Abstract
Blærekreft har en høy forekomst med betydelig sykelighet og dødelighet. Svekket ekspresjon av DNA-skade responsen protein Xeroderma pigmentosum komplemente gruppe C (XPC) er blitt beskrevet i blærekreft. XPC spiller en avgjørende rolle som den viktigste initiator og skade-detektor i global-genomet nukleotid-excision reparasjon (NER) av UV-indusert lesjoner, voluminøse DNA-addukter og intrakjede tverrbindinger, slik som de som er laget av det kjemoterapeutiske middel Cisplatin. Derfor kan XPC protein være en informativ biomarkør for å veilede tilpassede behandlingsstrategier i en undergruppe av blære kreft tilfeller. Derfor, målte vi XPC proteinekspresjon nivå og funksjonell NER aktivitet av 36 blæretumorer på en standardisert måte. Vi optimaliserte forhold for dissosiering og
in vitro
kultur av primære blære kreft celler og bekreftet dempes XPC uttrykk i ca 40% av svulstene. Men NER aktivitet var lik co-cultured villtype celler i alle unntatt én av 36 blæren svulster. Vi konkluderer med at (i) funksjonell NER mangel er et relativt sjeldent fenomen i blærekreft og (ii) XPC protein nivåer er ikke nyttig som biomarkør for NER aktivitet i disse svulstene
Citation. Naipal KAT, Raams A , Bruens ST, Brandsma jeg, Verkaik NS, Jaspers NGJ, et al. (2015), svekkede XPC Expression er ikke forbundet med nedsatt DNA Repair i blærekreft. PLoS ONE 10 (4): e0126029. doi: 10,1371 /journal.pone.0126029
Academic Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, TYSKLAND
mottatt: 05.01.2015; Godkjent: 27 mars 2015; Publisert: 30 april 2015
Copyright: © 2015 Naipal et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. forskningen som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra det europeiske fellesskap syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under tilskuddsavtalen No. HELSE-F2 2010-259893 (DDResponse) til JH, RK og DVG, URL: https://cordis.europa.eu/fp7/home_en.html; Nederlandsk Cancer Society (KWF) stipend nr. 2011-5030 til JH, URL: https://www.kwf.nl/Pages/default.aspx; og Vereniging Trustfonds Erasmus University Rotterdam til JB, URL: https://www.eur.nl/eur/fondsen/trustfonds/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft (BC) er det femte vanligste kreftformen i Europa med en insidens på mer enn 150.000 tilfeller har resultert i mer enn 50.000 dødsfall per år [1]. Blæren svulster stede enten som ikke-muskel-invasiv (NMIBC) (sytti%) eller eksempel muskel-invasiv blærekreft (MIBC) (30.%) [2]. MIBC er en potensielt dødelig sykdom med en 5-års overlevelse på 50-60% [3]. Behandling av MIBC innebærer hovedsakelig kirurgi og systemiske kjemoterapeutiske behandlinger, sistnevnte hovedsakelig for residiverende eller metastatisk sykdom.
Det er et klart klinisk behov for utvikling av nye systemiske behandlingsstrategier for MIBC, som overlevelse av MIBC pasienter har ikke bedret de siste tiårene. Behandlinger målrettet mot tumorspesifikt veier har vist seg å være effektive i forskjellige krefttyper, for eksempel bryst, eggstokkreft og renal kreft, men for BC slike behandlinger ikke er tilgjengelig. Terapi rettet mot DNA skade respons (DDR) mekanismer er lovende tilnærminger i kreft behandling [4]. DDR mekanismer er viktig for vedlikehold av genomisk stabilitet gjennom DNA-reparasjon, cellesyklusregulering og apoptose. Funksjonaliteten av spesifikke DDR baner er en viktig parameter som bidrar til følsomheten av maligne celler til DNA-ødeleggende kjemo- og stråleterapi. I tillegg kan målrette spesifikke defekter i DDR trasé resultere i en mer effektiv behandling. For eksempel, DDR defekt som skyldes
BRCA1
eller listen
BRCA2
mutasjoner i bryst og eggstokkreft sensitizes Disse svulstene inhibitorer av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) [5,6] . Dermed bestemme DDR status av individuelle svulster kan være verdifulle for den anti-kreftbehandling valg.
nukleotid excision reparasjon (NER) er ansvarlig for reparasjon av et bredt spekter av ulike typer DNA-skader produsert av miljø mutagene og kreftfremkallende stoffer. Strukturelt ubeslektede lesjoner reparert av NER inkluderer UV-induserte helix skjevheter, klumpete DNA-addukter og intratverrbindinger (f.eks fremkalt av medikamenter som Cisplatin) [7]. To store subpathways av NER inkluderer global genomet NER (GG-NER) og transkripsjon kombinert NER (TC-NER). Xeroderma pigmentosum complementation gruppe C (XPC) er spesielt involvert i GG-NER og tjener som en skade anerkjennelse protein i kompleks med HR23B. Først etter skade anerkjennelse av XPC-HR23B kjerne NER proteiner er rekruttert til lesjonen og NER utføres [8]. Dette tyder på at XPC er det hastighetsbegrensende faktoren i GG-NER
Flere linjer av bevis tyder på at NER gener spiller en rolle i utvikling og progresjon av BC.; polymorfismer i noen NER gener øker BC risiko, spesielt i røykere [9-12]. Videre ble det vist at det svekkede ekspresjon av proteinet NER XPC er til stede i ~ 40% av alle blæretumorer og en medvirkende faktor i tumorutvikling [13.]. Dessuten hypermethylation av
XPC
genpromoteren er vesentlig høyere i BC sammenlignet med normale slimhinner og er assosiert med høyere patologisk stadium, tilstedeværelse av metastasering og p53-mutasjoner [14]. Disse observasjonene tyder på at bestemt
XPC
defekter i BC forårsake defekt NER og et dårlig resultat i en subgruppe av svulster. På den annen side,
XPC
defekter kan utnyttes for individualisert målrettet kjemoterapi. Ved selektivt rettet mot NER feilen ved hjelp av forbindelser som induserer spesifikke DNA-skade hvis reparasjon krever NER, f.eks Cisplatin kan økt cytotoksisitet oppnås i NER mangelfulle kreftceller.
I denne studien ønsket vi å identifisere XPC uttrykk nivåer i enkelte kliniske BC prøvene sammen med funksjonell NER aktivitet, som et utgangspunkt for individualisert behandling . Vi etablerte et reproduserbar metode for å få en kortsiktig enkelt lag cellekultur fra ferske blæren vevsprøver for å utføre våre analyser og konkluderer med at lav XPC uttrykk ikke nødvendigvis resulterer i defekt NER
Materialer Metoder
Samling av menneskelige blærekreftprøver
BC prøver (n = 105) var samlet på Erasmus MC Rotterdam. Ni tumorprøver ble innhentet av radikal cystektomi og den gjenværende av Trans urethral reseksjon (TUR). Ved høsting ble vevsprøver direkte transportert til laboratoriet i transportmedium (RPMI-1640, 10% føtalt kalveserum og antibiotika). Alle prøvene ble deretter gitt en unik kode og forskerne ble blindet for pasientdata. Alle tumorprøver ble evaluert etter standard HE farging og tumorstadium og klasse ble vurdert av patologen ifølge WHO klassifisering 1973 og 2009.
Blære Prøver ble samlet som kirurgisk restmateriale. Ifølge sykehuspolitikk pasienter ble gjort oppmerksom på at restmateriale kan brukes til forskningsformål med mindre pasienter velger å ikke delta. Alle materialer ble kodet på en slik måte at forskere ikke kunne spore tilbake informasjon til den enkelte pasient. Derfor ble det ikke eksplisitt skriftlig /muntlig informert samtykke innhentes og behovet for skriftlig /muntlig informert samtykke ble frafalt av Institutional Review Board of Erasmus MC og denne konkrete forskningsprosjekt og prosedyren ble godkjent av IRB (METC-2012-113).
Tissue kultur
vevsprøver ble manuelt skiver i små biter ved hjelp av kirurgisk saks og deretter utsatt for dissosiasjon bruker Miltenyi Biotec Tumor dissosiasjon Kit i kombinasjon med en gentleMACS Dissociator henhold til produsentens protokoll. Cellesuspensjonene ble sådd ut på glass dekkglass på AmnioMax-C100 medium (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) og inkubert over natten ved 37 ° C, 5% CO
2 og atmosfærisk oksygen. Dersom et tilstrekkelig antall av tumorceller var festet, et lite antall av vill-type humane fibroblaster, C5RO, ble tilsatt til kulturen for å tjene som interne kontroller for standardisert tilfeldig DNA-syntese (UDS) analyse som ble utført i den neste dag. For å skille de C5RO celler fra kreftceller, ble deres cytoplasma forhånd merket med 2.0μm polystyrenkuler [15].
Blære cellelinjer ble oppnådd fra ATCC (HT-1197 [ATCC CRL-1473] og T24 [ATCC HTB-4] og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FCS og antibiotika.
tilfeldig DNA Synthesis (UDS) assay
UDS-analysen ble utført ved UV-stråler celler med 16 J /m
2 UVC lys og deretter merking av cellene i tre timer med 20 uM 5-etynyl-2′-deoksyuridin (eDU, en tymidinanalogen) i dyrkningsmedium (Hams F10 uten tymidin, 10% dialysert FCS, antibiotika) [16, 17]. Deretter ble cellene vasket og inkubert på medium supplert med 10 uM tymidin i 15 minutter for å eliminere ikke-spesifikk binding eDU. cellene ble fiksert ved å bruke 3,7% formaldehyd i PBS inneholdende 0,5% Triton X-100. eDU inkorporering ble visualisert ved fluorescens mikroskopi ved hjelp av Klikk-it kjemi (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll og kvantifiseres ved bildeanalyse ved hjelp FIJI (ImageJ).
immunfluorescens farging
for å visualisere XPC-protein, faste celler ble inkubert med et primært antistoff mot XPC (Santa Cruz D-10; sc-74410 fortynnet 1/1000) i 90 minutter og en sekundær Alexa 488 eller 594 konjugert antistoff i 60 min, før montering i DAPI inneholdende monteringsmedium (Vectashield). Spesifisiteten av antistoffet ble testet på XPC villtype (C5RO) vs (XPC mangelfulle XP21RO) -celler.
Bildeanalyse
XPC samt UDS farging av minst 50 individuelle tumorcellekjerner ble kvantifisert ved standard bildebehandlingsprogrammer (ImageJ) og sammenlignet med minst 20 C5RO kjerner på samme lysbilde. Deretter ble standardisert XPC og UDS nivåer av kreftceller beregnet som:
Immunohistochemistry farging
Å visual XPC på formalinfiksert parafin integrert (FFPE) deler av blæren svulster, delene ble varmet opp til 95 ° C i 15 minutter med antigen gjenfinning buffer (DAKO S1699) og permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i PBS i 20 minutter. Primære antistoff (anti-XPC Santa Cruz D-10, sc-74410 fortynnet 1/1000) ble tilsatt, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 ° C. Sekundære HRP antistoff ble inkubert i 60 min ved værelsestemperatur og visualisert ved bruk av DAB-peroksidase kjemi (DAKO K6438). Prøvene ble analysert kvantitativt ved hjelp av en immunhistokjemisk scoringssystem (S1 Fig). Dette immunoreaktivitet scoring (IRS) Systemet tar hensyn til prosentandelen av positive celler og intensiteten av den observerte farging [18].
Immunoblotting
Immunoblotting, under anvendelse av polyklonalt kanin-anti-XPC [19 ] og mus monoklonalt anti-Tubulin (klon: B-512, Sigma-Aldrich) i en time ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer IRDye 800CW Esel-anti-mus IgG (H + L) (LI-COR) og IRDye 680RD esel anti-kanin IgG (H + L) (LI-COR) i en time ved romtemperatur i mørket. Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av Odyssey 3.0 (LI-COR).
Colony overlevelse
150 celler per brønn ble sådd i seks-brønner plater og hver tilstand ble belagt i tre eksemplarer. Neste dag, når cellene var festet, ble de behandlet med 0, 2, 4, 6 og 8 J /m
2 UVC. Etter 8 dagers inkubasjon ble cellene farget med 0,1% Coomassie Brilliant Blue i minst 30 min. Kolonier ble telt med GelCount (Oxford Optronix).
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av IBM SPSS statistikk V21 og GraphPad Prism v5.
Resultater
XPC uttrykk i blærekreft
Førtisyv ut av 105 innsamlede tumorprøver inneholdt tilstrekkelig svulst å generere FFPE- seksjoner. XPC protein-ekspresjon ble undersøkt i disse 47 tumorer ved immunhistokjemi og et bredt spekter av XPC nivåer ble observert. Hoveddelen (58%) av prøvene viste sterk XPC uttrykket (IRS = 3), mens 38% av prøvene viste reduserte nivåer (IRS = 1 eller 2). I 4% (2 tilfeller) bare bakgrunnsnivåer ble oppdaget (IRS = 0) (Fig 1A og S1 figur). XPC nivåer viste ikke signifikant korrelasjon med svulst scenen (Kruskal-Wallis; p = 0,53) og heller ikke med svulst Karakter (Mann-Whitney, p = 0,66). (Fig 1B og 1C)
A. Frekvensfordeling av XPC IRS klassifikasjoner i 47 TURB prøver. B. Frekvensfordeling av XPC IRS klassifikasjoner basert på tumorstadium. Forskjeller i IRS klassifikasjoner var ikke statistisk signifikant (Kruskal-Wallis test, p = 0,5266). C. Frekvensfordeling av XPC IRS klassifikasjoner basert på svulst klasse. Forskjeller i IRS klassifikasjoner var ikke statistisk signifikant (mann-Whitney test, p = 0,6612).
Optimalisere ex vivo kultur dissosierte blærekreftceller
Deretter undersøkte vi om forskjellen i XPC proteinekspresjon korrelert med variasjoner i DNA-reparasjonsevne. NER aktivitet kan kvantifiseres ved å måle reparasjon-assosiert DNA syntese (også kalt tilfeldig DNA-syntese (UDS)). UDS assay måler inkorporeringen av et merket nukleosid, 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EDU), etter eksponering for UV-C-bestråling (overveiende 254 nm), og blir bestemt i celler som ikke gjennomgår S-fase-avhengig DNA syntese [20]. UDS assay krever en enkelt celle lag av celler, fordi UV-C-stråling ikke trenge inn tykke vevsbiopsier. Derfor ble etablert en reproduserbar metode for å få en kortvarig enkeltlags cellekultur fra friske blære tumorprøver.
Først sammenlignet vi flere dissosiasjon metoder for å oppnå cellekulturer fra BC-biopsier på glass dekkglass. Enzymatiske dissociations ved hjelp av ulike proteaser ga lave suksessrate med hensyn til tumorcellebinding. Vi vurderte feste vellykket når tumorcellene er koblet til mer enn 5% av kulturskålen overflate. Vedlegg mellom 5-30% ble ansett som middels, mens over 30% indikerte passende vedlegg (tabell 1). Vi oppnådde festet tumorceller i bare 35% av tumorer ved behandling Collagenase VII, mens ingen feste ble oppnådd med trypsin eller Dyspase behandlingene (tabell 1). Spesielt, i tilfelle av celler som knytter seg til glassdekkglass, små klumper av celler festet på en mer effektiv enn enkeltceller (Fig S2A). På den annen side, dissociator dissosiasjon analyser ved anvendelse av Miltenyi Biotec Tumor dissosiering kit og gentleMACS resulterte i enkel cellelagskulturer i omtrent 80% av tumorene (tabell 1). For å skille disse uroteliale tumorceller fra fibroblaster som ofte forurense slike primærkulturer, utførte vi en farge mot cytokeratin 18. Ved passende feste de fleste cellene farget positivt for cytokeratin 18, som indikerer en ren urothelial tumor cellekultur (S2B fig) . På den annen side, tumor biopsier som vist etsings effekter på HE-farging, som indikerer diathermisk fjerning av svulster, ikke fester seg til dekk muligens skyldes (tumor) celledreping ved overdreven oppvarming. Videre tumorbiopsiprøver avledet fra Cystektomi eksemplarer som er festet med suksess i kun en av ni prøver, hvilket indikerer at invasive blæretumorer er vanskelige å dyrke
ex vivo
på et enkelt celle lag.
Forskjellige belegg strategier av dekkglass, slik som gelatin, fibronektin og Poly-L-lysin førte ikke til bedre festing av celler (data ikke vist). Til slutt har vi testet forskjellige cellekulturmedier for å øke bindingen av tumorceller. Media bestående av DMEM eller RPMI-1640 (begge supplert med 10% FCS og antibiotika) viste festing av celler på mindre enn 50% av prøvene, mens AmnioMax-C100 medium oppnådd vedlegg i mer enn 80% av prøvene (tabell 2). Kombinasjonen av Miltenyi Biotec dissosiasjon metode og AmnioMax-C100 medium ble brukt i alle etterfølgende produsentens eksperimenter og resulterte i en kortsiktig ett lag BC tumor cellekultur innen to dager etter fjerning av svulster.
UDS i blærekreft prøver
Funksjonell NER-aktivitet ble analysert i vedlagte tumorceller fra 36 forskjellige blæren svulster ved hjelp av UDS analysen. I tillegg har vi vurderes XPC-proteinnivåer i de samme cellene ved immunfluorescerende farging. Ledelsen til XPC og UDS ble utført ved hjelp av en scoring metode som sammenlignet den gjennomsnittlige fargeintensitet av kreftceller enn på vanlige menneskers C5RO fibroblaster, som var co-dyrket på samme dekkglass som kreftceller. Fibroblaster i de blandede kulturer ble merket med 2 um polystyrenkuler for å diskriminere dem fra tumorceller (Fig 2). Nesten 42% (15/36) av de blæretumorer som uttrykkes i det minste to ganger lavere nivåer av XPC protein enn co-dyrkede fibroblaster (0-50%) (Tabell 3). De fleste svulster vises nær normale nivåer av XPC protein (50-180% av co-kultivert fibroblaster). Vi observerte ikke XPC flekker intensiteter på mindre enn 5%, et nivå vanlig for XPC-mangelfull fibroblaster (XP21RO) hentet fra en XP-pasienten (figur 3A). Bemerkelsesverdig, XPC uttrykk viste veldig svak korrelasjon med UDS i disse svulstene: R
2 = 0,32 (Fig 3B). De fleste svulster med relativt lave XPC nivåer vises normale UDS nivåer (figur 2B og 3). Normale UDS (mer enn 50% av co-kultivert fibroblaster) ble observert i 34 Av 36 tumorprøver (tabell 3). To tumorer, viste redusert UDS (mindre enn 50% av ko-dyrkede fibroblastceller kontroller), men i en av disse UDS var nær 50%, mye høyere enn det som observeres i XPC
– /- celler (figurene 2C og 3A) . Den andre tumor viste XPC og UDS nivåer lik som XPC
– /- celler. Uheldigvis, på grunn av mangel på materiale ikke lenger genetisk analyse på denne tumoren kunne utføres. Avsluttende kan relativt lave nivåer av XPC uttrykk fortsatt støtte NER aktivitet og redusert XPC uttrykk ikke nødvendigvis påvirke NER aktivitet i ex vivo dyrkede BC celler.
A. Øvre venstre bildet viser alle DAPI kjerner. Til høyre er et lyst felt (BF) bilde hvor C5RO celle er merket med cytoplasmatiske polystyren perler. Neste: XPC fluorescerende farging viser XPC protein uttrykk av kreftceller til å være lik i forhold til tilstøtende villtype fibroblast. Øvre høyre bilde: Edu fluorescerende flekker viser UDS signal av kreftceller til å være lik i forhold til tilstøtende villtype fibroblast. B. Midt rad av bildene representerer en blære svulst prøve med lavere XPC uttrykk i forhold til C5RO celler imidlertid normale nivåer av UDS. C. Nedre rad av bildene representerer en blære svulst har lav XPC uttrykk samt lave UDS nivåer. Hvit pil viser villtype C5RO celle. Andre kjerner representerer bestemt blærekreft prøven.
A. Hver svulst er representert med sin respektive score for XPC og UDS nivåer i prosent av co-kultivert C5RO celler. Ingen svulster viste XPC nivåer så lavt som XP21RO, en XPC mangelcellelinje. En svulst viste UDS score ligner XP21RO. B. scatterplot av UDS og XPC score til hver svulst. XPC nivåer er ofte lavere enn 50%. To tumorer vise UDS nivåer lavere enn 50%, men fra en av disse UDS nivåene er nær 50%. Koeffisienten (R
2 = 0,32) indikerer ingen eller svært svak korrelasjon.
Dette funnet er uventet i lys av en tidligere publikasjon som viser at XPC uttrykk nivåer variert blant et lite panel av individuelle etablerte BC cellelinjer, og at en cellelinje med lav XPC proteinnivå har sunket DNA-reparasjonsevne. Vi har oppnådd denne cellelinjen (HT-1197) fra ATCC innsamling og sammenlignet den med et BC-cellelinje med normal XPC uttrykket (T24). Overraskende, vi ikke observere en forskjell i XPC protein nivåer eller UDS nivåer mellom normale fibroblaster, T24 og HT-1197 celler, selv om fibroblaster avledet fra en XP-pasient (XP21RO) viste klart redusert XPC protein nivåer og redusert UDS (S3A fig) . Deretter sammenlignet vi XPC nivået av HT-1197 og andre kjente XPC-dyktige og -deficient celler ved immunoblotting (Fig S3b). Igjen, HT-1197 ikke vise en redusert XPC nivå, mens de kjente XPC-mangel celler viste en klar mangel på XPC protein. Vi har også analysert følsomheten av HT-1197 og T24 til UV-C-stråling ved å utføre en koloni overlevelse analyse og fant ingen forskjell i følsomhet (S3C Fig). Derfor konkluderer vi med at HT-1197 ikke har en redusert XPC proteinnivå eller redusert NER kapasitet.
XPC uttrykk og tilbakefall risiko for BC
Til slutt, for å undersøke om tumorresidiv har noen innvirkning på XPC protein uttrykk nivåer vi samlet flere klinisk relevante data og sammenlignet XPC protein nivåer fra grunnskole NMIBC til at av tilbakevendende NMIBC. XPC nivåer var ikke signifikant forskjellig (Mann-Whitney; p = 0,58) mellom disse to gruppene (S4A Fig). Også XPC protein nivåer var ikke signifikant forskjellig (Mann-Whitney, p = 0,77) mellom svulster som viste tilbakefall innen ett år og svulster som ikke gjorde det. Disse dataene ble samlet inn via oppfølging av pasientene, uavhengig av om en analysert BC prøven var en primær svulst eller en gjentakelse (S4B fig). Dette innebærer at XPC uttrykk nivåer dårlig korrelerer med risiko for tilbakefall av NMIBC.
Diskusjoner
I tråd med tidligere studier [13,14], fant vi at svekket XPC protein uttrykk er en vanlig fenomen i BC, både i dissosierte tumorceller, så vel som i FFPE-prøver. Imidlertid gjorde tidligere studier analyserer ikke funksjonell NER aktivitet i BC. Derfor utviklet vi en
ex vivo
cellekultur systemet til å utføre UDS analyser, et funksjonstest for NER aktivitet. Her bekrefter vi at XPC uttrykk varierte mye mellom primær BC prøvene, men overraskende, vi fant ut at senket XPC protein nivåer ikke generelt påvirke NER kapasitet i BC. Enda viktigere, synes funksjonell NER mangel å være mye mindre hyppig i BC enn forventet basert på tidligere undersøkelser. Reduserte nivåer av XPC protein i disse svulstene virket tilstrekkelig til å funksjonelt støtte NER. I tillegg gjorde vi ikke observere en sammenheng mellom XPC uttrykk og svulst klasse eller scene, vi har heller ikke observere en relasjon med tumorresidiv risiko. Vi konkluderer med at XPC protein nivåer bør ikke brukes som en biomarkør for å velge blæren svulster for nedsatt DNA-reparasjon kapasitet.
I denne studien, viser vi at alvorlige funksjonelle NER defekter som konferere overfølsomhet for kjemikalier forårsaker NER-reparerbar skade, er sjeldne i BC. Derfor er det lite trolig at svekket NER aktivitet kan utnyttes terapeutisk i BC. Videre kan hyppigheten av XPC defekter i BC overvurderes i litteratur, som vi ikke fant en XPC heller NER feil i HT-1197 cellelinje, som tidligere ble rapportert til båtplass slike mangler [13]. Forskjeller i deteksjonsmetode XPC uttrykket nivåer eller DNA reparasjonskapasitet kan forklare disse avvikene. Likevel, mange rapporter tyder på at
XPC
genet polymorfismer kan påvirke BC risiko eller prognose [10,12,21]. Det er fortsatt ukjent om disse polymorfismer påvirker XPC uttrykk, men det kan være at den senket XPC uttrykk og polymorfismer har en subtil innflytelse på NER aktivitet, noe som kan bidra til økt mutagenese og karsinogenese, spesielt i tilfeller av eksponering for visse DNA-skadelige stoffer, f.eks sigarettrøyk. Vår studie er den første til å beskrive sammenhengen mellom funksjonelle NER aktivitet og XPC proteinnivåer målt direkte i primær blærekreft. I vår analyse, NER aktivitet på mer enn 50% (av co-kultivert fibroblaster) ble ansett som normalt, og en mild nedgang vil ikke bli plukket opp. På den annen side, analyser UDS utført på flere NER genet defekter, i mus samt menneskelige celler, viser betydelig senket NER aktiviteter (mindre enn 50% av co-kultivert fibroblaster). Denne konkluderer med at UDS analysen er egnet til å påvise en NER mangel. I XP21Ro celler åpen XPC nivåer på rundt 5% korrelert godt med 10% rest NER aktivitet. Ingen av svulster analysert viste dette lave nivået av XPC, noe som tyder på at de observerte XPC nivåene er i stand til å støtte nær normal NER og at XPC er sannsynligvis ikke hastighetsbegrensende i disse svulstene. Den ex vivo primærtumor kulturmodell anvendt i denne studien er spesielt utviklet og optimalisert for å nøyaktig analysere NER egenskapene til individuelle blæretumorprøver. Den primære tumor ble dissosiert, og cellene ble dyrket på glass dekkglass for å lette standardiserte UDS analyser og XPC målinger av immunofluorescent avbildning. Denne kulturen systemet viste robust reproduserbarhet og kan derfor brukes til å screene kliniske vevsprøver ved hjelp av funksjonelle
ex vivo
analyser. Den høye suksessrate på denne metoden hindrer innføring av et utvalg skjevhet forårsaket av utvekst av bare en undergruppe av kliniske kreft prøver. Derfor kan denne dyrkningsmetode bidra til identifisering av biomarkører som kan forutsi respons til anti-kreftbehandling
Vårt eksperimentell design har den fordel at andre celler kan ko-dyrket med tumorcellene som interne kontroller, noe som eliminerer eksperimentell variasjon mellom prøvene. Faktisk kan flere kontrollcellene være innarbeidet ved bruk av polystyren-perler av forskjellig størrelse eller fluoriserende farge. På denne måten har vi også lagt merke til at en svulst med lavere UDS viste høyere nivåer av rest reparasjon kapasitet enn en XPC
– /-. Celle, noe som indikerer at NER ikke ble fullstendig opphevet ved at prøven
Dermed blir viktig første konklusjonen fra våre resultater er at XPC nivåer ikke kan brukes som en biomarkør for å veilede behandling valg eller behandling respons på NER-reparerbare DNA-skadende midler i BC. Vi konkluderer også at
ex vivo
kultur system og UDS analysen er godt egnet verktøy for å identifisere svulster (andre enn BC) med nedsatt NER aktivitet. Videre kan nye funksjonelle DNA-reparasjons analyser bli utviklet for å vurdere aktiviteten av andre DNA-reparasjonsbaner i tumorceller og derved identifisere DNA reparasjon av feil som kan utnyttes terapeutisk. Spesielt denne studien understreker den store betydningen av funksjonelle analyser for å evaluere resultatene av mer indirekte målinger som RNA og protein uttrykk nivåer.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Immunoreaktivitets scoring system (IRS).
A. IRS scoring system. B. Representative bilder av XPC flekker på blærekreft prøver for ulike kategorier av IRS
doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s001 product: (PDF)
S2 Fig. Små klumper av celler feste til å dekke slips.
A. Representative lyse felt bilder som viser forskjellige klumper av samme svulst som knytter seg til dekkglass og spres ut. B. Ved passende feste de fleste celler farget positivt for cytokeratin 18, som indikerer en ren svulst cellekultur og ingen forurensende fibroblaster. Blå = DAPI, Grønn = cytokeratin 18.
doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s002 product: (PDF)
S3 Fig. HT-1197 viser normal XPC protein og UDS nivåer.
A. Immunofluorescent bilder sammenligne XPC og UDS nivåer av XP21RO, T24 og HT-1197 celler til det i C5RO celler. XP21RO er kjent for å være mangelfull i XPC og UDS. Ingen forskjell er sett mellom T24 og HT-1197. Blå = DAPI, BF = Bright Feltet bilde som viser C5RO celler merket med 2 mikrometer isopor perler, Grønn = XPC uttrykk nivå, Rød = UDS nivå. Hvite piler indikerer kjerner av den respektive cellelinje. B. Immunoblot for XPC sammenligne HT-1197 til T24, kjent XPC mangelfulle og villtype fibroblaster. C. koloni overlevelse analyse viser kolonidannelse kapasiteten til HT-1197 og T24 celler etter UV-stråling. Ingen forskjell mellom HT-1197 og T24 er observert. Feilfelt angir standardavviket basert på fire uavhengige forsøk
doi:. 10,1371 /journal.pone.0126029.s003 product: (PDF)
S4 Fig. XPC protein nivåer og tilbakefall av svulster.
A. Svulster ble delt i to grupper, primære svulster og tilbakevendende svulster, og standardiserte XPC protein expression skår ble sammenlignet fra disse gruppene. ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom disse gruppene. Mann-Whitney test p = 0,58. B. Pasient oppfølging data indikerer ingen forskjell mellom XPC nivåer fra tumorer som ikke ville gjenta seg innen ett år TUR og svulster som ville skje igjen. Hvert datapunkt representerer en tumor. Horisontal linje representerer median og feilfelt indikerer indre kvartilområdet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0126029.s004
(PDF)
Takk
Forfatterne ønsker å takke den kliniske team av avdelingen for urologi og patologi avdeling Erasmus Medical Center i Rotterdam for støtte i å samle inn forskningsmateriale.
