Abstract
Bakgrunn
Den lavere forekomst av brystkreft blant asiatiske kvinner sammenlignet med vestlige land har blitt delvis tilskrives soya i asiatisk kosthold, som fører til arbeidet med å identifisere de bioaktive komponenter som er ansvarlige. Soya Bowman Birk Inhibitor konsentrat (BBIC) er en kjent kreft forebyggende middel nå i kliniske studier.
metodikk /hovedfunnene
Formålet med dette arbeidet er å etablere tilstedeværelse og avgrense i vitro aktivitet lunasin og BBI funnet i BBIC, og studere deres biotilgjengelighet etter oral administrering til mus og rotter. Vi rapporterer at lunasin og BBI er de to viktigste bioaktive ingrediensene i BBIC basert på hemming av foci formasjon, lunasin å være mer effektiv enn BBI på en ekvimolar basis. BBI og soya Kunitz Trypsin Inhibitor beskytte lunasin fra
in vitro
fordøyelsen med pankreatin. Oral administrasjon av
3H-merket lunasin med lunasin-beriket soya resulterer i 30% av peptid nå målet vev i en intakt og bioaktive form. I en xenograft modell av nakne mus transplantert med humane brystkreft MDA-MB-231 celler, intraperitoneale injeksjoner av lunasin, ved 20 mg /kg og 4 mg /kg kroppsvekt, redusere tumor forekomsten med 49% og 33%, respektivt, sammenlignet med bilen-behandlede gruppen. I motsetning til dette injeksjon med BBI ved 20 mg /kg kroppsvekt, viser ingen effekt på tumor forekomst. Tumor generasjon er betydelig redusert med to doser av lunasin, mens BBI er ineffektiv. Lunasin hemmer celledeling og induserer celledød i brystkreft seksjoner.
Konklusjon /Betydning
Vi konkluderer med at lunasin er faktisk det bioaktive kreft forebyggende middel i BBIC, og BBI bare beskytter lunasin fra fordøyelsen når soyabønner og andre seedet matvarer blir spist av mennesker
Citation. Hsieh CC, Hernández-Ledesma B, Jeong HJ, Park JH, de Lumen BO (2010) Komplementær Roller i Cancer Prevention: proteasehemmer Gjør Kreft forebyggende Peptide Lunasin Biotilgjengelig. PLoS ONE 5 (1): e8890. doi: 10,1371 /journal.pone.0008890
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 12 november 2009; Godkjent: 16 desember 2009; Publisert: 26 januar 2010
Copyright: © 2010 Hsieh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektnummer 05B087 tildelt av American Institute for Cancer Research (https://www.aicr.org/site/PageServer). Prosjekt nummer W81XWH-04-1-0128 tildelt av United States Department of Defense congressionally Regissert Medical Research Program (https://cdmrp.org). Prosjekt LUNAMICE 039241 tildelt av EU-kommisjonen og den spanske National Research Council for Marie-Curie postdoktorstipend i BHL. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. BODL er medstifter av FilGen biovitenskap, Inc ,. som har eksklusiv lisens til å kommersialisere lunasin teknologi som dekkes av patenter eid av University of California, Berkeley. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfattere (https://www.plosone.org/static/policies.action#sharing).
Innledning
brystkreft er den vanligste ondartet svulst blant kvinner og de viktigste årsakene til død av kvinner i vestlige land [1]. I kontrast til brystkreft forekomst i de fleste asiatiske land er ca 10% som av den generelle befolkningen i USA og Europa [2]. Av alle miljøfaktorer som er kjent for å påvirke brystkreft, ser ut til diett for å være en av de mest betydningsfulle. Asiatiske dietter er rike på soyaprodukter som inneholder faktorer som har blitt funnet å gi viktig beskyttelse mot initiering, markedsføring og /eller progresjon av brystkreft hos dyremodeller [3]. I 1980, Troll og medarbeidere antydet muligheten for at soyaprotein kan ha en rolle i å forebygge brystkreft i bestrålte rotter [4]. Dyreforsøk utført i løpet av det siste tiåret har bekreftet brystkreft forebyggende rolle soyaprotein [2], [3]. Spesielt bioaktive peptider isolert fra soyabønner, for eksempel lunasin og Bowman-Birk proteasehemmer (BBI) blir nå intensivt studert som kreft chemopreventive agenter.
Lunasin er en roman peptid først identifisert i soya [5] og deretter, isolert i hvete, bygg og andre frø [6] – [9]. Det er et 43-aminosyrepeptid som effekt er vist i pattedyrceller mot kjemiske karsinogener og virale oncogener [10], [11]. Den første musemodell bekreftet Kjemopreventivt aktiviteten av lunasin mot hudkreft forårsaket av en kjemisk karsinogen [10]. Disse resultatene antyder at lunasin kan utøve en lovende rolle som forebyggende middel mot andre former for kreft, for eksempel brystkreft.
BBI er et polypeptid på 71 aminosyrer med evnen til å inhibere serinproteasene trypsin og chymotrypsin. Det trypsin-inhiberende side BBI har vært assosiert med negative effekter på biotilgjengeligheten av diettproteiner, mens den chymotrypsin nettstedet har blitt implisert i kreft kjemopreventive effekter [12], [13]. Den høye kostnaden for BBI sin renseprosess har gjort nødvendig ved bruk av en uren form av BBI BBI kalles konsentrat (BBIC) som er blitt rapportert å utøve Kjemopreventivt aktivitet mot forskjellige typer av kreft indusert av kjemiske karsinogener og stråler i [14]. Disse studiene anser at BBI er den viktigste komponenten ansvarlig for BBIC er chemopreventive aktivitet, uten å vurdere bidraget av andre peptider som finnes i BBIC på sin kreft forebyggende aktivitet.
Oral-administrasjonen har blitt anerkjent som en plausibel og kostnadseffektiv tilnærming for å redusere kreft sykelighet og dødelighet ved å hemme forstadier hendelser før forekomsten av klinisk sykdom [15]. Siden lunasin og BBI er peptider, er det avgjørende å fastslå om de, når oralt inntak, overleve fordøyelsen og blir absorbert, og nådde målet vev og organer i en intakt og bioaktive tilstand. Park og kolleger gjennomført
in vitro
studier som viser hvilken rolle BBI i å beskytte lunasin fra fordøyelsen når soyaprotein ble muntlig konsumert [16]. Men det er ingen
in vivo
studier som undersøker hvilken rolle BBI i å beskytte lunasin fra fordøyelse i mage-tarmkanalen hos dyr.
Formålet med dette arbeidet er å vurdere tilstedeværelse og
in vitro
aktivitet av lunasin og BBI inneholdt i BBIC og studere deres biotilgjengelighet etter oral administrering til mus og rotter. En xenograft brystkreft musemodell ble valgt til å avgrense og evaluere
in vivo
de chemopreventive egenskaper lunasin og BBI separat og å belyse de karsinogenisitetsstudier trasé som er involvert i brystkreft som blir påvirket av disse peptidene.
Resultater
lunasin Er en bioaktive ingrediens av BBIC
for å bestemme sammensetningen av BBIC, ble dette preparatet utsatt for SDS-PAGE og Western-blot å identifisere lunasin og BBI. Resultatene viser at begge peptider er til stede i BBIC ved konsentrasjoner på 360 og 74,4 ng /ug protein, henholdsvis (figur 1A). De to utgjør omtrent 44% av totalt protein i BBIC, noe som indikerer at andre proteiner er til stede og kan bidra til egenskapene som tilskrives dette preparat
A:. Western-blot av BBIC ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for BBI og lunasin . (1) Marker, (2) 6,25 ug protein, (3) 12 ug protein, (4) 25 ug protein, (5) Standard BBI (3 ug) eller standard lunasin (200 ng). B: Foci formasjon inhibitorisk aktivitet på DMBA-induserte NIH3T3-celler. (A) Bærerbehandlede celler (b) positiv kontroll eller DMBA-behandlede celler, (c) BBIC (100 nM lunasin 1160 nM BBI), (d) BBI (100 nM) fra BBIC, (e) Lunasin (100 nM ) fra BBIC, (f) Standard BBI (100 nM), (g) Syntetisk lunasin (100 nM). Barer med ulike bokstav betegnelser er statistisk signifikant forskjellig fra hverandre (
P
0,05, n = 6)
Foci dannelsen hemmende aktivitet av BBIC inneholder 1160 nM BBI. og 100 nM lunasin ble analysert. BBIC trykkes foci formasjon med 80% i 7,12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA) -induserte NIH3T3-celler, sammenlignet med bærer-behandlede celler (figur 1B-C). Lunasin og BBI ble individuelt renset fra BBIC og deres aktiviteter analyseres. 100 nM av ren lunasin isolert fra BBIC redusert foci formasjon med 73% (figur 1B-E), som er identisk med den som observeres med 100 nM syntetisk lunasin (figur 1 B-G). Ren BBI isolert fra BBIC ved konsentrasjon på 100 nM avtar foci formasjon med 60% (figur 1 B-D). Dermed lunasin var mer effektiv enn BBI med 18% på en ekvimolar basis, men BBI har også en chemopreventive effekt av sine egne, mest sannsynlig på grunn av hemming av proteolytiske prosesser involvert i kreftutvikling.
Soy proteasehemmere Beskytt Lunasin fra
in vitro fordøyelse
for å fastslå rollen til de forskjellige proteaseinhibitorer som finnes i soyabønner, så som BBI og Kunitz trypsininhibitor (KTI), ble det syntetiske lunasin underkastet en
in vitro
fordøyelsen prosessen med pankreatin. Lunasin ble inkubert med dette preparatet i fravær og nærvær av BBI og KTI og vurdert ved Western-Blot. Mønster viser (figur 2) som begge proteasehemmere beskytte lunasin fra fordøyelse, selv etter å ha blitt denaturert ved varmebehandling. Omtrent 93% og 97% av lunasin forblir intakte etter fordøyelsesprosessen i nærvær av ukokt BBI og KTI, respektivt. Lignende prosentandeler av lunasin (98% og 84%) forble intakt når dette peptid ble inkubert med pankreatin i nærvær av kokt BBI og KTI, respektivt. Lunasin motstår varmebehandling [17], og er til stede i forskjellige bearbeidede soyabønner produkter som også inneholder BBI [18]. Alle disse resultatene tyder på at lunasin ville være biotilgjengelige etter inntak av disse produkter på grunn av den beskyttende rollen av BBI og andre soya proteasehemmere.
De øvre, lettere band er Coomassie blå proteinflekker og de nedre, mørkere band er Western blot. (M) Markers, (1) Lunasin (600 ng) + pankreatin (600 ng) ble inkubert i 0 timer ved 37 ° C, (2) Lunasin (600 ng) + pankreatin (600 ng) ble inkubert i 1 time ved 37 ° C , (3) Lunasin (600 ng) + BBI (18000 ng, ukokt) + pankreatin (600 ng) ble inkubert i 1 time ved 37 ° C, (4). Lunasin (600 ng) + KTI (18000 ng, ukokt) + pankreatin (600 ng) ble inkubert i 1 time ved 37 ° C, (5) Lunasin (600 ng) + BBI (18000 ng, kokt) + pankreatin (600 ng) inkubert i 1 time ved 37 ° C, (6) Lunasin (600 ng) + KTI (18000 ng, kokt) + pankreatin (600 ng) ble inkubert i 1 time ved 37 ° C, (7) BBI (unboiled), (8 ) KTI (ukokt).
Lunasin Er Biotilgjengelig Når oralt til mus og rotter
Mus og rotter ble brukt til å avgjøre om muntlig inge lunasin overlever fordøyelsen, ender opp i vev og er fortsatt intakt og bioaktive målt ved en
in vivo
analysen. I det første sett av eksperimenter, CD-1 mus mottok
3H-merket syntetisk lunasin blandet med lunasin-anriket soya (LES) ved gavage. Lunasin absorberes og distribueres i ulike innsamlede vev, inkludert de som er mål for de mest vanlige kreftformer, som lunger, brystkjertler og prostata (figur 3A). Det er bemerkelsesverdig at lunasin er i stand til å krysse blod-hjerne-barrieren, å nå hjernen. Ved 3 timer post-sonde, blir omtrent 30% av den totale oral dose av lunasin absorbert (figur S1)
A.: Fordeling av
3H-lunasin aktivitet i forskjellige vev og gastrointestinale innholdet i mus etter () 3 h, () 6 h, () 9 h, () 12 h og () 24 timer etter oral administrering av LES. Feilfelt vist i 3 timer-resultater. B: Foci formasjon inhibitorisk aktivitet på DMBA-induserte NIH3T3-celler. (A) Bærerbehandlede celler, (b) DMBA-behandlede celler, (c) syntetisk lunasin, (d) lunasin ekstrahert fra leveren av rotter foret med kontrolldiett, (e) lunasin ekstrahert fra leveren av rotter tilført LES diett. Barer med ulike bokstav betegnelser er statistisk signifikant forskjellig fra hverandre (
P
0,05, n = 6).
Siden
3H-radioaktivitet ville ikke viser molekylstørrelse og bioaktivitet av lunasin i vev, rottene ble foret kost LES i 4 uker ble blod og lever samlet og lunasin ble ekstrahert, renset og analysert ved hjelp av Western-blot. Lunasin er til stede i blodet til LES-matet rotter som en monomer ved en konsentrasjon på 17,5 ng /ml. Imidlertid lunasin isolert fra lever fra rotter matet LES-eksisterer som en dimer ved en konsentrasjon på 3,1 ug /g lever (figur S2). Lunasin (1 uM) ekstrahert fra leveren av rotter matet LES-undertrykker foci formasjon så effektivt som en ekvimolar mengde av syntetisk lunasin (figur 3B). I kontrast, kontroll proteinbåndet hentet fra LES-sultne rotter er ineffektiv i å undertrykke foci formasjon.
Lunasin Reduserer Tumor Forekomst og Generation
For å undersøke
in vivo
effekt av lunasin og BBI i brystkreftceller, ble MDA-MB-231 celler implantert subkutant i hårløse mus etter 2 måneder intraperitoneal (ip) injeksjon av lunasin og BBI. Ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt ble observert blant de fire gruppene (figur 4A), noe som tyder på at lunasin eller BBI behandlinger har ingen bivirkninger på den generelle helsetilstand. Disse resultatene er i samsvar med undersøkelser utført av Johnson og medarbeidere [19] som rapporterte ingen signifikante effekter på kroppsvekt etter daglig inntak av BBIC (500~2000 mg /kg /dag) i seks måneder
.: Kroppsvekt vekt~~POS=HEADCOMP av mus behandlet med (♦) PBS (kontroll), (□) 20 mg BBI /kg kroppsvekt, (▴) 20 mg lunasin /kg kroppsvekt, og (x) 4 mg lunasin /kg kroppsvekt, og injisert med 1 x 10
7 MDA-MB-231 celler i flanken av 15 uker gamle nakne mus. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom fire grupper. B: Tumor forekomst hos mus behandlet med PBS, BBI og to doser av lunasin. Lunasin redusert antall mus som viste tumorer og forsinket fremkomsten av disse brystsvulster. C: Tumor generering i mus behandlet med PBS, BBI og to doser av lunasin. Lav dose av lunasin (4 mg /kg kroppsvekt) signifikant redusert tumor generasjon sammenlignet med kontrollgruppen (*
P
= 0,029). Data er vist: gjennomsnitt ± SEM (n = 8)
Brystkreft forekomst av mus er vist i figur 4B.. På syv uker etter celler injeksjon, 75% og 88% av mus i kontroll og BBI-gruppene, viste henholdsvis svulster. I motsetning til dette, tumortilfeller var 38% og 50% i mus som ble behandlet med 20 mg /kg og 4 mg /kg lunasin, respektivt. Således, sammenlignet med kontrollen, svulsten var forekomsten 49% og 33% lavere i lunasin-behandlede grupper respektivt. Sammenlignet med BBI gruppe, svulsten forekomsten var 57% lavere i 20 mg /kg og 43% lavere i 4 mg /kg lunasin behandlede gruppen. Mus behandlet med lunasin viste også en forsinkelse i utseendet av svulster. Videre tumorutvikling, ble redusert i de to gruppene av mus behandlet med lunasin, å være betydelig lavere i mus behandlet med den laveste dose av lunasin, 70% og 69% lavere sammenlignet med kontroll og BBI gruppe henholdsvis (
P
= 0.029 vs kontroll) (Figur 4C).
Vekst og endelige størrelsen av svulstene skilte mellom de fire gruppene. Vesentlige tumorer dukket opp i kontrollmusene etter injeksjon celler mens størrelsene av tumorer i mus behandlet med 20 mg /kg og 4 mg /kg lunasin ble redusert med 23% og 34%, respektivt (figur 5A). Ved slutten av eksperimentet, vekten av tumorene var også lavere i mus behandlet med begge doser av lunasin sammenlignet med kontroll-gruppen (
P
= 0,2134, 0,1880, henholdsvis) og BBI-gruppe (
P
= 0,0909, 0,0569, henholdsvis) (figur 5B)
A.: tumor volum (mm
3) av brystsvulster indusert av administreringen av (♦) PBS (kontroll), ( □) 20 mg BBI /kg kroppsvekt, (▴) 20 mg lunasin /kg kroppsvekt, og (x) 4 mg /kg av lunasin. B: brysttumorer vekt indusert av PBS (kontroll), 20 mg BBI /kg kroppsvekt, 20 mg lunasin /kg kroppsvekt (
P
= 0,2134 vs kontrollgruppe og 0,0909 vs BBI gruppe) og 4 mg lunasin /kg kroppsvekt (
P
= 0,1880 vs kontrollgruppe og 0,0569 vs BBI-gruppe). Data er vist gjennomsnitt ± SEM (n = 8).
Følbar og ikke-palpable brysttumorer ble oppsamlet og underkastet histologiske analyser og immunfarging. Etter H E farging. Representative Bildene vises for H E-fargede seksjoner (øvre kolonne), immunhistokjemisk farging for Ki-67 (midten kolonne) og in situ tunel apoptotiske indekser (nederst kolonne). B: Andel Ki-67 uttrykk i svulster hos mus. Ki-67 merking avslørte betydelig lavere nivåer av voksende celler i lunasin grupper versus kontrollgruppen (*
P
= 0,0062 i høy lunasin gruppe; *
P
= 0,0158 i lav lunasin gruppe). C: Andel apoptotiske celler i svulster hos mus målt med tunel analysen. Farging avdekket betydelig høyere nivåer av apoptotiske tumorceller i lunasin grupper versus kontrollgruppen. (*
P
= 0,0088 i høy lunasin gruppe; 0,0141 i lav lunasin gruppe). Data er vist gjennomsnitt ± SEM.
Diskusjoner
Den høye forekomsten av brystkreft har gitt en sterk begrunnelse for å identifisere nye forbindelser for bruk som forebyggende og /eller terapeutiske midler. Epidemiologiske studier, dyreforsøk og menneskelige studier har vist tegn på at folk forbruker en soya-rik diett har lavere forekomst og dødelighet av brystkreft, som fører til undersøkelser på ulike forbindelser fra soya som gir beskyttelse mot brystkreft [21], [22]. Daglig inntak av disse anticancer forbindelser kan sammenlignes med en forebyggende, ikke-toksisk versjon av kjemoterapi som er uskadelig for fysiologi av normalt vev og stopper microtumours [23], [24]. For å vurdere den potensielle risikoen og fordelene av fytokjemikalier for menneskers helse, forståelse av fysiologiske atferd av disse forbindelsene etter oralt inntak samt deres absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon er nødvendig [15].
soyabønner BBIC er i stor grad et preparat inneholdende protease inhibitor BBI som har blitt brukt for å demonstrere de kjemopreventive egenskapene til dette peptid å unngå de høye kostnadene for dens rensing. Flere studier har rapportert Kjemopreventivt rolle BBIC mot forskjellige typer av kreft indusert av kjemiske karsinogener og stråler [14], [25]. Disse studiene har antatt at BBI er hoved bioaktive stoffet ansvarlig for BBIC er chemopreventive aktivitet, uten å vurdere bidraget av andre mindre peptider. Våre resultater viser at BBIC inneholder både lunasin og BBI som representerer 44% av totalt protein.
in vitro
foci formasjon hemmende aktivitet analysen viser at lunasin utøver 18% høyere aktivitet i DMBA-indusert NIH3T3 celler enn BBI på en ekvimolar basis. Det er imidlertid klart at protease hemmende aktiviteter BBI og KTI er avgjørende i å beskytte lunasin fra
in vitro
fordøyelsen med pankreatin.
In vivo
eksperimenter utført med mus og rotter matet LES, har vist at lunasin, oralt inntak, motstår fordøyelse, blir absorbert og når målet vev og organer i en intakt og bioaktive tilstand. Nylig er det blitt demonstrert at lunasin er biotilgjengelig i mennesker matet soyaprotein-produkter, en viktig forutsetning for sin antikreft potensiell [26]. Dermed blir beskyttende roller BBI og KTI og kanskje andre naturlig forekommende protease spille en viktig rolle i å gjøre lunasin tilgjengelig i soya protein for å utøve sine chemopreventive egenskaper. Biotilgjengelighet etter oral administrering av en chemopreventive middel er avgjørende for å forstå de ulike
in vivo
mekanismer ansvarlig for sin kreft forebyggende aktivitet [27].
For å avgrense den enkelte
in vivo
preventive egenskaper mot brystkreft av lunasin og BBI ble hvert peptid injisert separat inn i nakne mus før og etter injeksjon av MDA-MB-231-celler. I vår studie ble en dose av BBI og to doser av lunasin vurdert. Den lave dose (4 mg /kg kroppsvekt) av lunasin tilsvarer det daglige inntak av soyaprotein vurderes av FDA for å redusere kardiovaskulær sykdom, og også i henhold til resultatene av våre foreliggende undersøkelse viser at 30% av inntatt lunasin når målet vev. Bruken av en høyere dose (20 mg /kg kroppsvekt) er basert på det funn at i.p. administrasjon av BBI ved denne dosen undertrykker effekt på 3-methylcholanthrene-indusert lungesvulster i A /J mus [28] betraktelig. Begge doser av disse peptidene ser ut til å være godt tolerert av musene som vist ved mangel på endring i kroppsvekt i løpet av den 15 uker lange behandlingsperioden. Mus behandlet med lunasin viser reduksjon i bryst svulst forekomst og forsinkelse i utseendet av svulster. Tumor generasjon er også betydelig hemmet ved lavere dose av lunasin. Videre er volumet og vekten av tumorer som genereres i lunasin-behandlede gruppene lavere sammenlignet med kontroll og BBI-grupper. Ingen effekter på brystsvulstutvikling er observert når BBI ble brukt i MDA-MB-231 xenograft mus.
For å bedre forstå de spesifikke mekanismene som lunasin utøver sin effekt på MDA-MB-231 brystsvulster, biomarkører av celleproliferasjon og apoptose som er gode indikatorer på tumorstørrelse i xenograft modell ble evaluert [29], [30]. Histologisk farging av seksjoner hentet fra lunasin behandlet svulster viser at tumor destruksjons områder er erstattet av apoptotiske og nekrotiske celler. Lunasin behandling resulterer også i en betydelig reduksjon av celleproliferasjon og induksjon av apoptose i MDA-MB-231 tumorer. Disse effektene er ikke observert i svulster fra BBI-behandlede mus.
chemopreventive egenskaper lunasin er påvist
in vivo
i tidligere studier. I den første dyremodell, lunasin påført topisk på 250 mg /uke undertrykker hudpapillom dannelse i sencar-mus behandlet med DMBA og tetradekanoylforbol-13-acetat med 70% sammenlignet med kontrollen. Tumor multiplisitet er også redusert, og utseendet er forsinket med 2 uker hos mus behandlet med lunasin i forhold til kontrollgruppen [10]. Dette er konsistent med en annen observasjon at lunasin bremser ned epidermal celleformering i mus huden i fravær og nærvær av DMBA ved hjelp av et
2 H
2O merking metode for å måle celleproliferasjon
in vivo product: [31] . Alle disse støtter våre funn at lunasin fungerer som et forebyggende middel kreft
in vivo
.
Kennedy har vist at BBI har betydelig kreft chemopreventive aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
bioassay systemer [25]. Selv BBI har et bredt spekter av kreftbeskyttende aktiviteter, fortsatt begrenset dens virkninger på brystkreft. BBI har tidligere blitt analysert for sin bioaktivitet mot andre former for kreft, for eksempel slimhinner i munnen, kolon og lungekreft [28], [32], [33]. Men no
in vivo
studier rapporterer effekten av BBI som brystkreft forebyggende peptid har blitt publisert. Likevel er det noen
in vitro
studier som viser at BBI redusert østrogenavhengig human brystkreft cellevekst [34] – [36]. Wan og kollegaer [37] viste vekst hemmende egenskaper BBI i menneskelige prostata kreft transplantater i nakne mus. Våre resultater ved hjelp av xenograft modell der lunasin og BBI ble evaluert separat viser at BBI viser svært lite chemopreventive effekt mot brystkreft. Flere studier er nødvendig for å avgjøre om tumor celletype og sine spesifikke karsinogenisitetsstudier trasé kan være determinanter av kreft chemopreventive egenskaper BBI.
I sammendraget, våre funn viser at lunasin og BBI er de to viktigste bioaktive ingrediensene i BBIC . I foci-analysen, er lunasin omtrent 18% mer effektiv enn BBI. Men viser
in vivo
xenograft modell som samtidig lunasin utvise betydelig chemopreventive og terapeutiske effekter, viser svært liten BBI. Vi foreslår at for å forklare de observerte chemopreventive egenskaper soya og andre frø inneholder lunasin, naturlig forekommende proteasehemmere som BBI og KTI, hovedsakelig beskytte lunasin fra fordøyelsen, noe som gjør det biotilgjengelig. Dette temaet komplementaritet av naturlig forekommende molekyler i å bringe om helsemessige fordeler for mennesker er trolig ganske vanlig i naturen og taler for å spise hele matvarer fremfor isolerte komponenter.
Materialer og Metoder
Rensing av Lunasin og BBI fra BBIC
for å forberede BBIC, ble 50 g finmalte soyabønner ekstrahert med 1250 ml heksan ved 4 ° C i 24 timer og deretter re-ekstrahert med 1250 ml 60% etanol ved 55~ 60 ° C i 1 time. Etter ekstraksjon, ble pH på løsningen ble justert til 5,3, og den BBIC ble utfelt med 2500 ml aceton i 15 minutter. Bunnfallet ble oppløst i 100 ml destillert vann, dialysert ved 4 ° C i 24 timer, og frysetørket.
Separasjon av lunasin og BBI fra BBIC ble utført ved ionebytterkromatografi. Kolonnen (AG MP-1 M, 5,0 x 50 cm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ble ekvilibrert med 0,1 M natriumfosfatbuffer saltvann (PBS, pH 7,0). Fem hundre mg av BBIC oppløst i 0,1 M PBS ble tilført til kolonnen og kromatografiske separasjoner ble utført med forskjellige konsentrasjoner av NaCl i PBS ved 4 ° C ved en strømningshastighet på 30 ml /time. De forskjellige oppsamlede fraksjoner ble underkastet Western-Blot for deteksjon av lunasin og BBI som beskrevet tidligere [8]. I korthet, ble SDS-PAGE utført ved å bruke 16,5% tris-Tricin geler (Bio-Rad). Proteinene ble transblottet til nitrocellulosemembran og blokkert i 5% fettfri tørrmelk ble oppløst i Tris-bufret saltoppløsning 1% Tween 20 (TBS-1T). Membranen ble vasket med TBS-1T og inkubert med lunasin polyklonale antistoff (Zymed, Inc., South San Francisco, CA, USA), eller monoklonalt BBI antistoff, vennlig levert av Dr. David Brandon (USDA, WRRL, Albany, CA, USA). Etter vasking, ble membranen inkubert i 1 time med pepperrot konjugert sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Membranen ble påvist ved anvendelse av deteksjonsmidlet (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) og straks utviklet ved bruk av 667 Polaroid filmer. Intensiteter av båndene ble kvantifisert ved hjelp av programvaren
Un-SCAN-IT gel
versjon 5.1 (Silk Scientific, Inc. Orem, UT, USA). Lunasin og BBI innholdet ble beregnet ved å sammenligne bandet intensiteter med de kjente standarder lunasin og BBI kjøre under samme forhold.
Foci Formation analysen
foci formasjon Analysen ble utført i henhold til Reznikoff et al [38]. NIH3T3-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler ble sådd ut i en tetthet på 500 celler /brønn i 12-brønners plater, inkubert over natten ved 37 ° C og behandlet med lunasin eller BBI i 4 timer. Deretter ble celler behandlet med 1,5 ug /ml DMBA i 20 timer. Etter vasking med PBS, ble friskt medium tilsatt. Peptider ble tilsatt, og mediet ble skiftet hver uke i 6 uker. Ved slutten av eksperimentet, ble cellene vasket med 0,9% NaCl, fiksert med metanol, farget med Giemsa kanten for transformerte foci. Den negative kontrollen var et sett med celler som får ingen DMBA, mens den positive kontrollen besto av celler indusert av DMBA men uten behandling.
In Vitro Hotell og
In Vivo
Biotilgjengelighet studier
in vitro
fordøyelsen av lunasin ble gjennomført etter metoden utgitt i United States Pharmacopeia [39]. Syntetisk lunasin (American Peptide Company, Inc. Sunnyvale, CA, USA) (5 mikrogram) ble inkubert med proteasehemmere BBI eller KTI (Sigma, St. Louis, MO, USA) for 30 min ved 25 ° C. Pankreatin fra svinebukspyttkjertel (Sigma) ble tilsatt (enzyme:protein forhold på 01:10) og oppløsningen ble inkubert ved 37 ° C i 1 time. Tris-tricin prøvebuffer ble tilsatt ved slutten av omsetningen, og straks stanses ved å plassere rørene i et kokende vannbad i 5 min. De fordøyer ble analysert ved SDS-PAGE og Western-Blot følge protokollen beskrevet tidligere.
Biotilgjengeligheten studier på mus ble gjort på North View Pacific Laboratories (Hercules, CA, USA), i henhold til Animal Care og bruk Committee (ACUC) menneskelige retningslinjer. CD-1 mus (3-5 uker gamle) ble kjøpt fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) og under forutsetning av AIN76A diett i en uke. Førti mus (20 mannlige og 20 kvinnelige) ble fastet i 8 timer før oral administrasjon via sonde. Mus ble delt opp i to grupper, en kontrollgruppe som fikk 240 mg av LES formulering og en behandlingsgruppe mottok 240 mg LES preparat pluss 8 uCi
3H-lunasin (SibTech, Inc., Brookfield, CT, USA) i 0,1 mL 10% sukroseløsning. Fire mus fra hver gruppe ble avlivet ved 3, 6, 9, 12 og 24 timer etter oral administrering. Vevsprøvene ble samlet og klargjort for scintillasjonstelling av oppløseliggjørende i TS-2 vevssolubilisator (Forsknings Products International Corp., Chicago, IL, USA) og tilsetning av 15% benzoylperoksyd.
