Abstract
epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er en de-differensiering prosess som har vært innblandet i metastaser og generering av kreft initiere celler (CIC) i solide tumorer. For å undersøke EMT i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), benyttet vi en tre-dimensjonal (3D) cellekultursystem der cellene ble ko-stimulert med tumornekrosefaktor alfa (TNF) og transformerende vekstfaktor beta (TGFp). NSCLC sfæroide kulturer vise forhøyet uttrykk for EMT hovedbryter transkripsjonsfaktorer,
TWIST1
,
SNAI1 /Snail1
,
SNAI2 /Slug Hotell og
ZEB2 /Sip1
, og er svært plagsomme. Mesenchymale NSCLC kulturer viser CIC egenskaper, viser forhøyet uttrykk av transkripsjonsfaktorer
KLF4
,
SOX2
,
POU5F1 /Oct4
,
MYCN
, og
KIT
. Som et resultat av disse antatte CIC viser en cancer «stilk-liknende» fenotype ved dannelse av lungemetastaser i henhold begrensende fortynning celle. Den pleiotropisk transkripsjonsfaktor, NF-kB, har vært innblandet i EMT og metastasering. Derfor setter vi ut for å utvikle en NSCLC modell for ytterligere å karakterisere rollen NF-kB aktivering i utviklingen av CIC. Her viser vi at induksjon av EMT i 3D kulturer fører til konstituerende NF-kB aktivitet. Videre hemming av NF-kB resulterte i tap av
TWIST1
,
SNAI2
, og
ZEB2
induksjon, og en svikt i cellene til å invadere og metastasere. Vårt arbeid viser at NF-kB er nødvendig for NSCLC metastase, delvis ved transkripsjonelt oppregulering herre-brytertranskripsjonsfaktorer som er nødvendige for EMT
relasjon:. Kumar M, Allison DF, Baranova NN, Wamsley JJ, Katz AJ , Bekiranov S, et al. (2013) NF-kB Regulerer Mesenchymale Transition for induksjon av ikke-småcellet lungekreft initiere Cells. PLoS ONE 8 (7): e68597. doi: 10,1371 /journal.pone.0068597
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 14 januar 2013; Godkjent: 30 mai 2013; Publisert: 30.07.2013
Copyright: © 2013 Kumar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Work var støttet av National Institutes of Health gir R01CA132580, R01CA104397 (til MWM), og R01CA136705 (til DRJ). Alle organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cancer utvikling av tidlig pre-maligne neoplasmer til full metastatisk sykdom er en flertrinnsprosess som involverer tumor epitel-stromal interaksjoner, angiogenese, og infiltrasjon av tumor-assosierte pro-inflammatoriske celler [1], [2]. En begynnende hypotese foreslår at dette miljøet av celle-celleinteraksjoner, vekstfaktorer og cytokiner er kjent som tumor-mikromiljøet, stimulerer morfogenese i tumorceller referert til som epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) [3] – [5]. EMT induserer en omfordeling av intracellulær arkitektur, redusert celle-celle-adhesjon, og tap av celle polarisering. Carcinoma celler som har gjennomgått EMT er karakteristisk motile, krenkende og svært metastatisk. I løpet av de siste årene, har EMT også blitt anerkjent som en de-differensiering program knyttet til generasjon av tumor initiere eller kreftfrem initiere celler (CIC) som er viktige i opprettholdelsen av kreft «stemness» [6] – [9] .
Selv om flere cytokiner og vekstfaktorer induserer EMT, en av de mest studerte faktorene er transformerende vekstfaktor beta (TGFp) [2], [3], [10] – [13]. Stimulering av celler med TGFB resultater i uttrykk for EMT herre-bryteren transkripsjonsfaktorer, TWIST1, SNAI1 /Snail, SNAI2 /Slug, og ZEB2 /Sip1 som sammen forskjellig regulerer gener for å fremme mesenchymale fenotype [10], [12]. Mens omfattende forskning beskriver muligheten for å indusere TGFp EMT indikerer bevis på at tumor nekrose faktor (TNF) forsterker overgangen [14], [15] lenger. I løpet av kreft progresjon, sekresjon av TGFp i tumoren mikromiljøet skjer gjennom mange forskjellige celletyper, inkludert tumorassosierte fibroblaster, mens sekresjon av TNF stammer fra tumorassosierte M2 makrofager [3], [16], [17]. En hypotese som hersker i feltet er at eksponering av kreftceller til disse cytokinene i svulsten mikromiljøet fremmer EMT, de-differensiering, og dannelsen av CIC [2], [5], [17].
TNF er en kraftig proinflammatorisk cytokin som stimulerer signaliserer kaskader å aktivere kjernefysiske faktor kappa B (NF-kB). Som en transkripsjonsfaktor, spiller NF-kB en viktig rolle i ekspresjonen av gener som er involvert i kreft initiering og progresjon. Oppregulering av NF-kB aktivitet forekommer ofte i grunnskolen solide og hematologiske tumorer, direkte korrelerer med de-differensiert morfologi, avansert tumor stadium, og dårlig klinisk prognose [18]. Viktigere, har NF-kB vært knyttet til melke CIC [19], [20]. NF-kB induserer og opprettholder EMT i modellsystemer gjennom to mekanismer, oppregulering av EMT herre-bryteren transkripsjonsfaktorer [21] – [24] og stabilisering av Snail [25]. NF-kB er sammensatt av fem Rel familiemedlemmer: RELA /P65, relB, Crel, P50 og P52. I ustimulerte celler, hemmende IKB subenheter forbinder med NF-kB dimerer og beslaglegge dem i cytoplasma. Ved cellulær stimulering med pro-inflammatoriske cytokiner, er IκBα fosforylert av IKB-kinase (IKK) kompleks, ubiquitinmolekyler av SCF-type E3 ligase, E3RS
IkB /β-TrCP og forringes av 26S proteasomet [26]. Frigjort NF-kB deretter translocates til kjernen for å aktivere genuttrykk ved å rekruttere transkripsjons coactivators [27]. Vårt laboratorium har vist at posttranslational modifikasjoner på RELA er nødvendig for full NF-kB transkripsjonen aktivitet [27] – [30]
Selv om EMT i brystkreft modeller krever NF-kB aktivitet [31], rollen. denne transkripsjonsfaktor i å stimulere EMT og utvikle CIC i NCSLC har ikke blitt grundig undersøkt. Imidlertid eksisterer et sterkt bevis for tilstedeværelse av NSCLC-stammen /stamceller i primær adenokarsinomer og etablerte cellelinjer [32] – [35]. Her viser vi at koordinert aktivering av TNF og TGFB signalkaskader effektivt induserer EMT og uttrykket av gener knyttet til de-differensiering og stemness. Videre viser vi at mesenchymale NSCLC-celler besitter konstitutivt aktiv NF-kB, og at inhibering av NF-kB avtar EMT, CIC formasjon, og metastatisk potensiale.
Materialer og metoder
Cellekultur og reagenser
NSCLC linjer A549, H359, H1299, og H157 ble hentet fra ATCC og vedlikeholdes som 2D kulturer i DMEM (Cellgro), 10% FBS (Invitrogen) og penicillin /streptomycin (Invitrogen). Antistoffene som anvendes, innbefatter: E-cadherin (BD Pharmingen- 610 404), N-cadherin (BD Pharmingen- 610 920), vimentin (V6630), fibronektin (BD Pharmingen- 610 078), α-Tubulin (Sigma T6793), HMGA2 (Biocheck 59170AP ), Twist1 (Cell Signaling 4119), Snail1 (Cell Signaling 4719), Sip1 (SCBT sc-48789), Slug (Abcam ab27568), IκBα (pS32, Cell Signaling 2859), IκBα (SCBT sc-371), rela (pS536 , Cell Signaling 3031), rela (SCBT sc-372), og M2-Flag (Sigma F1804). Baculogold proteaseinhibitorer ble oppnådd fra BD Biosciences. TGFB (PHG 9204) og TNF (PHG 3015) ble kjøpt fra Invitrogen /Life-teknologi. Alle andre kjemikalier var fra Sigma.
Tredimensjonal flercellet sfæroide kulturer
Tredimensjonal flercellede sfæroide kulturer ble opprettet ved hjelp av en modifisert hengende dråpe metoden [36]. Celler ble dyrket til tilnærmet 80% konfluens på standard vev-kulturplater. Cellene ble deretter trypsinert, resuspendert i DMEM /10% FBS, og telles. For å opprette 25.000 celleklumper, ble cellesuspensjonen fortynnet til en konsentrasjon på 1.000.000 celler /ml, og 25 ul av cellesuspensjonen ble pipettert på undersiden av en steril 10 cm vev-kulturplate lokk. Hver lokket holder ca femti dråper. Etter lasting dråpene, ble lokket plassert på en vevkulturplate inneholdende 6 ml sterilt PBS og inkubert i 48 timer for å lette cellulær aggregering og sfæroide formasjonen. De nydannede kuler ble deretter overført til 10 cm henge plater som inneholder DMEM og 2% FBS å hindre celle vedlegg til parabolen. Opphengs plater ble fremstilt ved tilsetning av 8 ml poly-HEMA-oppløsning (Sigma-Aldrich P3932, 10 mg /ml) i 95% etanol til sterile petriskål polystyren plater (Fisher Scientific). Platene ble deretter inkubert i 24 timer i et sterilt miljø for å tillate etanol for å fordampe. Før bruk Platene ble vasket med steril PBS for å fjerne eventuelt gjenværende etanol eller andre forurensninger. Hver suspensjon plate har plass til opptil 100 kuler. Etter overføringen ble sfæroidene behandlet med bærer eller med 10 ng /ml TNF og 2 ng /ml TGFp, og inkubert i 48 timer. Etter inkubering ble cellene underkastet en andre behandling av bærer eller TNF og TGFp, og inkubert i ytterligere 48 timer. Kulene ble deretter samlet og analysert av ulike analyser.
immunfluorescens Mikros
A549 celler ble sådd på dekkglass og utsatt for EMT induksjon eller venstre ubehandlet. Etter induksjon ble cellene fiksert i 100% metanol og deretter inkubert med primære antistoffer mot det ekstracellulære domene av E-cadherin (SCBT, sc-7870). En AlexaFlour-konjugert, geit-anti-kanin-antistoff (Invitrogen) ble anvendt som et sekundært antistoff, og indirekte immunofluorescens av E-cadherin ble fotografert ved hjelp av et Nikon E3800 fluorescens mikroskop.
migrering og invasjon
In vitro
migrasjon og invasjon analysene ble utført i henhold til produsentens protokoll (BD Biosciences). 2D og 3D kulturer ble inndelt etter trypsin og deretter telles. 1 × 10
5 celler (migrasjon) eller 1 × 10
4 celler (invasjon) ble sådd i vanlig DMEM øverst godt av en transwell kontroll plate (BD 354 578) eller Matrigel invasjonen plate (BD 354 480). Bunnen Brønnen ble lastet med DMEM inneholdende 10% FBS som en kjemoattraktant, og platene ble inkubert i åtte timer (migrasjon) eller tjuefire timer (invasjons) ved 37 ° C og 5% CO
2. Deretter ble cellene på oversiden av membranen fjernet, og de gjenværende cellene ble fiksert i 100% metanol og farget med 0,1% krystallfiolett. De fargede celler ble fotografert og kvantifisert ved hjelp av Adobe® Photoshop.
Tumor modell
Ettlagskulturer (2D) og 3D-A549 kulturer som hadde stått ubehandlet eller behandlet med TNF og TGFfi ble trypsinert, resuspendert i DMEM /0,5% FBS, og nøye telles og fortynnet i riktig volum for injeksjon. Celler ble subkutant (SC) injiseres i kvinnelig outbred Crl: NU /NU hårløse mus (Charles River). Fem mus ble injisert pr eksperimentell tilstand. Alle dyrestudier ble utført som tre uavhengige eksperimenter. Mus ble ofret førti dager etter injeksjon. De primære SC tumorer ble fjernet og veid. I tillegg ble lungene fjernet, fiksert i formalin, og overflatelungemetastaser ble tellet. For å kvantifisere mengden av totale tumorbyrden i formalinfiksert lungevev, ble genomisk DNA ekstrahert [37] og analysert for tilstedeværelse av humant genomisk materiale som beskrevet ved hjelp av kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) primere som er spesifikke for human endogene retrovirus-3 (ERV3, Tabell S1) [38], [39].
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingen fra Animal Care og bruk Committee (ACUC) ved University of Virginia. Protokollen ble godkjent av ACUC Antall 3914. Alle forsøkene ble avsluttet etter 40 dager og da SC svulster var mindre enn 1,0 cm
3 i størrelse; dermed begrense tumorbyrde. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere smerte og lidelse.
QRT-PCR, immunoblotter, og elektroforetisk mobilitet skift analyser (EMSAs)
QRT-PCR og Immunoblotanalyse Forsøkene ble utført som tidligere beskrevet [28 ]. PCR-primere er vist i tabell S1. Nukleære ekstrakter ble fremstilt ved anvendelse av kuler fra A549.V og A549.I cellelinjer behandlet med eller uten TNF og TGFp. EMSAs og supershift analysene ble utført som tidligere beskrevet [40].
statistikker
Når det er hensiktsmessig, ble sammenligninger mellom forsøksgruppene utføres ved å utføre en ensidige Student
t
test i Microsoft excel. Data for alle forsøkene ble betraktet som statistisk signifikant når p. 0,05
Resultater
En modell for å studere EMT i NSCLC
TNF har vist seg å forsterke TGFB-mediert EMT gjennom aktivering av kostimulerende trasé [15]. For å bekrefte denne observasjonen i vårt tre-dimensjonale (3D) modell, ble en tidsforløpet utført ved anvendelse av både cytokiner i tandem og alene. Flercellede sfæroide kulturer ble opprettet ved hjelp av en modifisert hengende dråpe metoden [36]. Etter to dager, ble kulene suspendert i poly-HEMA-belagte plater, og behandlet annenhver dag med de angitte cytokiner for å indusere EMT (figur 1A). Prøvene ble samlet inn fra ubehandlede (0 dager) og cytokin-behandlede kulturer (1-8 dager). Epitelial (E-cadherin) og mesenchymale (N-cadherin, vimentin, og Fibronectin) markørene ble målt ved hjelp av immunblot. Behandling med TNF resulterte i en beskjeden økning i N-cadherin og fibronektin, men klarte ikke å vise forskjeller i andre markører (figur 1B). I samsvar med induksjon av EMT, TGFp behandling resulterte i et tap av E-cadherin uttrykk og en økning i N-cadherin, vimentin, og fibronektin. Videre co-stimulering med TNF og TGFB gitt en mer mesenchymale fenotype og vedvarte gjennom hele åtte dagers tid kurs (figur 1B). Viktigere, stimulering med TNF og TGFB effektivt indusert EMT i både A549 og H358 cellelinjer innen fire dager etter behandling, sammenlignet med H1299, som allerede viser endringer i E-cadherin og vimentin (figur 1C). Basert på resultatene i figur 1, brukte vi fire dagers tidsramme gjennom våre resterende eksperimenter.
(A) En tidslinje viser prosedyren brukes til å lage en tredimensjonal mesenchymale cellepopulasjon fra sammenflytende monolag. (B) spheroid kulturer av A549 celler ble behandlet med TNF, TGFfi, eller begge cytokiner hver førtiåtte timer for de angitte tider. Immunoblot analyse målte endringer i epitel (E-cadherin) og mesenchymale (N-cadherin, vimentin, og fibronektin) markører enn en åtte dagers tidsforløpet. (C) 3D-kulturer av flere NSCLC-cellelinjer (A549, H358, H1299) ble inkubert i nitti-seks timer i fravær eller nærvær av TNF og TGFp. Epitel og mesenchymale markører ble senere målt ved immunblot. Resultater fra Figur 1B og 1C er representative eksempler fra minst tre uavhengige eksperimenter; α-tubulin fungerer som et protein lasting kontroll.
3D kulturer gjennomgå EMT mer effektivt enn 2D kulturer
For å avgjøre om 3D-A549 kulturer gjennomgå EMT mer effektivt enn to-dimensjonale (2D ) monolagskulturer, vi målte ekspresjon av epithelial og mesenchymale markører i respons til stimulering med TNF og TGFp som beskrevet i figur 1. Etter cytokin behandling, 3D kulturer viser betydelig tap av
CDH1 /E-cadherin
ekspresjon sammenlignet til 2D kulturer (Figur 2A). Videre er kulene også har økt uttrykk av mesenchymale markører
VIM
,
HMGA2
, og EMT herre-bryteren transkripsjonsfaktorer,
TWIST1
,
SNAI1 /Snail1
,
SNAI2 /Slug Hotell og
ZEB2 /Sip1 plakater (figur 2A og 2B). Immunoblot-analyse av sfæroide kulturer bekrefte at differensial mRNA-ekspresjon resulterte i en tilsvarende endring i proteinnivåer (figur 2C). I tillegg undersøkte vi endringer i cellulær morfologi og E-cadherin lokalisering ved mikroskopi. Både 2D og 3D-kulturene ble behandlet med cytokiner slik som beskrevet, trypsinert, re-plettert på dekkglass, og indirekte immunfluorescens-fargingen ble utført atten timer senere. Som forventet, ubehandlet enkeltlag og sfæroide A549 prøvene viste robust E-cadherin uttrykk, selv om junctional lokalisering dukket redusert i celler fra 3D kulturer (figur S1). Videre celler avledet fra cytokin-behandlede kuler viste forbedret tap av E-cadherin sammenlignet med 2D-behandlede prøver, noe som tyder på at 3D kulturer gikk mer effektiv EMT. Resultater er vist i figur 2 og figur S1 illustrere betydelig EMT induksjon i 3D kulturer som målt ved endringer i mesenchymale markører, EMT hovedbryter transkripsjonsfaktor uttrykk, og mobilnettet morfologi.
(A og B) med ett lag (2D) og 3D kulturer av A549 celler ble igjen alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGFB (TNF /TGF) i nitti-seks timer. Uttrykk av epiteliale markører (
CDH1
), mesenchymale markører (
VIM, HMGA2
), og EMT hovedbryter transkripsjonsfaktorer (
TWIST1, SNAI1, ZEB2, SNAI2
) ble målt ved QRT-PCR. (C) Immun analyse av 3D A549 kulturer, alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGFB (TNF /TGF), ble utført på E-cadherin, vimentin, HMGA2, Twist1, Snail1, Sip1, Slug, og α- tubulin. Resultatene i figur 2A og 2B ble normalisert til
GAPDH
, og er beregnet gjennomsnitt ± SD, * p 0,05, N = 3. immunoblotter i Figur 2C er representativt eksempel fra minst tre uavhengige forsøk
.
mesenchymale NSCLC-celler er invasiv og endogent uttrykte gener kjent for å fremme stilk-lignende egenskaper
Fenotypisk, mesenchymalceller har høye migrasjonsrater og skiller ut enzymer som bryter ned ekstracellulære matrise for å legge til rette for cellulær invasjon. Ved hjelp av
in vitro
Transwell analyser, målte vi migrering og invasjon egenskapene til A549 celler dyrket som enten 2D eller 3D kulturer. Interessant, ubehandlede 3D sfæroide kulturer viste høyere migrasjon priser enn 2D monolagkulturer (figur 3A, venstre). Men behandling av 3D kulturer med TNF og TGFB ytterligere forsterkes migrasjon sammenlignet med ubehandlede 3D kulturer. Spheroids behandlet med cytokiner invadert gjennom Matrigel mer effektivt enn noen annen tilstand (figur 3A, høyre). I tillegg cytokin behandlet A549 kuler vises oppregulert uttrykk for
MMP9
,
LOX
, og
COL22A1 plakater (figur 3B), gener kjent for å forsterke invasjonen [41], [42 ]. Disse resultater viser at dyrkning av 3D-kuler i nærvær av TNF og TGFp etablerer en meget inngripende mesenchymale befolkning. Endelig cytokin-behandlede kuler viste endogen oppregulering av markører assosiert med de-differensiering og vedlikehold av CIC [43] – [48], inkludert
KLF4, SOX2, POU5F1 /Oct4, MYCN
, og
KIT product: (Figur 3C). Data som vises i figur 3 viser at ko-stimulering av sfæroidene med TNF og TGFp fremmer fenotypiske forandringer i A549-celler som resulterer i økt invasjon og ekspresjon av genprodukter er forbundet med stem-lignende egenskaper.
Ettlagskulturer og 3D-A549 kulturer ble igjen alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGFB (TNF /TGF) i nitti-seks timer. (A) Celler ble skilt ut og underkastes deretter migrering og invasjon analyser. (B og C) Uttrykk for invasjon (
MMP-9, LOX, COL22A1
) og stamcellemarkører (
KLF4, Sox2, POU5F1, MYCN, og KIT
) ble målt ved QRT- PCR. Resultatene i figur 3 er beregnet gjennomsnitt ± SD, * p. 0,05, N = 3. Resultater fra 3B og 3C ble normalisert til
GAPDH
mesenchymalceller er svært metastatisk og displayet kreft initiere fenotyper
for å undersøke om induksjon av EMT fremmer utviklingen av CIC
in vivo
, vi utnyttet en xenograft tumor modell i nakne mus. TNF og TGFp behandlet 2D- og 3D-kulturer ble skilt ut og cellesuspensjoner ble SC sprøytet inn i høyre flanke av nakne mus. Førti dager senere, ble dyrene avlivet og SC svulster ble resected og veide mens lungene ble skåret ut og scoret for overflatemetastaser. Til vår overraskelse, TNF og TGFfi-behandlede celler ikke danne SC svulster i samme grad som cytokin-behandlede 2D kulturer (figur 4A, til venstre). Imidlertid undersøkelse av lungeoverflaten i disse musene viste omfattende metastasering (figur 4A, til høyre). Den eneste plausible forklaringen på disse resultatene er at mesenchymale celler fra 3D kulturer invaderte og spredning til lungene uten å utvikle SC svulster.
(A) Ettlagskulturer og 3D-A549 kulturer ble behandlet med TNF og TGFB i nitti-seks timer . Celler ble skilt ut og SC injisert inn i nakne mus (1 × 10
6 celler /dyr). Førti dager senere, ble de primære SC svulster resected og veies. I tillegg ble lungene skåret ut, og det antall overflate metastaser var bestemme. (B) Ettlagskulturer og 3D-A549 kulturer ble enten ubehandlet eller behandlet med TNF og TGFB og begrensende celle tall (1 × 10
3 /dyr) var SC injisert inn i nakne mus for å vurdere tilstedeværelse av CIC. Metastase ble evaluert ved overflaten lungetumor telle og lungetumorbelastning ble evaluert ved anvendelse av genomisk QRT-PCR for å påvise humant DNA i total lungevevet. Vekt og lungemetastaser data fra figur 4 er gjennomsnitt ± standardavvik av fem mus per tilstand, * p 0,05, N = 3 uavhengige eksperimenter. Genomisk QRT-PCR-data fra figur 4B er normalisert til total lungevevet (mg).
måle graden av metastase i henhold begrensende fortynning celle viser en pålitelig test for tilstedeværelse av anriket CIC i epitel-avledede svulster [49]. Derfor eksperimenter ble gjentatt ved bruk av ett-tusen celler per subkutan injeksjon. Cellesuspensjoner, avledet fra TNF og TGFB behandlet kuler, produsert flere overflatelungemetastaser etter begrensende celle fortynning enn cytokin-behandlede monolag eller ubehandlede 3D kulturer (figur 4B venstre). Begrense celle fortynning analyser tyder på at induksjon av EMT i 3D kulturer produserer en CIC befolkning som effektivt metastasizes til lungene. Som forventet, analyse av DNA isolert fra muselunger bekreftet tilstedeværelsen av metastatisk belastning og bekreftet at lesjoner var av human opprinnelse (figur 4B høyre). Vi konkluderer fra eksperimentene i figur 4 at de-differensiering, CIC formasjon, og metastatisk potensial er alle betydelig forbedret i EMT-indusert sfæroide kulturer.
NF-kB er konstitutivt aktiv i 3D kulturer og er nødvendig for induksjon av EMT
TNF, en potent NF-kB aktivator, øker induksjon av EMT i NSCLC cellelinjer. Derfor har vi vurdert om EMT induksjons resulterer i aktivering av NF-kB signalering av immunblot. Interessant, mesenchymale A549 kuler vises konstituerende IKK aktivitet målt ved fosfo-spesifikke antistoffer som gjenkjenner IκBα pS32 og RELA pS536 (figur 5A og figur S2A). Endring i E-cadherin og vimentin nivåer bekreftet effektiv EMT i cytokin-behandlede kuler. Videre QRT-PCR eksperimenter vist økt uttrykk av NF-kB-regulerte gener
IL8 Hotell og
BIRC3 /cIAP2
i mesenchymale 3D kulturer (figur 5B). Til sammen indikerer disse data at cytokin-behandling av 3D A549 kulturer resulterer i øket fosforylering av IKK-regulert substrater og konstitutiv NF-kB transkripsjonen aktivering.
Ettlagskulturer og 3D-kulturer av A549 celler ble inkubert med cytokiner for nitti -Seks timer. (A) Mesenchymale A549 celler vise konstituerende NF-kB aktivert trasé, som bestemmes ved hjelp phospho-spesifikke antistoffer mot IκBα og rela. (B) Ubehandlet og TNF og TGFp stimulert 2D- og 3D-kulturer av A549-celler ble høstet og analysert for ekspresjon av NF-kB regulerte gener ved QRT-PCR. (C og D) Tredimensjonale kulturer av A549.V (vektorkontroll) og A549.I (SR-IkB) ble inkubert i nitti-seks timer i fravær eller nærvær av TNF og TGFp. (C) immunoblot bekrefte ekspresjonen av den Flag-merket SR-IκBα i A549.I linje, som med hell blokkert nukleær translokasjon og DNA-bindings, målt ved EMSA. (D) QRT-PCR bekreftet manglende evne A549.I celle til oppregulere NF-kB-regulerte gener følgende TNF og TGFB behandling. Immunoblotter i Figur 5A er et representativt eksempel fra tre uavhengige forsøk. Resultatene i figur 5B og 5D er beregnet gjennomsnitt ± SD, * p 0,05, N = 3. RNA-verdier ble normalisert til
GAPDH
For å finne ut betydningen av NF-kB. kB aktivitet under induksjon av EMT i NSCLC cellelinjer, var stabile klonale bassenger uttrykker super-repressor IκBα (SR-IκBα) generert. SR-IκBα er motstandsdyktig mot proteasomal degradering, og dermed sequesters NF-kB i cytosol. Celler som uttrykker den SR-protein IκBα derfor vise en inhibering av NF-kB-mediert transkripsjon [50]. Figur 5C (øverst) bekrefter uttrykk for Flag-merket SR-IκBα i A549 stabile celler (A549.I) sammenlignet med tomme vektorkontrollceller (A549.V). Videre, kjerneproteinekstrakter fra A549.I sfæroide kulturer behandlet med TNF og TGFp, manglet NF-kB-DNA-bindende aktivitet sammenlignet med A549.V ekstrakter (figur 5C, nederst). Supershift eksperimenter bekrefter at NF-kB aktivitet består hovedsakelig av forhold-p50 heterodimerkompleksdannelse (figur S2B). QRT-PCR-analyser viser trykt cytokin-mediert induksjon av
IL8 Hotell og
BIRC3 /cIAP2
i A549.I celler sammenlignet med kontrollceller A549.V (figur 5D). I motsetning til høye doser av TNF (100 ng /ml), lave doser (10 ng /ml) ikke resulterte i et tap av cellelevedyktighet i A549.I linjer, siden ekspresjon av huset holde genet, HPRT, ble ikke endret og ble anvendt for å normalisere i Figur 5D. Disse data bekrefter at SR-IκBα uttrykk i A549.I cellelinjen effektivt blokkerer NF-kB transkripsjonen aktivitet.
Karakterisering av NF-kB i poten den mesenchymale fenotype
NF-kB har vært vist seg å regulere uttrykket av EMT herre-brytertranskripsjonsfaktorer i flere modellsystemer [21] – [24]. Derfor hypotese vi at inhibere NF-kB aktivitet i A549.I cellelinjen vil dempe EMT induksjon. Immunoblot-analyse bekreftet at A549.I celler mislykkes i å nedregulere E-cadherin ekspresjon eller oppregulere mesenchymale markører (vimentin, N-cadherin og Fibronectin) sammenlignet med kontrollceller (figur 6A). Videre cytokin-behandlede A549.I celler viste bare minimal oppregulering av
TWIST1
,
ZEB2 Hotell og
SNAI2
genuttrykk følgende TNF og TGFB behandling (figur 6B). Disse resultatene indikerer at NF-kB er nødvendig for å oppregulere
TWIST1
,
ZEB2 Hotell og
SNAI2
, mens uttrykk for
SNAI1
vises uavhengig av NF- kB-avhengig transkripsjon i A549.I cellelinje. Disse resultatene tyder på at uttrykket av kritiske EMT herre-bryteren transkripsjonsfaktorer krever NF-kB aktivitet.
(A) A549.I cellene ikke klarer å vise endringer i mesenchymale markører, som bestemmes av immunoblot analyse. (B) NF-kB er nødvendig for å oppregulere mRNA uttrykk for herre-brytertranskripsjonsfaktorer. (C) spheroid kulturer av A549 og H157 cellelinjer, uttrykker tom vektor eller flagget-IkB super-repressor, var igjen alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGFB (TNF /TGF) i nitti-seks timer. Cellene ble skilt ut og utsatt for invasjon analyser. (D) A549.V og A549.I 3D kulturer ble igjen alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGFB (TNF /TGF) i nitti-seks timer. Cellene ble skilt ut og SC injisert inn i nakne mus (1 x 10
6 /dyr). Førti dager senere ble dyrene avlivet, og antallet av overflatelungemetastaser ble bestemt. I tillegg ble SC tumorer skåret ut og våt tumorvekt bestemt. Vekt og lungemetastaser data fra Figur 6 er gjennomsnitt ± standardavvik av fem mus per tilstand, * p 0,05, N = 3 uavhengige eksperimenter. Grafene i figur 6 er gjennomsnitt ± standardavvik, * p 0,05, av tre uavhengige forsøk. Data med
P
verdier større enn 0,05 ble betraktet som ikke signifikant (
ns
). QRT-PCR eksperimenter er normalisert til
GAPDH
uttrykk.
Deretter vurderes vi enten NSCLC nødvendig NF-kB for invasjonen hjelp Transwell analyser. Inhiberte NF-kB aktivitet i A549.I cellene opphevet invasjon gjennom Matrigel i forhold til styreledningene (figur 6C). Denne effekten ble ikke cellelinje spesifikke siden en annen NSCLC linje som uttrykker SR-IKB (H157.I) viste lignende resultater som A549.I celler. Fordi data som er vist i Figur 6 indikerer at NF-kB er nødvendig for NSCLC å gjennomgå EMT, testet vi A549.V og A549.I celle for deres evne til å metastasere til lungene ved hjelp av en naken mus modell. Som forventet, cytokin-behandlede A549.I cellene ikke klarte å danne lungemetastaser (figur 6D, til venstre). Manglende evne til disse cellene til å metastasere til lungene var ikke på grunn av tap av celle levedyktighet eller en manglende evne til å danne primære svulster, ettersom ubehandlet A549.I dannet SC svulster med liknende vekstrater som A549.V celler (Figur 6D, høyre). Således data som er vist i Figur 6 indikerer at TNF og TGFp behandlede 3D NSCLC-kulturer krever NF-kB å oppregulere hovedbryteren transkripsjonsfaktorer, fremkall EMT, og fremme invasive egenskaper. Videre uten NF-kB transkripsjonen aktivitet A549 cellene mister sin evne til å metastasere til lunge uten at primærtumorvekst.
Discusson
NF-kB regulerer EMT å forsterke metastatisk progresjon av NSCLC
gjennomført en enkel og forholdsvis rask 3D kultursystem for å undersøke viktigheten av NF-kB-signalering under EMT induksjon og CIC forplantning i NSCLC-cellelinjer. Som svar på TNF og TGFfi eksponering, A549 sfæroide kulturer viste et tap av E-cadherin og forhøyet uttrykk av mesenchymale markører, N-cadherin, vimentin, og Fibronektin. Den økte uttrykk for mesenchymale proteinmarkører skjer sannsynligvis på grunn av induksjon av EMT hovedbryter transkripsjonsfaktorer,
TWIST1
,
SNAI1
,
SNAI2 Hotell og
ZEB2
. Videre sfæroide populasjoner av mesenchymale A549 cellene vise forhøyet uttrykk av endogene transkripsjonsfaktorer som er kjent for å forsterke dedifferentiation, inkludert
KLF4
,
SOX2
,
POU5F1
,
MYCN
og
KIT
. Interessant, mesenchymale A549-celler fra kulturer sfæroide mislyktes i å generere store SC tumorer, sammenlignet med 2D-kulturer. Til tross for denne effekten, cytokin-behandlede 3D-A549 celler vises forhøyede lungeoverflaten metastatiske lesjoner. Disse resultatene støtter hypotesen om at CIC ekstravasert inn i sirkulasjonssystemet og metastaserer til lungene uten å danne SC svulster. Vi har videre demonstrert at EMT-induserte A549 3D-kulturer effektivt å metastasere til lungene i henhold begrensende celle fortynninger, noe som bekrefter nærværet av en anriket «stamme-liknende» CIC befolkning.
