-kreft effekt enn metformin og at dens anti-kreft mekanisme involverer hemming av komplekset I.
I tillegg, kombinert vi oksamat, et laktat dehydrogenase (LDH) inhibitor, med fenformin å redusere bivirkning av laktisk acidose. Oksamat hindrer omdannelsen av pyruvat til laktat i cytosol og dermed hindrer laktisk acidose. Interessant er laktisk acidose et vanlig fenomen i kreftmikromiljøet og er relatert til cancer celleproliferasjon, metastase, og inhibering av immunresponsen mot kreftceller [14], [15]. Nyere forsøk har vist at LDH knockdown hindret veksten av kreft [16], [17], derfor tilsetningen av oksamat kan ikke bare forbedre den bivirkning av fenformin, men kan også i seg selv hemme vekst og metastase av kreftceller.
Nei studier har testet fenformin i kombinasjon med -oksamat, enten
in vitro
eller i immun kompetente syngene mus. I denne studien undersøker vi hvorvidt fenformin og oksamat ha en synergistisk anti-kreft effekt ved samtidig hemming av kompleks I i mitokondriene og LDH i cytosol gjennom både
in vitro
tester og i en syngen mus modell.
Materialer og metoder
Fire grupper ble sammenlignet i denne studien: kontrollgruppe (gruppe C), fenformin gruppe (gruppe P), oksamat gruppe (gruppe O), og en kombinasjon gruppe fenformin og -oksamat (gruppe PO). Alle målinger i
in vitro
studiene ble utført en dag etter behandling med mindre annet er spesifisert.
Kjemi og cellekultur
Metformin (1,1-dimethylbiguanide), fenformin ( 1-phenethylbiguanide), og natrium-oksamat ble kjøpt fra Sigma Chemicals og ble fortynnet med sterilt vann til forskjellige konsentrasjoner. PARP-inhibitor (INH2BP, 5-jod-6-amino-1,2-benzopyrone) ble anskaffet fra Calbiochem og kaspaseinhibitor (Q-Val-Asp-OPh) ble innkjøpt fra MP Biomedicals. Cellelinjene MCF7 (brystkreft), B16F10 (melanoma), CT26 (tykktarmskreft), A549 (lungecancer), og DU145 (prostatakreft) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC). Den E6E7Ras (mandel kreft) ble hentet fra Dr J Lee (Sanford Research, Cancer Biology Research Center) [18], [19]. Alle celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum og supplert med 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Legemidler ble administrert på en celle confluency på 70%.
Fastsettelse av Drug Dosering
CT26, en tykktarmskreft cellelinje fra BALB /c mus, ble valgt som det primære system for studien fordi CT26 cellene er forholdsvis motstandsdyktige mot fenformin, men viste en dramatisk synergistisk virkning ved tilsetning av -oksamat. I tillegg, ble våre syngeniske mus eksperimenter utført i BALB /c-mus.
MCF10A celler, en ikke-transformert human bryst epitelcellelinje, forble upåvirket i nærvær av opp til 1 mM fenformin pluss 40 mM oksamat i 1 uke. Høyere doser produserte celledød (data ikke vist). Derfor brukte vi en mM fenformin, 40 mM -oksamat, og en mM fenformin pluss 40 mM oksamat for videre forsøk.
Måling av celledød ved trypanblått Eksklusjons Analyser og flowcytometri
Celler ble belagt i 35 mm skåler og behandlet med eller uten rusmidler. For trypan blå eksklusjon analysen, ble en cellesuspensjon farget med 0,02% trypan blå. Trypanblått positive og negative celler ble tellet ved bruk av et hemacytometer. For strømningscytometri målinger, 7-Aminoactinomycin D (7AAD; 5 mL) ble tilsatt til 500 ul cellesuspensjon og inkubert i 20 minutter på is. All flowcytometri målinger ble utført ved hjelp av en BD Accuri C6 flowcytometer (BD Biosciences).
En dose-responskurve, EC
50, og kombinasjonen indeks (CI) ble oppnådd ved bruk Calcusyn programvare (versjon 2.1 , Biosoft).
Måling av pH-verdien og laktat
pH av dyrkningsmedier ble målt ved anvendelse av et pH-meter (Accumet AB15 Basic and BioBasic pH /mV /° C meter, Fisher Scientific). Laktat i kulturmedier ble målt ved anvendelse av en laktat analysesett (Eton Bioscience, Inc.) og mikroplateleser (absorbans 490 nm, SpectraMax Plus
584, Molecular Devices) på en kvantitativ måte med laktat standarder. Laktatproduksjon ble standardisert per 10
5-celler.
Kompleks I Aktivitet
kompleks I-aktiviteten ble bestemt fra oksidasjonshastigheten av NADH (Fluka) per mg protein. Cellepelletene ble sonikert i 20 sekunder på is i IME buffer (50 mM imidazol, 2 mM MgCl
2, 1 mM EDTA, proteasehemmere) og 80 ug celleekstrakt ble tilsatt til reaksjonsbuffer [1 mM EDTA, 50 mM KCl , 1 mM KCN, 1,2 pM antimycin A, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)]. Like før måling, 150 uM NADH og 100 uM koenzym Q1 (Sigma) som en elektronakseptor, ble tilsatt. Absorbans ved 340 nm ble målt i løpet av 2 minutter ved hjelp av et spektrofotometer ved 30 ° C. NADH oksidasjon ikke er blokkert av rotenon (en kompleks I-inhibitor, 2,5 mm) ble fjernet fra beregningen for å måle NADH oksidasjon oppstår i komplekse jeg bare.
For å validere en rolle for kompleks jeg hemming av fenformin, 0,5 mM metyl succinat (Sigma) ble tilsatt for å fullvekstmedium med fenformin samtidig å observere om fenformin anti-kreft-celle effekter ble reversert. Metyl succinat tjener som en alternativ energikilde som omgår kompleks I i elektrontransportkjeden. Celledød ble målt 24 timer etter behandling.
LDH aktivitet
LDH-aktiviteten ble bestemt ved å overvåke hastigheten av NADH forbruk ved tilsetning av pyruvat. Cellepelletene ble resuspendert i 0,1 M KH
2PO
4 (pH 7,2), 2 mM EDTA og 1 mM ditiotreitol (DTT), ultralydbehandlet i 300 ul analysebuffer (50 mmol /l kaliumfosfat, pH 7,4) og sentrifugert ved 10.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble tilsatt til 50 mM kaliumfosfat (pH 7,4), 2 mM pyruvat og 20 uM NADH. Absorbans ble målt i løpet av 10 minutter ved bruk av et spektrofotometer ved eksitasjon 340 nm og 30 ° C. LDH aktivitet ble standardisert per 10
5 celler.
oksygenforbruk Rate (OCR) og ekstracellulære Forsuring Rate (ECAR)
OCR og ECAR ble målt ved hjelp av Seahorse XF24 ekstracellulære flux analysator ( Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA). Denne enheten bruker en engangssensor patron som er innebygd med fluorescens-basert optisk biosensorer (oksygen og protoner) som gjør det mulig for samtidige ekstracellulære sanntidsmålinger av intakte celler vokser som monolagene. CT26 ble sådd ut på 40.000 celler per brønn på XF24 V7 multi-brønnplater og ble pre-inkubert i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. Den følgende dag ble cellene skylt med analysen media, og deretter inkubert uten CO
2 ved 37 ° C i en time i analysemedium (DMEM base, 4 mM glutamin, 143 mM NaCl, 25 mM glukose ved en pH-verdi på 7,4 ). Etter å etablere to baseline OCR og ECAR opplesninger, ble studert narkotika injisert og målinger fortsatte i 70 min. Etter sytti minutter, ble 10 mM glukose injisert og OCR og ECAR ble målt i ytterligere 20 min. Eksperimenter ble kjørt i fire eksemplarer.
MITOKONDRIELLE reaktive oksygen arter (ROS)
Mitokondriell ROS ble oppdaget ved hjelp av rød mitokondrie superoxide indikator (MitoSOX ™, molekylære prober). MitoSOX ™ er et fluorogent fargestoff for svært selektiv deteksjon av superoksid i mitokondriene i levende celler. En gang i mitokondriene, er MitoSOX ™ Red reagens oksidert av superoksid og utstillinger rød fluorescens. Celler dyrket i en 35-mm glassbunn kulturskål (Mat Tak Corporation) ble inkubert med 5 uM MitoSOX ™ og 100 nM MitoTracker Grønn ® (Molecular Probes) i mitokondrier farging i 10 minutter ved 37 ° C beskyttet mot lys. Cellene ble forsiktig vasket tre ganger med varm buffer og montert i varm buffer for avbildning. Olympus FV1000 konfokalmikroskopi ble utført ved Ex /Em. 510/580 nm
For å validere betydningen av ROS produksjon, ROS åtseldyr, N acetylcystein (NAC, Sigma, 1 mM) ble satt til å fullføre vekst mellom 6 timer før testen Drug Administration. Celledød ble målt 24 timer etter behandling.
ATP-nivåer
ATP-nivåer ble bestemt ved en luciferin-luciferase-baserte analysen med en ATP Bioluminesens Assay Kit (Molecular Probes, Invitrogen). Analysen er avhengig av kravet til luciferase for ATP for å produsere lys. Målingene ble oppnådd ved anvendelse av et luminometer (GloMax® 96 Mikroplate Luminometer, Promega) ved et emisjonsmaksimum på omkring 560 nm til 300 sek. ATP-standarder ble kjørt samtidig med hvert eksperiment for å fremstille en standardkurve, og beregninger ble gjort mot kurven for å bestemme cellulære ATP-nivåer. ATP ble uttrykt per 10
5 celler.
DNA Damage
DNA-skader ble kvantitativt målt ved 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) i media, kjerner, og mitokondrier. 8-OHdG er en meget spesifikk biprodukt fra oksidativ skade av DNA og reflekterer intracellulær oksidativt stress. Cellene ble dyrket i 35 mm skåler for 8-OHdG deteksjon i media og kjerner, og i 100 mm skåler for mitokondrie 8-OHdG. Kjerner og mitokondrier ble separert ved differensial-sentrifugering. DNA ble ekstrahert fra kjerner og mitokondrier ved hjelp av et kommersielt kit DNA-ekstraksjon. DNA ble omdannet til enkeltkjedet DNA ved inkubering ved 95 ° C i 5 minutter og raskt avkjølt på is. Den denaturerte DNA-prøven ble deretter spaltet til nukleosider ved inkubering med 10 enheter nuklease P1 i 2 timer ved 37 ° C i 20 mM natriumacetat (pH 5,2), etterfulgt av behandling med 10 enheter av alkalisk fosfatase i 1 time ved 37 ° C i 100 mM Tris (pH 7,5). Reaksjonsblandingen ble sentrifugert i 5 minutter ved 6000 g, og supernatanten ble anvendt for ELISA-8-OHdG kit (OxiSelect ™, Cell Biolabs). Den gjenværende prosedyre ble utført følge protokollen som leveres av produsenten av ELISA-8-OHdG kit. DNA-skader ble standardisert per 10
6 celler.
LDH Knock Down
Uttrykk for LDHA ble slått ned av siRNA. Målsekvensen av LDHA var CAACUGCAGGCUUCGAUUA. Thermo Scientific DharmaFECT Transfeksjon reagenser ble brukt i henhold til produsenten. Ubehandlede celler og celler transfektert med negativ kontroll siRNA (non-målretting) eller test siRNA ble fremstilt i triplikat. 165.000 celler ble inkubert i 35 mm-brønners plater for en dag og transfektert med 15 ul siRNA og 6,8 ul Dharmafect i 2 dager. Medikamentell behandling ble startet etter 24 timer med transfeksjon. LDH knockdown ble bekreftet av western blot analyse etter 2 dager med transfeksjon (anti-LDHA antistoff, 1:1000, # ab47010, Abcam®).
Cancer Cell Død
Western blotting og konfokalmikroskopi ble utført for å påvise spaltet PARP [poly (ADP-ribose) polymerase] og apoptose induserende faktor (AIF). PARP er et substrat for caspases og kløyvde PARP (cPARP) er et kjennetegn på caspase-avhengig apoptose. AIF er et kjennetegn på PARP-avhengig celledød. Vi brukte også caspase-hemmer og PARP hemmer for å teste om disse hemmere blokkere kreft celledød.
Western blotting.
Antistoffer mot PARP (# 9542, brukt på 1:1000), og AIF ( # 4642, brukt på 1:1000) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. cPARP ble påvist i helcellelysater og AIF ble påvist i kjerneekstrakter. For å oppnå kjerner for måling av AIF, ble cellene vasket i kald PBS og suspendert i 400 ul iskald hypotonisk buffer [10 mM HEPES /KOH (pH 7,9), 2 mM MgCl
2, 0.1 mM EDTA, 10 mM KCL , 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF (phenylmethylsulphonyl fluorid) og 1% (v /v) eukaryot protease inhibitor cocktail] i 10 minutter på is. Cellepelleten ble forsiktig resuspendert i 100 ul iskald saltvannsbuffer (50 mM HEPES /KOH (pH 7,9), 50 mM KCl, 300 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 % (v /v) eukaryot protease-inhibitor cocktail), og inkubert på is i 20 minutter. Cellesuspensjonen ble vortex-blandet og sentrifugert ved 15.000 g i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble tatt som den nukleære lysatet og underkastet SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og western blot analyse for å måle AIF.
Konfokalmikroskopi.
Celler ble vasket i PBS og fiksert i 4 % paraformaldehyd i 15 minutter. For påvisning av endogene proteiner ved immunfluorescens ble cellene permeabilisert i 0,25% Triton X-100 i 5 minutter og deretter vasket i PBS tre ganger. Dette ble etterfulgt av blokkering i 10% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 30 minutter og inkubasjon i primært antistoff i 2 timer ved 37 ° C. Primært antistoff (1:100) ble fremstilt i 3% BSA i PBS. Objektglassene ble vasket tre ganger i PBS og inkubert med Alexa Fluor 594-merket sekundært antistoff (1:200, Molecular Probes) i 45 minutter. Til slutt, ble objektglassene skylt i PBS tre ganger, og monteres ved hjelp av Vectashield medium inneholdende 4, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Vector Laboratories). Lysbilder ble observert ved hjelp av et Olympus FV1000 confocal mikroskop.
Inhibitor behandling.
CT26 celler ble forbehandlet med en mikrometer caspase inhibitor (Q-Val-Asp-OPh, MP Biomedicals) eller PARP hemmer ( INH2BP, 5-jod-6-amino-1,2-benzopyrone, Calbiochem) i 4 timer før behandling med fenformin eller fenformin pluss -oksamat. Prosentandelen av døde celler ble talt 24 timer etter behandling i gruppen P og 12 timer etter behandling i gruppen PO ved flowcytometri å bruke 7-AAD.
Mus
Seven uker gamle BALB /c mus (Orientbio Inc. Korea) ble brukt. Forsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Samsung Biomedical Research Institute og ble utført i henhold til de kommer (dyr i forskning: Rapportering in vivo eksperimenter) retningslinjer [20]. Alle mus ble opprettholdt i en patogen-fri dyr anlegget.
behandlingsregime.
BALB /c-mus fikk saltløsning (gruppe C, n = 24), oksamat 300 mg /kg (gruppe O , n = 31), fenformin 17 mg /kg (gruppe P, n = 31), eller fenformin 17 mg /kg 300 mg /kg oksamat (gruppe PO, n = 31). Mus ble subkutant inokulert med 1 × 10
7 CT26 celler i 0,2 ml PBS på venstresiden. Eget narkotika av hver gruppe ble administrert intraperitonealt 3 dager etter celle injeksjon. Alle legemidler ble injisert i et totalvolum på 0,25 ml fortynnet med sterilt vann. Dyrene ble behandlet daglig i 21 dager. Kroppsvekt og tumorstørrelse ble målt 3 ganger i uken. Tumorstørrelse ble målt med eksterne calipers (Mitutoyo, Japan). Tumorstørrelse ble beregnet ved hjelp av en formel = (d1 d2 x
2) /2, hvor d1 og d2 er den lengste og korteste diameteren av tumoren, henholdsvis, målt i mm.
På dag 21 etter behandling ble musene bedøvet med 2,5% enflurane i O
2 og tumorene ble fjernet og kuttet i to. Den ene halvdelen av hver tumor ble hurtigfrosset og den andre halvdel fiksert i 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer over natten ved 4 ° C.
Apoptose-analyse.
tumorvev ble seksjonert ved en tykkelse fra 10 um ved anvendelse av en cryostat, tines montert på gelatinbelagte objektglass og lagret ved -20 ° C. For å oppdage apoptose, ble vevssnitt farget med terminalen deoxynucleotidyltransferase-mediert dUTP nick-end merking (TUNEL) metoden bruker Fluorescein
in situ
celledød deteksjon kit (deadend ™ Fluorometrisk TUNEL System, Promega). Lysbilder ble observert under et konfokal mikroskop LSM700 (Zeiss, Tyskland). De FITC-merkede celler gjennomgår apoptose ble gjenkjent av atomkjerner med sterk grønn fluorescens. For kvantifisering, ble tunel positive celler telles i tre seksjoner (304 mikrometer × 304 mikrometer) ved × 20.
18F-FDG små dyr PET /CT.
PET /CT ble utført 24 dager etter CT26 injeksjon og 21 dager etter oppstart av medikamentell behandling. En egen liten dyr PET /CT-skanner (Inveon Multimodalitet System, Siemens Healthcare, Knoxville, Tennessee, USA) ble brukt for musen bildebehandling. Sin iboende romlige oppløsning og aksial felt-of-view var 1,4 mm og 12,5 cm, henholdsvis. Til å begynne med ble musene bedøvet med isofluran. Etter CT scan for demping korreksjon (rørspenning 60 kVp, tube dagens 400 uA) ble utført, 7.4 ± 3 MBq av
18F-FDG ble injisert via halevenen. PET-scan utslipp i 5 min ble utført 60 min etter injeksjonen av
18F-FDG. En mus på en gang ble fotografert og holdt på en varm pallen under bildebehandling prosedyren. Etter datainnsamling, ble tverrgående PET-bilder rekonstruert med en ordnet delmengde forventning maksimering 3D-algoritmen (4 iterasjoner) med en voxel størrelse på 0,776 x 0,776 x 0,796 mm. CT-bildene ble rekonstruert ved hjelp av en filtrert tilbakeprojeksjon algoritmen med en Shepp-Logan filter.
PET, CT og smeltet PET /CT-bilder ble vist og analysert med Inveon Forskning arbeidsplassen programvare (Siemens Healthcare). Et volum-of-interesse (VOI) som dekker hele svulster ble definert basert på CT-bilder. Gjennomsnittlig standardisert opptak verdi (SUV
avg) av svulsten ble oppnådd ved hjelp av VOI fra CT-bildet. SUV ble korrigert for injisert dose
18F-FDG, mus kroppsvekt og tumorstørrelse. SUVavg data vises som en prosentandel av baseline for å enkelt vurdere relative endringer.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med programmet IBM SPSS statistikk (SPSS Inc., Chicago, USA ). Statistiske forskjeller mellom midler ble bestemt av
t-
test eller enveis ANOVA etterfulgt av Tukey HSD test. Nominelle kategoriske data ble sammenlignet ved Pearsons chi kvadrat. Statistisk signifikans ble akseptert for p-verdiene av. 0,05
Resultater
fenformin utstillinger Høyere Cancer Cell Cytotoksisitet enn Metformin
De fleste tilgjengelige data om effekten av biguanides på kreft celler, og vår egen tidligere arbeid [21] – [23], har bekymret metformin. Vi har tidligere observert metformin cytotoksisitet til MCF7-celler, men det kreves høyere doser over en lengre tidsperiode [21], [22]. På grunn av den høye nivåer av metformin er nødvendig og mulig høyere potens av fenformin [24], ønsket vi å direkte sammenligne cytotoksisitet av de to stoffene i flere kreftcellelinjer. I E6E7Ras celler, en modell av HPV + hode og hals squamous cell carcinoma [18], [19], EF
50 for metformin og fenformin for å fremme cancercelledød var 504 mM og 0,6 mM, respektivt. EF
50 av metformin var 840 ganger høyere enn den for fenformin (Fig. 1A). Fenformin viste utmerket cytotoksisitet på forskjellige andre kreftcellelinjer, hvor metformin viste liten, hvis noen, virkning under disse betingelser (Fig. 1B-F). EF
50 av metformin var 15,200,000 ganger, 448 ganger, 67 ganger, 26 ganger og 25 ganger høyere enn fenformin i B16F10 (melanom), MCF7- (brystkreft), CT26 (tykktarmskreft), A549 (lungekreft) og DU145 (prostatakreft), respektivt.
cellene ble behandlet i 2 (A) eller antallet levende celler (B-F) ble bestemt. (A) E6E7Ras celler, en musemodell for HPV + hode og hals squamous cell carcinoma, (B) B16F10 musemelanomceller, (C) A549 humane lunge adenokarsinomceller, (D) MCF7 humane brystcancer-celler, (E) CT26 mus tykktarm kreftceller, og (F) DU145 humane prostatakreftceller. *:. P 0,05
fenformin og oksamat Utstilt en synergistisk effekt på kreftcelle Cytotoksisitet
biguanides, f.eks metformin og fenformin, er kjente inhibitorer av kompleks I i det mitokondrielle elektrontransportkjeden og våre tidligere studier viste at mitokondrier er viktige mål for metformin i brystkreftceller [22]. Hemming av mitokondrie metabolisme fremmer glycolytic metabolisme og laktat produksjon og eksport. Vi er derfor begrunnet at hemme omdanningen av pyruvat til laktat ville fremme oppføring av pyruvat til mitokondrie metabolisme og forbedre den cytotoksiske effekten av fenformin. Oksamat er en kjent hemmer av LDH [25]. I studier som er presentert her, oksamat alene viste en svak cytotoksisk effekt i området 0-80 mM (Fig. 2A). Fenformin alene viste cytotoksiske effekter, men styrken var forskjellig mellom ulike kreftcellelinjer (Fig. 2B, 2C). Fenformin og oksamat samtidig administrasjon imidlertid viste en sterk synergistisk effekt på kreftcelledreping i alle kreftcellelinjer som ble testet. Kombinasjon indeks (CI) ble beregnet ved bruk av flere legemidler-effekt ligningen av Chou-Talalay [26] i Calcusyn programmet. Konfigurasjons reflektere den type samhandling mellom samtidig administrerte legemidler. CI-verdier i området 0,9 og 1,1 indikerer en additiv effekt, mens CI verdier av 0,9 indikerer synergisme og CI verdier av 1,1 indikerer antagonisme. Kombinasjonen indeks (CI) var 0,494 i E6E7Ras, 0.310 i B16F10, 0,009 i CT26, 0.227 i A549, og 0,067 i DU145, og 0,503 i MCF7- (sterk synergisme) ved samtidig bruk av sammenliknet med en enkel administrasjon på ED
50. Lengre behandling (Fig. 2B) og høyere doser (fig. 2C) resulterte i økt cytotoksisitet i fenformin.
(A) E6E7Ras celler ble behandlet i 2 dager med oksamat ved de angitte konsentrasjoner (0-80 mM) og deretter døde celler ble tellet ved strømningscytometri. (B, C) De angitte cellelinjer ble behandlet med varierende konsentrasjoner av fenformin, oksamat, eller kombinasjoner av de to medikamentene. I (B) celler ble behandlet i 1, 2, eller 3 dager før telling av døde celler. I (C) celler ble behandlet i 24 timer før bestemmelse av antallet av døde celler. C: kontroll, P: fenformin, O: -oksamat, PO: fenformin + -oksamat. I (C) tallene under hver linje angir konsentrasjoner av hvert stoff i mm (f.eks betyr P0.5O20 P 0,5 mm + O 20 mm). * Indikerer en synergistisk effekt i gruppen PO sammenlignet med de andre gruppene.
Effekter av fenformin og oksamat om Laktat Produksjon og pH
biguanides er kjent for å forbedre glukoseopptak, glycolytic metabolisme og laktat sekresjon. Oksamat, på den annen side, er en hemmer av LDH og forventes å redusere laktatproduksjon av cellene. For å undersøke hvorvidt disse forbindelser ble påvirke de antatte cellulære mål, laktat i kulturmediet ble målt i CT26. Siden laktat transporteres fra cellen sammen med et proton, ble pH i mediet også målt. Fenformin økt laktatproduksjon og redusert pH i mediet sammenlignet med kontrollgruppen, noe som indikerer forhøyet forekomst av glykolyse. Oksamat redusert laktatproduksjon og økt pH, noe som tyder på den vordende hemming av LDH. Tilsetning av oksamat til fenformin reversert både økningen i laktatproduksjon og reduksjon i pH-verdien som følge av fenformin behandling (Fig. 3A, 3B).
CT26 celler ble behandlet med de angitte forbindelser i en, to eller tre (A) eller middels pH-verdi (B) ble bestemt. P: fenformin 1 mM, O: oksamat 40 mM, PO: fenformin 1 mM + oksamat 40 mM, C: ubehandlet kontroll. *: P 0,05 sammenlignet med de andre gruppene. †: P 0,05 sammenlignet med gruppen C og P.
cytotoksiske effektene av fenformin og oksamat er knyttet til komplekse jeg og LDH Hemming, Henholdsvis
Som beskrevet ovenfor, den antatte mål for fenformin og oksamat er sammensatt i i det mitokondrielle elektrontransportkjeden og LDH, respektivt. Endringene i laktat som reaksjon på disse forbindelser understøtte denne konklusjon. Følgende forsøk ble utformet for å definere mer direkte effektene av forbindelsene på deres antatte mål. Først effekten av fenformin på komplekse I-aktivitet ble målt direkte, som beskrevet i Materialer og Metoder. Fenformin behandling av celler sterkt inhibert mitokondriell kompleks I-aktivitet (Fig. 4A). For å underbygge dette funnet, ble mitokondriell oksidativ metabolisme målt ved Seahorse XF24-3 ekstracellulære flux analysator etter behandling av CT26 celler med forbindelsene. Fenformin redusert oksygenforbrukshastighet (OCR) som forventet for en kompleks I-inhibitor. I motsetning til dette økte -oksamat OCR. Dette er også forventet fordi pyruvat vil bli omdirigert til mitokondrie oksideringsmetabolisme hvis LDH hemmes. Interessant, OCR var lavest i fenformin pluss -oksamat gruppe (Fig. 4B). Metyl-suksinat kan omgå elektrontransporten gjennom kompleks I fordi det donerer elektroner direkte til kompleks II i det mitokondrielle elektrontransportkjeden. Tilsetning av metyl-succinat til fenformin redusert cytotoksisk effekt av fenformin (fig. 4C), igjen antyder at kompleks I hemming er et viktig mål for medikamentet.
(A) CT26 celler ble behandlet med eller uten fenformin for 24 timer og deretter ekstrakter ble fremstilt for å måle kompleks i-aktivitet, som beskrevet i Materialer og Metoder. Y-aksen er% av komplekset I-aktivitet når aktiviteten av kompleks I i kontrollgruppen regnes som 100%. (B) Effekten av de angitte forbindelser på oksygenforbruk etter CT26 celler ble bestemt som en indikator av mitokondriell oksidativ metabolisme. (C) Cellene ble behandlet med eller uten fenformin, i nærvær eller fravær av metyl-suksinat, som omgår kompleks I i elektrontransportkjeden. Etter 24 timer ble antall levende celler i kulturene ble bestemt. MS: metyl succinate. C: kontroll, P: fenformin 1 mM, O: -oksamat 40 mm, PO: fenformin 1 mm + -oksamat 40 mm. *: P 0,05
De direkte effektene av fenformin og oksamat på LDH aktivitet ble også målt.. Behandling av celler med fenformin øket LDH-aktivitet og behandling med oksamat hemmet LDH-aktivitet (Fig. 5A). Dette er konsistent med de kjente cellulære aktiviteter for de to medikamenter. Viktigere, oksamat også inhiberte sterkt LDH-aktivitet i fenformin behandlede celler, noe som indikerer at fenformin er ikke i stand til å reversere de inhiberende virkninger av oksamat på enzymet.
(A) CT26 celler ble behandlet med forbindelser, som angitt under hvert bar, i 24 dager. Ekstraktene ble deretter preparert for bestemmelse av LDH enzymaktivitet. Y-aksen er% av LDH-aktivitet når aktiviteten av LDH for kontrollgruppen regnes som 100%. (B) ekstracellulær surgjøring satsen i nærvær av de angitte stoffene ble målt ved anvendelse av en Seahorse XF24 instrument som beskrevet i Materialer og Metoder.
