Abstract
Cytoglobin er en intracellulær globin av ukjent funksjon som uttrykkes hovedsakelig i celler i en myofibroblast avstamning. Mulige funksjoner av cytoglobin omfatte bufring av intracellulær oksygen og avgiftning av reaktive oksygenarter. Tidligere arbeid i vårt laboratorium har vist at cytoglobin gir beskyttelse mot oksidant-indusert DNA-skader når spissen uttrykt
in vitro
, men betydningen av dette i mer fysiologisk relevante modeller av sykdommen er ukjent. Cytoglobin er en kandidat til tylosis med spiserørskreft genet, og dens uttrykk er sterkt nedregulert i ikke-kreft i øsofagus biopsier fra pasienter med TOC sammenlignet med normale biopsier. Derfor øsofagus celler gir en ideell eksperimentell modell for å teste vår hypotese om at nedregulering av cytoglobin uttrykk sensitiviteten cellene til de skadelige effektene av reaktive oksygenforbindelser, skader spesielt oxidative DNA, og at dette potensielt kan bidra til innholdsfortegnelsen fenotype. I denne studien har vi testet denne hypotesen ved å manipulere cytoglobin uttrykk i både normale og spiserørskreft cellelinjer, som har normal fysiologisk og ikke uttrykk for cytoglobin hhv. Våre resultater viser at, i samsvar med tidligere funn, over uttrykk for cytoglobin i kreftcellelinjer som gis beskyttelse mot kjemisk-induced oxidative stress, men dette ble bare observert ved ikke-fysiologiske konsentrasjoner av cytoglobin. I tillegg, nedregulering av cytoglobin i normale øsofagus celler hadde ingen virkning på deres følsomhet for oksidativt stress som bedømt ved en rekke endepunkter. Vi konkluderer derfor med at normale fysiologiske konsentrasjoner av cytoglobin ikke tilbyr cytobeskyttelse fra reaktive oksygenforbindelser, i hvert fall i dagens eksperimentelle modellen
Citation. McRonald FE, Risk JM, Hodges NJ (2012) Beskyttelse mot Intracellulær oksidativt stress ved Cytoglobin i Normal og Kreftspiserøret Cells. PLoS ONE 7 (2): e30587. doi: 10,1371 /journal.pone.0030587
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 11 november 2011; Godkjent: 22 desember 2011; Publisert: 16 februar 2012
Copyright: © 2012 McRonald et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cancer Research UK prosjektstøtte C7738 /A10476. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cytoglobin er et medlem av familien av globin haemoproteins som inneholder hemoglobin og myoglobin, så vel som de mer nylig identifiserte neuroglobin som uttrykkes hovedsakelig i cellene i sentralnervesystemet [1]. Krystallstrukturen av cytoglobin er løst og studert i detalj [2], [3], [4] som viser at cytoglobin har mange likheter med andre globins, inkludert den klassiske tre-over-tre alfa-spiralformet globin fold og en P
O2 (oksygenaffinitet) på omtrent 0,2 Torr, lik som myoglobin [f.eks 5], [6]. Den høye affinitet av cytoglobin for oksygen har ført til forslaget om at cytoglobin kan tjene som en «intracellulær» oksygen-transport-system. I dette tilfellet blir cytoglobin foreslått å levere oksygen til mitokondriene for å opprettholde oksidativ fosforylering, på en måte tilsvarende til funksjonen av myoglobin i muskelcellene. Interessant, synes oksygenaffinitet å være redoks-følsomt, og reguleres ved dannelse av en disulfidbro mellom to eksterne cysteinrester (Cys B2 og Cys E9). Redoks-sensitive natur cytoglobin oksygen affinitet antyder en mulig rolle cytoglobin som en oksygen «vask /reserve», der oksygen er bare frigjøres når cellene blir hypoksisk. Selv om disse er attraktive hypoteser, cytoglobin ekspresjon synes å være hovedsakelig begrenset til celler av en fibroblast opprinnelse uten åpenbar korrelasjon mellom metabolsk aktivitet i vev og nivåer av cytoglobin uttrykk som, i alle tilfelle, er heller lav i de fleste celletyper ble undersøkt [7] , [8]. Disse funnene har ført til jakten på alternative fysiologiske funksjon (er) for cytoglobin.
Cytoglobin ble først identifisert i 2001 [9] under en proteomikk skjermen av leverstel celler isolert fra fibrotisk rottelever vev og faktisk var opprinnelig heter stel celle aktivering forening protein (STAP) i erkjennelse av det faktum [9]. Etterfølgende arbeid – både
in vitro Hotell og
in vivo product: [10] – [13], senest ved hjelp av transgene dyr over-uttrykke cytoglobin [14], [15] ser ut til å bekrefte at cytoglobin spiller en rolle i den fibrotiske responsen i en rekke organer, inkludert lever og nyre. Selv om den nøyaktige rollen cytoglobin i fibrose gjenstår å bli etablert, pertubation av redoks homeostase er en godt karakterisert funksjon av fibrose og det finnes god dokumentasjon (spesielt med hensyn lunge og nyre) som progresjon av fibrotiske lesjoner involverer sykluser av oksidativt reperfusjonsskade etterkant vevshypoksi. Videre har det blitt demonstrert at cytoglobin ekspresjon kan bli oppregulert ved hypoksi [16] – [19]. Derfor virker det sannsynlig at cytoglobin er involvert i den adaptive responsen forbundet med denne skaden.
I forbindelse med funnene i fibrotisk sykdom, er det også en voksende kroppen av mekanistiske som tyder på at cytoglobin kan gi beskyttelse mot oksidativ celle skade under andre omstendigheter, muligens som et resultat av dens evne til å nøytralisere oksygenradikaler [20] – [23]. Faktisk har arbeidet i vårt eget laboratorium vist at overekspresjon av cytoglobin reduserer nivået av kjemisk indusert reaktive oksygenforbindelser (ROS) og gir beskyttelse mot pro-oksidanter indusert skade (lipidperoksidasjon og oksidative DNA trådbrudd) [24]. I ytterligere støtte for en rolle i detoksifisering av ROS, har det blitt rapportert at cytoglobin har peroksydaseaktivitet [9]. Interessant, mer nylig har det blitt rapportert at treverdig cytoglobin har pseudo-peroksidase aktivitet mot lipider, noe som tyder på at, under forhold med oksidativt stress, omsetning av lipid basert cellesignalmolekyler kan også være en del av en cytoglobin avhengig antioksidant respons [25]. Videre er en annen vertebrate globin, globin X, er blitt funnet å være membranassosiert og muligens er involvert i beskyttelse av lipider mot oksidasjon [26].
Intriguingly, i tillegg til de mulige roller som er omtalt ovenfor, den cytoglobin genet (
CYGB
) er også en kandidat tumorsuppressorgen [27], [28], [29] og vi har identifisert
CYGB
som kandidat tylosis med spiserørskreft (
TOC
) genet [30] – [33]. Selv
CYGB
ikke mutert i tylotic individer [31] eller i en serie av sporadiske plateepitelkreft øsofagus karsinom [34], vi har vist at dens uttrykk er sterkt nedregulert i ikke-kreft i øsofagus biopsier fra pasienter med TOC sammenlignet med vanlig biopsier [33].
CYGB
er også denaturert og nedregulert i sporadisk i spiserøret, lunge og hode og nakke kreft [27], [28], [33]. Nylig, nedregulering av cytoglobin har også blitt vist å fremme kjemisk indusert karsinogenese i gnager leveren [35].
Det er overbevisende bevis for at oksidativ skade på DNA (for eksempel 8-oxo deoksyguanosin), hvis ikke reparert, bidrar til dannelsen av mutasjoner som er kjent for å være viktig i etiologien av human karsinogenese [36], [37]. Vi hypoteser derfor at tap av cytoglobin uttrykk ville gjengi øsofagus cellene mer mottakelige for de skadelige effektene av ROS, og at dette bidrar til den observerte fenotype av
TOC
. I denne studien har vi testet denne hypotesen ved å manipulere cytoglobin uttrykk i både normale øsofagus epitelceller og øsofagus plateepitelkarsinom celler, som har normal fysiologisk og ingen endogen uttrykk for cytoglobin hhv.
Resultater
manipulering av cytoglobin uttrykk
real time RT-PCR viste at TE-8 plateepitelkarsinom spiserørskreft cellelinje har ekstremt lave endogene nivåer av CYGB uttrykk (lavere enn 10
-5 med hensyn til beta aktin (ACTB)), mens NE1 normale øsofagus keratinocytter uttrykke CYGB på omtrent 0,1 × ACTB. Denne naturlige nivå av CYGB ekspresjon i NE1 celler ble ansett for å være den normale fysiologiske nivå, da det er innenfor den samme størrelsesorden som den observert i et panel av normale vev (data ikke vist). CYGB ekspresjon ble modulert i disse to cellelinjer enten ved transient transfeksjon av genet (TE-8 celler) eller forbigående knockdown ved hjelp av RNA-interferens (NE1 celler). Cytoglobin uttrykk ble kunstig indusert av omtrent 4 eller 7 størrelsesordener i TE-8 celler, og ble redusert med omtrent fem ganger av siRNA knockdown i NE1 celler (figur 1).
Nivåer av CYGB uttrykk, sammenlignet til ACTB uttrykk, ble bestemt av real time RT-PCR i en parallell prøve for hver komet analyse utført. Disse uttrykk nivåer derfor knytter seg direkte til kometanalyse data presentert i figur 3. geometrisk gjennomsnitt av alle forsøkene er vist for både TE-8 celler (oransje søyler) og NE1 celler (rosa barer).
Karakterisering av celler
Normal øsofagale epitel (NE-1) og kreft i spiserøret (TE-8) celler ble analysert for nivåer av oksidativt stress ved hjelp av redoks-følsomme forbindelsen 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCF -DA) i nærvær og fravær av buthionine sulfoxamine (BSO).
resultatene indikerte at BSO var i stand til å indusere oksidativt stress i både TE-8 og NE1 cellelinjer, med en konsentrasjonsavhengig respons være innlysende (Figur 2). I TE-8 celler, dette nådde statistisk signifikans i umanipulerte celler (p = 0,0134) og CYGB transfekterte celler (p = 0,0034), men ikke i narretransfekterte celler (p = 0,092). Likevel ble en lignende trend observert i mock transfekterte celler. I den normale øsofagal cellelinje NE1, ble lignende resultater oppnådd: i dette tilfellet BSO konsentrasjonsavhengig oksidative stressrespons var statistisk signifikant i alle tre grupper av celler. BSO var i stand til å indusere oksidativt stress i kontrollceller (p = 0,0032), negativ kontroll siRNA behandlede celler (p = 0,0283), og celler som utsettes for siRNA knockdown av CYGB (p = 0,0077). Selv om en trend ble observert i TE-8 celler mot overekspresjon av CYGB å være assosiert med lavere nivåer av ROS sammenlignet med mock-transfekterte celler, dette var ikke statistisk signifikant. Ingen effekt av CYGB knockdown ble observert i NE1 celler. Men som vår primære spørsmålet var å se på ROS-assosiert DNA-skader, og ikke oksidativt stress
per se
, neste utførte vi kometen analysen på de to cellelinjene: Dette har den ekstra fordelen av å være en mye mer følsom indikator av cellulær oksidativ skade
oxidative spenning ble målt i en:. TE-8 og b: NE1 celler. Median DCF fluorescens er gjennomsnittet av 5 gjentas. Alle verdier ble normalisert til nivået i kontrollcellene uten BSO. Feilfelt representerer SEM + 2020. Transfeksjon reagens bare; + CYGB:-celler transfektert med full lengde CYGB; ve siRNA: egge kontroll; CYGB k /d: CYGB siRNA. * Statistisk signifikant konsentrasjonsavhengig respons (p 0,05) ** Statistisk signifikant konsentrasjonsavhengig respons (p 0,01)
Forholdet mellom oksidativ DNA skade og cytoglobin uttrykk
Comet. analyse~~POS=TRUNC.
I TE-8 celler, CYGB uttrykk ble kunstig restaurert av transient transfeksjon (figur 1). Oksydativ DNA-skade ble målt ved komet analysen i celler med to forskjellige nivåer av CYGB ekspresjon i tillegg til de grunnlinjekontroller: kunstig høy overekspresjon (ca. 10
2 ganger med hensyn til ACTB ekspresjon), og lav (omtrent fysiologisk) uttrykket (ca. 10
-1 ganger med hensyn til ACTB uttrykk). Til kunstig høye nivåer av CYGB ekspresjon, ble en signifikant reduksjon i oksidativ DNA-skade observert under betingelser med eksogen oksidativt stress (1000 uM BSO) (p = 0,014) sammenlignet med mock-transfekterte celler (figur 3a) Det var også en signifikant forskjell i oksidativ DNA skade mellom celler med lav /fysiologiske og høye CYGB uttrykk nivåer (p = 0,035). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell mellom mock-transfekterte celler og de med lav /fysiologiske CYGB ekspresjonsnivåer (p = 0,074); på samme måte ble ikke observert noen forskjell mellom kontroll og mock-transfekterte celler (p = 0,455). Disse dataene antyder at CYGB utøver en beskyttende effekt mot mobilnettet oksidativ skade bare på kunstig høyt – ikke-fysiologiske nivåer av uttrykk. Selv mot intuitivt, det var en trend i retning av økt oksidativ DNA skade når CYGB ble uttrykt ved lave /fysiologiske nivåer, gjorde denne trenden ikke statistisk signifikans. I NE1 celler, reduksjon av CYGB uttrykk med 90% ved hjelp av RNA-interferens førte ikke til noen forskjell i oksidativ DNA skade: Dette støtter videre argumentet om at CYGB utøver bare sin cellebeskyttende effekter ved kunstig høye (ikke-fysiologisk) nivåer av uttrykk (figur 3b)
DNA Strand-pauser (baseline og oksidativt-skade-indusert) ble målt ved Fpg-modifiserte kometmetoden i noen. TE-8 og b: NE-1 celler med ulike nivåer av CYGB uttrykk (som vist i figur 1). Mean av median prosent kometen halen intensitet er vist. Feilfelt representerer SEM. * Signifikant forskjellig fra hverandre (p 0,05). # Vesentlig forskjellige fra hverandre (p 0,05).
Cytoglobin og cellemotilitet
Tidligere studier har vist at cytoglobin påvirkninger cellular motilitet og kolonidannende evne [29], men i denne studien ingen effekt av cytoglobin knockdown på cellevekst ble registrert i enten NE1 øsofagus keratinocytter eller CCD-18Co colonic myofibroblasts, enten 25 eller 50 timer etter såret
diskusjon plakater (data ikke vist).
Tidligere arbeid i våre og andre laboratorier har vist at cytoglobin har potensial til å avgifte reaktive oksygenarter (ROS)
in vitro
når den overuttrykkes i forskjellige cellekultursystemer [20], [21], [22 ], [24]. Videre er nedregulering av cytoglobin av RNAi har også nylig blitt vist å sensibilisere gliomceller til oksidativt stress indusert av både hemming av elektrontransportkjeden med antimycin, og ioniserende stråling [23]. Ytterligere støtte for en rolle for cytoglobin i avgiftning av ROS er den biokjemiske bevis for at cytoglobin protein besitter iboende peroxydaseaktivitet samt antioksidantegenskaper, og det er bevis for at andre globins inkludert neuroglobin og globin X kan også ha lignende egenskaper [20], [ ,,,0],26], [38], [39]. Imidlertid, i tilfelle av cytoglobin, er det fortsatt usikkert om denne er en ekte fysiologisk funksjon av cytoglobin eller en gjenstand av de eksperimentelle modellene som brukes. Til dags dato har ingen «cytoglobin reduktase» blitt identifisert som kunne redusere Fe
3+ tilbake til Fe
2 +, så det er ikke klart hvordan oksiderte cytoglobin ville bli resirkulert i cellene. Det er også bevis for at cytoglobin har katalytisk aktivitet mot de reaktive nitrogenforbindelser nitrogenoksid, katalyserende dens omdannelse til nitrat hvor askorbat og cytokrom b (5) har blitt identifisert som potensielle kilder for å redusere strøm [40]. Denne antatte aktivitet korrelerer godt med observasjonen av høye nivåer av cytoglobin ekspresjon i fibroblaster og glattmuskelceller fra det vaskulære karet, hvor nitrogenoksyd er et velkjent aliserte molekyl som formidler vaskulær tonus [41]. Imidlertid har andre studier stilt spørsmål ved om nitrogenoksid dioxygenase er en fysiologisk relevant enzymaktivitet av cytoglobin [42]. I tillegg er det også frem
in vivo
bevis for en beskyttende rolle av cytoglobin (og neuroglobin) mot oksidativt stress, særlig i modeller av fibrose som involverer hypoksisk reperfusjon og påfølgende oksydativ skade [10] – [15] .
Mye av disse dataene har blitt generert i eksperimentelle modeller hvor cytoglobin er over-uttrykt, så selv om disse er interessante funn, forblir deres fysiologiske relevans uklart. I denne studien undersøkte vi om cytoglobin uttrykket hadde råd til beskyttelse mot kjemisk indusert oksidativ DNA skade i dyrkede øsofagus celler. Dette er spesielt relevant fordi
CYGB
er nedregulert i begge tylosis med kreft i spiserøret og sporadisk i øsofagus kreft [33], og vi derfor hypotese at tap av cytoglobin uttrykk vil sensibilisere disse cellene til DNA-skade, og at dette kan være involvert i forbindelse med utvikling av kreft i spiserøret. Når cytoglobin ble overuttrykt i TE-8 spiserørskreft cellelinjer, som har liten eller ingen endogen cytoglobin uttrykk, i samsvar med tidligere undersøkelser vi observert statistisk signifikant beskyttelse mot BSO-indusert oksidativ DNA skade som vurderes av FPG-modifisert komet analysen. Denne effekten er imidlertid var konsentrasjonsavhengig: ved lavere nivåer av cytoglobin overekspresjon den beskyttende virkning ble tapt. I samsvar med dette, knockdown av fysiologiske nivåer av cytoglobin i kulturer av primær NE1 øsofagus celler ikke bevisstgjøre dem til BSO-indusert oksidativ DNA skade som vurderes av samme endepunkt. Interessant nok har det nylig blitt rapportert at knockdown av cytoglobin ekspresjon i gliomceller av RNAi hever nivåene av antimycin-induserte hydrogenperoksyd [23]. I denne studien ble det observert noen signifikant forskjell i nivåene av BSO-induserte oksidativt stress som bedømt ved oksydasjon av dichlorofluoroscein. Årsaken til denne forskjellen er ikke klar, men kan være relatert til enten den annen cellelinje eller en fremgangsmåte for å indusere oksidativt stress.
Våre funn tyder på at selv om induksjon av cytoglobin uttrykk, for eksempel som følge av hypoksi eller i respons på oksidativ skade, har potensial til å være beskyttende, i vårt studium dette ble bare observert usannsynlig ved CYGB nivå som skal oppnås
in vivo
. Videre var det ingen bevis for en økt følsomhet for ROS etter knockdown av RNAi i celler som uttrykker cytoglobin på fysiologiske nivåer. Derfor vil en cytobeskyttende rolle mot oksydativt induserte DNA-skade ikke synes å være en funksjon av cytoglobin i øsofagale celler og andre forklaringer på cytoglobin funksjon og tap av ekspresjon i denne sykdomsmodell er nødvendig.
Materialer og Metoder
Cell kultur
Normal øsofagus epitelceller (NE-1, en gave av professor GSW Tsao, Institutt for anatomi, University of Hong Kong (se [43]) ble opprettholdt i T
75 kulturflasker ved hjelp av keratinocytt serumfritt medium (Gibco) supplert med bovint hypofyseekstrakt (25 ug ml
-1) og rekombinant epidermal vekstfaktor (0,15 ng ml
-1). kulturer ble rutinemessig splittet 1:03 omtrent hvert 3-4 dager ved hjelp av trypsin-EDTA og soyabønnetrypsininhibitor (Gibco) i henhold til anbefalt protokoll for keratinocyte serumfritt medium. den spiserørskreft cellelinje TE-8 (En gave av professor Toshio Kudo, celle Resource Centre for Biomedical Research , Tohoku University, Japan, [44]) ble dyrket i T
75 kulturflasker med RPMI-medium supplert med 10% FBS og 2% L-glutamin. TE-8-celler ble delt etter behov ved hjelp av en standard trypsin-EDTA-protokollen. CCD-18Co colonic myofibroblasts (kjøpt fra ATCC produkt nr: CRL-1459, [45]) ble dyrket i DMEM supplememented med 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAAs). Disse cellene ble sølt som er nødvendig for å bruke en standard trypsin-EDTA-protokollen.
Cytoglobin knockdown
NE-1 celler eller CCD-18Co celler ble dyrket i seks-brønns plater (for kometmetoden) eller tolv-brønners plater (for ROS-analyse og sårhelende assay), og tillatt å nå 60-70% konfluens før transfeksjon. Cellene ble transfektert med 25 nM endelig konsentrasjon av enten en negativ kontroll egge siRNA (Ambion, AM4611) eller CYGB siRNA (Qiagen, SI03228323 eller Ambion, s41571) med 15 mikrogram ml
-1 TRANSIT siQuest reagens (Mirus Bio) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter RNAi knockdown, ble cellene inkubert i 42 timer før du utfører eksperimenter (24 timer for sårhelende eksperiment). Uttrykk for CYGB ble analysert ved RT-PCR (se nedenfor).
Overuttrykte cytoglobin
TE-8 øsofagus plateepitelkarsinom celler ble dyrket i seks- eller tolv brønners plater som tidligere. Transient transfeksjon av
CYGB
ble oppnådd med Transit 2020 transfeksjon reagens (Mirus Bio) (2 pl eller 5 mL per brønn for 12-brønn eller seks-brønns plater henholdsvis), og full lengde
CYGB
cDNA-klon i en pCMV6-AC vektor (Origene) (0,6 ug eller 1,5 ug til 12-brønners eller seks-brønns plater henholdsvis), som i henhold til standardprotokollen for transfeksjon reagens. Etter transfeksjon ble celler inkubert i 42 timer før det utføres eksperimenter. Ekspresjon av CYGB ble analysert ved RT-PCR (se nedenfor).
RNA-ekstraksjon, førstetråds-cDNA-syntese og RT-PCR-analyse
Isolering av totalt RNA ble utført ved anvendelse av en RNeasy MINIKIT ( Qiagen) med direkte lysering av cellene i kulturplaten, og homogenisering ved hjelp av QiaShredder rør. Revers transkripsjon ble utført ved å bruke en RETROscript sett (Ambion) med, oligo dT-primere og 1 ug total RNA, i henhold til produsentens instruksjoner. For RT-PCR masterblanding ble fremstilt som inneholdt TaqMan 2 × mester mix (Applied Biosystems), β-actin VIC /MGB probe for den endogene kontroll (Applied Biosystems 4326315E), CYGB primer og probe mix (følelse 5′-CTC TAT GCC AAC TGC GAG GAC-3 «, anti-sense 5′-AAC TGG CTG AAG TAC TGC TTG-3′ og probe FAM-5′-TGG CCA TCC TGG TGA GGT TCT TTG TG-3»-sort hull quencher) i RNase -gratis vann. En standard to-trinns protokoll ble anvendt for sanntids RT-PCR-analyse (50 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 50 sykluser av 95 ° C i 15 minutter og 60 ° C i 1 minutt). The Cycle Threshold (CT) verdier innhentet ble brukt til å beregne sanntid kvantifisering verdi (RQ) utnytte ΔΔCt metoden med ACTB Ct verdier og ubehandlede /utransfekterte celler brukt som normaliseringsfaktorer.
FPG endret komet analysen
metoden var basert på at av Singh et al [46] med mindre modifikasjoner [47]. Etter behandling ble cellene vasket i kald PBS og forsiktig skrapet inn i 1 ml frisk PBS (TE-8 celler) eller trypsinisert (NE1 celler). Etter sentrifugering (8000 rpm, 5 minutter) pelletene ble resuspendert i PBS (150 ul). En alikvot av re-suspenderte celler (30 mL) ble anbragt i et sterilt rør inneholdende lavt smeltepunkt agarose (300 ul), og denne cellesuspensjon ble overført til to glassmikroskopobjektglass (150 ul per lysbilde), forhåndsbelagt med 0,5% normal smeltepunkt agarose. Dekkglass ble tilsatt og glir plassert på en metall brett over is i 10 minutter. Dekkglass ble fjernet og slides inkubert i 1 time ved 4 ° C i lyseringsbuffer (2,5 M NaCl, 0,1 M Na
2EDTA, 10 mM Tris-base, 1% natrium-N – laurylsarkosinat, 10% DMSO og 1% Triton X -100). Platene ble vasket (3 x 5 minutter) med FPG buffer (40 mM HEPES, 0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA 0,2 mg /ml bovint serumalbumin, pH 8,0) og inkubert med 1 enhet FPG enzym (Trevigen) i 50 pl FPG buffer ved 37 ° C i 1 time (kontrollobjektglass ble inkubert med buffer FPG bare). Platene ble overført til en horisontal elektroforese tank inneholdende elektroforese buffer (300 mM NaOH og 1 mM Na
2EDTA, pH 13,0) og DNA lov til å slappe av i 20 minutter. DNA ble underkastet elektroforese (25 V, 0,8 V cm
-1, 20 minutter) og glir nøytralisert ved vasking (3 x 5 minutter) med nøytralisering buffer (0,4 M Tris, justert til pH 7,5). Lysbilder ble deretter farget med SYBR Gold 50 pl (Invitrogen, 10 × løsning i nøytralisering buffer).
Glassene ble undersøkt på 320 × forstørrelse ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Zeiss Axiovert 10, Tyskland), utstyrt med en 515 -560 nm eksitasjon filter og en barrierefilter på 590 nm. En USB digitalt kamera (Merlin, Allied Vision Technologies) har mottatt bildene, som ble analysert ved hjelp av en PC-basert bildeanalyse system Comet assay IV (Perceptive instrumenter). Bilder av hundre tilfeldig valgte kjerner ble analysert per lysbilde. Måling av prosent hale-DNA (TD%) ble valgt for å vurdere omfanget av DNA-skade, da dette har vist seg å lide mye mindre fra inter-drevne variasjon enn andre komet parametre fordi det er stort sett uavhengig av elektroforese spenning og tid [48] . Medianverdiene av tre separate forsøk ble analysert ved anvendelse av ANOVA og post-hoc t-test, som anbefalt av Duez et al [49].
ROS-analyse
reaktive oksygenforbindelser ble vurdert ved å måle oksidasjonen av redoks-følsomt fargestoff 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCF-DA). Etter hydrolyse av intracellulære esteraser, er den resulterende H2DCF ute av stand til å forlate cellen og blir deretter oksydert ved hjelp av ROS for å danne fluorescerende DCF molekylet. Nivået av fluorescens er proporsjonal med graden av oksidativt stress i cellene. For å indusere oksidativt stress kunstig, buthionine sulfoksiminforbindelser (BSO), som hemmer det hastighetsbegrensende trinnet i syntesen glutation, ble tilsatt til de dyrkede celler i 24 timer før forsøket ved 100 eller 1000 uM.
i korthet følgende behandlinger 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (endelig konsentrasjon 10 uM for TE-8-celler; 1 uM eller 0,1 uM for NE1 celler) ble tilsatt og cellene inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i mørket. Cellene ble løsnet ved trypsinering, pelletert ved sentrifugering og resuspendert i PBS. Fluorescens intensitet ble analysert (FITC kanal) med en FACSCalibur ™ flowcytometri (Becton Dickinson) og CellQuestTM Pro-programvare (Becton Dickinson). Celler uten fluorescerende fargestoff ble brukt som en negativ kontroll for å korrigere for bakgrunnen autofluorescence.
Wound Healing analysen
NE1 øsofagus keratinocytt celler og CCD-18Co colonic myofibroblasts ble dyrket i tolv-brønners plater, og kastet RNAi knockdown av CYGB som tidligere beskrevet, ved bruk av både Ambion og Qiagen sirnas til CYGB, og en kodet styre siRNA. Hver tilstand ble replikert seks ganger for hver cellelinje. Cellelaget var riper i et kryss form ved hjelp av en steril pipette tips i 24 timer etter knockdown. Celler ble fotografert på 1, 25 og 50 timer etter såret med en USB digitalt kamera. Bilder ble analysert ved hjelp TScratch programvare [50], som analyserte endringer i andelen av Open Wound Area (OWA).
