Abstract
Enzymet 5α-reduktase, som omdanner testosteron til dihydrotestosteron (DHT), utfører viktige funksjoner i androgen reseptor (AR) signalveien. De tre isoenzymer av 5α-reduktase identifisert hittil er kodet av forskjellige gener:
SRD5A1
,
SRD5A2
, og
SRD5A3
. I denne studien undersøkte vi mekanismer som ligger til grunn for androgen regulering av 5α-reduktase-isoenzym-ekspresjon i humane prostataceller. Vi fant at androgen regulerer mRNA-nivået av 5α-reduktase-isoenzymer i en celletype-spesifikk måte, at en slik regulering skjer på transkripsjonsnivået, og at AR er nødvendig for denne regulering. I tillegg er våre resultater tyder på at AR er rekruttert til en negativ androgen respons element (Nare) på arrangøren av
SRD5A3 in vivo Hotell og direkte binder seg til Nare
in vitro
. De ulike uttrykk nivåer av 5α-reduktase isoenzymene kan gi svar eller resistens mot 5α-reduktasehemmere og dermed kan ha betydning i forebygging av prostatakreft
Citation. Li J, Ding Z, Wang Z, Lu JF, Maity SN, Navone NM, et al. (2011) Androgen Regulering av 5α-reduktase isoenzymer in Prostate Cancer: Konsekvenser for Prostate Cancer Prevention. PLoS ONE 6 (12): e28840. doi: 10,1371 /journal.pone.0028840
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: May 16, 2011; Godkjent: 16 november 2011; Publisert: 14.12.2011
Copyright: © 2011 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av Prostate Cancer Research Program ved MD Anderson Cancer Center og støttes delvis av National Institutes of Health gjennom MD Anderson Cancer Center Support Grant, CA016672. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
flerårig, flertrinnsprosess prostata kreftutvikling og sin lange latenstid gjøre prostatakreft ideelt for chemoprevention [1]. Androgen reseptor (AR) signalveien, som er avgjørende for prostata utvikling og normal funksjon, er også sentralt for prostatakreft er patogenesen og progresjon [2], [3]. Nøkkelenzymet i AR-signalering, 5α-reduktase, omdanner testosteron til det mer potente androgen dihydrotestosteron (DHT) [4]. Selv om testosteron kan binde seg til og aktivere AR, DHT binder seg til den med en hastighet dissosiasjon tre ganger langsommere enn den for testosteron [5], [6].
tre isoenzymer av 5α-reduktase, som er kodet for av forskjellige gener (
SRD5A1
,
SRD5A2
, og
SRD5A3
), har blitt identifisert. Immunhistokjemisk og polymerase kjedereaksjon (PCR) analyser av humane prostata vev tyder på at SRD5A1 og SRD5A2 nivåer endres med prostatakreft utvikling og progresjon [7], [8], [9].
In vitro
studier har bekreftet den 5α-reduktase-aktivitet av de mer nylig identifiserte SRD5A3 [10], som ble overuttrykt i hormon ildfaste prostata kreftvev [10], [11]. Knockdown av
SRD5A3
uttrykk også redusert vekst og levedyktighet av prostatakreftceller [10]. Ved å bruke et monoklonalt antistoff, Godoy et al. videre viste økt nivå av SRD5A3 protein i prostata kreft sammenlignet med godartet prostata-vev [12]. Disse resultatene antydet at SRD5A3 kan bidra til prostatakreft progresjon. Det har også nylig blitt rapportert at SRD5A3 kan spille en viktig rolle i protein glykosylering [13]. Mutasjoner av
SRD5A3
føre til medfødte misdannelser [13], [14] og Kahrizi syndrom [15].
To 5α-reduktasehemmere er testet klinisk. Finasterid hemmer spesifikt SRD5A2 aktivitet [16], og dutasteride hindrer at både SRD5A1 og SRD5A2 [17]. The Prostate Cancer Prevention Trial (PCPT) ga oppløftende resultater: finasterid redusert den totale forekomsten av prostatakreft med 25%, selv om potensielle effekter av høy klasse svulster ble om [18]. Tilsvarende reduksjon av Dutasterid av prostatakreft Events (REDUSERE) studie viste at dutasterid reduserte forekomsten av prostatakreft med 23% blant menn med høy risiko og viste ingen statistisk signifikant økning av høyverdig tumor behandlet med dutasterid menn [19] [20].
Tre faktorer kan gi svar eller resistens mot 5a-reduktasehemmere. Først svar eller motstand kan skyldes tilstedeværelsen av forskjellige isoenzymer [21]. For det andre kan forskjeller i følsomhet bli gitt av
SRD5A2
genotypiske varianter [22]; Makridakis et al. [23] viste
in vitro
at
SRD5A2
variantene har forskjellige affinitet for finasterid. Tredje, forskjellige ekspresjonsnivåer av 5α-reduktase-isoenzymer kunne bidra til både følsomhet og motstand. I motsetning til androgen ablasjon, noe som reduserer prostata testosteron og DHT, inhibering av 5α-reduktase-aktiviteten avtar DHT, men øker testosterone [24], [25], [26]. Siden 5α-reduktasehemmere endre testosteron til DHT-forhold, og gitt den kritiske rollen 5α-reduktase i AR signalering, kan de ulike 5α-reduktase uttrykk nivåer gi hint om respons og motstand mot 5a-reduktasehemmere i prostata kreft forebygging .
Androgener kan påvirke uttrykket av
SRD5A1 Hotell og
SRD5A2
i ulike vev og celletyper. I rotte ventral prostata, positiv regulering av
SRD5A2
av androgen har blitt rapportert [27], og i rotte testis, negativ regulering av
SRD5A1 product: [28]. Androgen ablasjon førte til redusert farging av 5α-reduktase [29].
SRD5A1 Hotell og
SRD5A2
er også regulert av testosteron og DHT i T- og B-lymfoide celler [30] og i rottelever og hjerne [31], [32], [33], [ ,,,0],34]. Men hvordan 5α-reduktase uttrykk er regulert i menneskelige prostata celler har ikke blitt grundig undersøkt.
Vårt primære formålet med denne studien var derfor å evaluere androgen regulering av 5α-reduktase isoenzymer i humane prostata celler. Vi videre undersøkt om de regulatoriske virkningene av androgener på 5a-reduktaser formidles av AR, og om en direkte interaksjon mellom den
cis
regulatoriske elementer av 5α-reduktase isoenzymer og AR.
våre data viste celletype-spesifikk androgen regulering av isoenzymer som er mediert av AR. Så vidt vi vet, er dette den første demonstrasjonen som AR kan direkte binde seg til den negative androgen respons element (Nare) av
SRD5A3
promoter i LNCaP prostatakreftceller. Våre funn kan ha kliniske implikasjoner for identifisering av menn som har sykdommen kan ha nytte av 5α-reduktasehemmere.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kulturer
PWR-1E, LNCaP, og VCap-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA); BPH-1-GFP, BPH-en-AR, og C4-2B4 celler var en gave fra Dr. Sue-Hwa Lin (The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas); og LAPC-4-celler ble vennlig levert av Dr. Robert Reiter (University of California, Los Angeles, California).
PWR-1E celler ble holdt i serumfritt keratinocyte medium (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) supplert med 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt, 5% L-glutamin, og 5 ng /ml epidermal vekstfaktor. LNCaP, ble C4-2B4, BPH-1-GFP, og BPH-1-AR-celler opprettholdt i RPMI-1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin og streptomycin (P /S). LAPC-4-celler ble opprettholdt i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (Invitrogen) supplert med 5% FBS og 1% P /S. VCap-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% FBS og 1% P /S. Alle kulturer ble holdt ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO
2. Cellelinjer ble validert ved MD Anderson Preget cellelinje Kjerne av STR DNA fingerprinting bruke AmpFℓSTR Identifiler kit (Applied Biosystems, Life Technologies Corp., Carlsbad, California). STR profiler ble sammenlignet med de kjente ATCC fingeravtrykk, til cellelinje Integrert Molekylær Authentication Database versjon 0.1.200808 (https://bioinformatics.istge.it/clima/) [35], og til MD Anderson fingeravtrykk database. STR profiler av PWR-1E, LNCaP, C4-2B4, og Vcap celler matchet kjente DNA fingeravtrykk; de av BPH-en-AR og LAPC-4-celler var unik.
Kvantitativ revers-transkripsjon PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra hver cellelinje ved hjelp av en RNeasy Plus mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) i henhold til produsentens protokoll. QRT-PCR ble utført ved hjelp av en TaqMan One-Step RT-PCR kit (Applied Biosystems, Life Technologies Corp.), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, den QRT-PCR-innstilling for hver reaksjon var 48 ° C i 30 minutter, 95 ° C i 10 minutter og 42 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. Human β-aktin ble benyttet som den endogene kontroll i hver reaksjon. Primer og prober for
SRD5A1
,
SRD5A2
, og
SRD5A3
gener var også fra Applied Biosystems.
Androgen behandling
Testosteron og DHT ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). R1881, en syntetisk androgen, ble vennlig levert av Dr. Sue-Hwa Lin. Celler ble sådd ut i 12-brønners plater med deres vanlige vekstmedium. Etter serum sult over natten, ble cellene eksponert for etanol (kontroll) eller til 1 nM, 10 nM, 100 nM eller androgen. Etter 24-timers og 48-timers inkubasjon ble cellene høstet og RNA ekstrahert for QRT-PCR-analyse.
Actinomycin D behandling
BPH-en-AR, LNCaP og PWR-1E celler ble behandlet med dimetylsulfoksyd (DMSO; kontroll) eller 1 mg /ml eller 5 pg /ml actinomycin D i 30 minutter, etterfulgt av etanol (kontroll) eller 10 nM DHT. Etter 24 timers inkubasjon ble cellene høstet og total RNA ekstrahert.
Transfeksjon med små interfererende RNA (siRNA)
For å slå ned AR uttrykk, vi sådd LNCaP celler i 12-brønners plater, serumsultede dem over natten, og deretter transfektert dem med 20 nM AR siRNA eller tak siRNA ved hjelp av en DharmaFECT (Dhamarcon, Inc., Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Etter inkubering over natten, ble cellene eksponert for etanol (kontroll) eller 2 nM DHT. De AR siRNA og kontroll siRNA ble oppnådd fra Dhamarcon.
Western blot-analyse
Etter 24 timers inkubering med siRNA, ble cellene høstet og sentrifugert ved 5000 rpm i 5 minutter. Cellepelletene ble resuspendert i RIPA-buffer (Boston Bioproducts, Inc., Ashland, MA) med protease inhibitor (Roche, Mannheim, Tyskland), inkubert i 20 minutter med sporadisk vortex-blanding, og deretter sentrifugert ved 14.000 rpm i 10 minutter. Supernatanten ble dekantert og lagret for Western blotting. Hele protein ekstraksjon prosedyren ble utført ved 4 ° C, og proteinkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av BCA-analyse (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Supernatanten ble kokt i 5 minutter, påsatt på polyakrylamidgel, løpe, og overført til en PVDF-membran, som deretter ble blokkert i TBST (TBS med 0,2% Tween 20) + 5% melk i 1 time før den ble probet med anti-AR -antistoff (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) i blokkeringsbuffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubering ved romtemperatur i en time med sekundær pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus-antistoff. Deteksjon ble utført ved hjelp av en elektrokjemiluminescens kit (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ).
Luciferase assay
SRD5A3
promoter (-1027 /+ 155 bp) ble klonet inn i pGL2 grunn vektor (Promega Corp., Madison, WI) ved XhoI- og Mlul områder, som ble ytterligere delesjonskonstruksjonene. LNCaP celler ble transfektert med disse konstruerer ved hjelp Fugene 6 reagensen (Roche) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
For å teste AR-avhengige undertrykkelse evne SRD5A3, vi også satt inn sin promoter (-191 /-72 bp) i den pGL3-4ARE-E4-Luc konstruktet ved Pstl og Xhol områder. LNCaP-celler ble transfektert med den, og deretter dyrket i fravær og nærvær av DHT i 24 timer.
A dual-luciferase-assay ble gjennomført i henhold til Promega protokoll. Luciferase Forholdet ble utledet ved å dividere luciferase aktivitet ved
Renilla
aktivitet.
Mutagenese
Mutasjoner ble gjort i Nare regionen i
SRD5A3
promoter ved hjelp av en Quickchange II XL seterettet mutagenese kit (Strategene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensen CTGTTTTGCGTCT ble mutert til ATTTTTTTATTAT i sammenheng med pGL3-4ARE-E4-luc konstruere.
Elektro mobilitet-shift-analyse (EMSA)
AR sin binding til dobbel-strandet oligos ble vurdert i LNCaP cellekjerneekstrakter ved å utføre EMSA med en LightShift kit (alle sett for EMSA var fra Thermo Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. Atomproteinekstrakter ble isolert fra LNCaP-celler, og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en BCA proteinanalyse kit. Oligonukleotider ble utformet for å dekke -191 /-91 regionen på
SRD5A3
promoter og merket ved hjelp av en biotin 3′-enden DNA merking kit i henhold til produsentens instruksjoner. AR binding til dobbel-strandet oligonukleotidene ble vurdert i LNCaP cellekjerneekstrakter ved EMSA bruke en LightShift kit i henhold til produsentens instruksjoner. Umerkede oligonukleotider ble brukt i EMSA som en av kontrollene. Biotin-merket DNA ble detektert på nylonmembran ved anvendelse av en kjemiluminescens nukleinsyre deteksjonsmodul kit.
Chromatin immunoutfelling (chip) assay
LNCaP-celler ble dyrket både i nærvær og fravær av 100 nM DHT, og chip ble utført ved hjelp av et kit fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA), i henhold til deres protokollen. I korthet ble cellene behandlet med 37% formaldehyd for å kryssbinde proteiner til DNA. Tverrbundet kromatin ble fordøyd av micrococcal nuklease til en lengde på 150-900 bp, og kjernefysiske membraner ble brutt ved ultralyd. AR-spesifikke antistoff (Dako) ble anvendt for å felle ut de korte kromatin fragmenter, som deretter ble vasket og eluert. De protein-DNA-kryssbindinger ble snudd og DNA ble ytterligere renset ved hjelp av sentrifugekolonner i hver PCR-reaksjon. Termin primer for Nare var CTGTTTTGCGTCTTTGCTTCTG, og revers primer var GAGGTCCTTGGTCCTGGTC, som forsterke en 120 bp produkt.
xenograft modeller
RNA fra MDA PCa 183, MDA PCa 144, MDA PCA 146, og MDA PCA 155 xenograft modeller ble vennlig levert av Dr. Sankar N. Maity og Dr. Nora M. Navone. MDA PCa 183 xenograft ble avledet fra androgen-avhengig prostata-karsinom, mens de andre ble avledet fra AR-negative kastrering-resistente prostata karsinomer med liten celle prostata carcinoma (SCPC) morfologi.
Kvantifisering av den relative mRNA nivå xenograft
SRD5A3 Hotell og prostataspesifikt antigen (
PSA
) ble gjort ved hjelp av QRT-PCR med SYBR Grønn (Applied Biosystems, Inc.). QRT-PCR ble utført som beskrevet i [36]. Primersekvensene som ble brukt var som følger: SRD5A3: forover, 5′-TCCAAGCTGGCTTCATGGTT-3 «som ligger på ekson 2 og omvendt, 5′-CACTCGAAGAGTCTTCGTAA-3′ som ligger på exon 3; PSA: fremover, 5»-GAGAGCTGTGTCACCATGTG-3 «ligger på ekson 1 og omvendt, 5′-CACAATCCGAGACAGGATGA-3» ligger på ekson 2.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Tosidig
t
testene ble utført for å sammenligne midler mellom androgen-behandlede prøver og kontroller. Signifikans ble satt til ap verdi på 0,05.
Resultater
Alle tre 5α-reduktase isoenzymene er til stede i de testede menneskelige prostata cellelinjer, med varierende uttrykk mønstre
For å identifisere gode modellsystem for å studere funksjonene 5α-reduktase isoenzymer, vi evaluert mRNA nivåene av 5α-reduktase isoenzymer i ulike prostata cellelinjer, inkludert PWR-1E udødelig normale prostata epitelceller; BPH-en-AR benign prostatahyperplasi (BPH) celler, som stabilt uttrykker AR; LAPC-4 og LNCaP androgen-sensitive prostatakreftceller; og C4-2B4 androgen-uavhengig celler. PWR1-E, BPH-en-AR og LAPC-4-celler uttrykker vill-type AR, mens LNCaP og C4-2B4 celler uttrykker en mutant AR, T877A. (Egenskapene til disse cellelinjer, inkludert deres kilde, androgen følsomhet, og AR-ekspresjon status, er oppsummert i tabell S1). Som figur 1 viser, ble mRNA fra alle tre 5α-reduktase-isoenzymer detektert på QRT-PCR-analyse av hver cellelinje, noe som indikerer at alle tre er uttrykt i disse cellelinjene. Men mRNA nivået på hver isoenzymet varierte mellom cellelinjer, og hver isoenzymet hadde en særegen uttrykksmønster.
Grafer viser den relative mRNA nivåer av
SRD5A1
,
SRD5A2
og
SRD5A3
isoenzymer i PWR-1E, BPH-en-AR, LAPC-4, LNCaP, og C4-2B4 celler som bestemmes på QRT-PCR-analyse.
5α-reduktase mRNA nivåer er regulert av androgener i en celletype-spesifikk måte
for å teste om mRNA nivået av 5α-reduktase er regulert av androgener, behandlet vi LNCaP celler med enten etanol (dvs. kjøretøy only) eller med testosteron eller DHT ved forskjellige konsentrasjoner (1, 10 og 100 nM). Den normale plasmakonsentrasjonen av testosteron hos menn i området 350-1050 ng /dl (12,1 til 36,4 nM) [37], og den kastrering nivå av testosteron er mindre enn 50 ng /dl (1,73 nM) [38]. Plasmakonsentrasjonen av DHT er omtrent 1/10 av testosteronkonsentrasjonen [39], [40]. Dermed behandlet vi cellene med konsentrasjoner av androgen som er nær for kastrering, fysiologiske, og superphysiologic nivåer. Vår QRT-PCR-analyse viste at DHT behandling førte til økt nivå av
SRD5A1
mRNA, mens det førte til redusert nivå av
SRD5A2 Hotell og
SRD5A3
mRNA i LNCaP prostata kreftceller (fig. 2A).
a, LNCaP-celler ble behandlet med etanol (bærer) eller forskjellige konsentrasjoner av DHT (1 nM, 10 nM, 100 nM) i 24 og 48 timer. PWR-1E (B), BPH-1-AR (C), ble LAPC-4 (D), og C4-2B4 (E) celler behandlet på samme måte, men for bare i 24 timer. De mRNA nivåer av
SRD5A1
,
SRD5A2
, og
SRD5A3
for alle cellelinjer ble kvantifisert ved QRT-PCR. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; 2-sidig
t
test.
Vi testet også effekten av DHT på andre cellelinjer. DHT ikke særlig påvirke mRNA-nivået av 5α-reduktase in PWR-1E-celler (Fig. 2B), mens i BPH-1-AR-celler økte DHT mRNA nivåene av alle tre isoenzymer (Fig. 2C). I LAPC-4-celler som uttrykker vill-type AR, DHT oppregulert SRD5A1 uttrykk uten at det påvirker SRD5A2 og SRD5A3 uttrykk (Fig. 2D). Og i androgen-uavhengig C4-2B4 prostatakreftceller, DHT regulert 5α-reduktase uttrykk på samme måte som dens regulering i LNCaP-celler, men i mindre grad (fig. 2E).
Vi fant det interessant at DHT regulerer mRNA nivået av
SRD5A3
i en celletype-spesifikk måte, et funn vi har ikke sett rapportert før. For å evaluere hvorvidt dette skjer bare i LNCaP eller LNCaP-avledede cellelinjer, vi behandlet på samme måte VCap-celler, som er avledet fra et xenotransplantat benmetastase av human prostatakreft. DHT også nedregulert mRNA nivået av
SRD5A3
i Vcap celler (Figur S1), som indikerer at androgen-negativ regulering av
SRD5A3
er ikke spesifikt for LNCaP eller LNCaP cellelinjer utvunnet.
testosteron og R1881 måtte effekter tilsvarende til de av DHT på ekspresjonen av 5α-reduktase i alle cellelinjene som ble testet (fig S2 og S3). Våre data og dermed viser at androgener regulere mRNA nivået av 5α-reduktase isoenzymer i en celletype-spesifikk måte.
Regulering av 5α-reduktase mRNA nivå skjer gjennom transkripsjon
Androgener kan regulere 5α- reduktase uttrykk ved å kontrollere 5α-reduktase transkripsjon eller ved å påvirke mRNA stabilitet. For å forstå mekanismen bak reguleringen av 5α-reduktase av androgener, behandlet vi BPH-en-AR celler med actinomycin D, en transkripsjon inhibitor. Som vist ved resultatene av QRT-PCR-analyse i figur 3, induserte DHT øket ekspresjon av alle tre 5α-reduktase-isoenzymer i forhold til det i etanol (kjøretøy) kontroll i BPH-1-AR-celler. Men den mRNA-nivået av 5α-reduktase ikke endres med DHT behandling når cellene ble også behandlet med aktinomycin D ved 1 ug /ml og 5 ug /ml konsentrasjoner (Fig. 3A). Disse resultatene indikerer at den opp-regulering av 5α-reduktase ekspresjon av androgener er følsom for actinomycin D behandling, hvilket antyder at androgener regulere transkripsjonen av 5α-reduktase.
BPH-1-AR (A) og LNCaP ( B), og PWR-1E (C) celler ble behandlet i 30 minutter med DMSO (kjøretøy bare kontroll) eller actinomycin D på 1 ug /ml og 5 ug /ml konsentrasjoner. Behandling med enten etanol (bærer) eller 10 nM DHT eller testosteron fulgt. Vi kvantifisert mRNA nivåer av
SRD5A1
,
SRD5A2
, og
SRD5A3
av QRT-PCR.
På samme måte, når LNCaP cellene behandlet med actinomycin D, gjorde testosteron ikke signifikant økning
SRD5A1
eller reduksjon
SRD5A2 Hotell og
SRD5A3
mRNA nivåer (fig. 3B). Som en negativ kontroll, ble behandlet vi også PWR-1E-celler med actinomycin D, etterfulgt av DHT-behandling (fig. 3C). I tilfellet med den eneste DMSO-kontroll, hadde DHT ikke påvirke mRNA-nivå på
SRD5A1
,
SRD5A2
, eller
SRD5A3
. Med actinomycin D behandling, gjorde DHT ikke vesentlig endre mRNA nivået av disse genene, heller.
Regulering av 5α-reduktase mRNA nivå av androgener er AR avhengige
Ved å bruke Western blotting, vi bekreftet ekspresjonen av AR i hver av de undersøkte cellelinjer sammenlignet med den for AR-negative BPH-1-GFP-celler (fig. 4A).
A, AR-proteinnivået til hver prostata cellelinje var analysert ved Western blotting. BPH-1-GFP-celler ble anvendt som en negativ kontroll for AR ekspresjon. B, The AR protein nivå ble analysert ved Western blotting for LNCaP celler (venstre) med tre kontroll og to AR siRNA behandlinger. AR mRNA nivået ble analysert ved QRT-PCR for PWR-1E celler (til høyre), også med tre-kontroll og to AR siRNA behandlinger. C, LNCaP og PWR-1E celler ble behandlet med kontroll sirnas og AR sirnas og deretter behandlet med 2 nM DHT. Vi målte mRNA nivåer av
SRD5A1
,
SRD5A2
, og
SRD5A3
ved hjelp QRT-PCR og normalisert verdiene p-aktin. Endringene i mRNA nivåer med DHT behandling er vist i forhold til nivåene i celler behandlet med bilen bare.
For å avgjøre om AR er nødvendig for å megle regulering av 5α-reduktase uttrykk av androgener, utførte vi Western blotting og QRT-PCR-analyse etter behandling LNCaP og PWR-1E celler med AR sirnas og deretter med 2 nM DHT. Western blotting og QRT-PCR validert effektiv knockdown av AR uttrykk av AR siRNAs (Fig. 4B). QRT-PCR viste at kontroll sirnas ikke vesentlig endre effekten av DHT på 5α-reduktase nivåer i LNCaP celler (fig. 4C, øverst). DHT behandling alene resulterte i økt
SRD5A1
mRNA men redusert
SRD5A2 Hotell og
SRD5A3
mRNA (fig. 4C, øverst). I motsetning til dette ble det 5α-reduktase-nivåer i LNCaP-celler ble behandlet med AR sirnas ikke endre seg i respons til behandling med DHT (Fig. 4C, øverst). Når vi behandlet LAPC-4-celler på en lignende måte,
SRD5A1
mRNA tilsvarende økt med DHT eller testosteron behandling alene, men ikke når celler ble også behandlet med AR siRNA (figur S4). Når vi behandlet PWR-1E-celler på samme måte, ble DHT ikke påvirke mRNA-nivået av 5α-reduktase in PWR-1E-celler, uansett hvorvidt de ble behandlet med kontroll sirnas eller AR sirnas (Fig. 4C, nederst).
samlet utgjør disse resultatene tyder på at reguleringen av 5α-reduktase av androgener er AR avhengige.
SRD5A3
promoter inneholder en Nare
Vi viste at androgen regulerer transkripsjonen av 5α-reduktase, og at AR er nødvendig for å formidle denne transkripsjonsregulering. AR binder direkte til Ares og regulerer transkripsjon av AR-målrettede gener. Således undersøkte vi hvorvidt AR kan direkte regulere transkripsjonen av 5α-reduktase. Vi klonet en promoter-regionen i
SRD5A3 plakater (-1027 til 155 bp) i pGL2-basisvektoren. I LNCaP-celler, driver denne konstruksjon luciferase ekspresjon og, når de blir behandlet med 100 nM DHT, en 75% reduksjon av resultater luciferase-aktivitet (Fig. 5A). Dette er lik responsen av endogen
SRD5A3
til androgen behandling i LNCaP celler. Dermed kan en ARE ligge i denne 1-kb promoter-regionen i
SRD5A3
.
A, sletting analyse av
SRD5A3
arrangøren å begrense plasseringen av nARE- inneholder region. LNCaP-celler ble transfektert med luciferase-konstruksjoner inneholdende en delesjon serie
SRD5A3
promoter og deretter behandlet med etanol (kjøretøy bare; -DHT) eller 100 nM DHT (+ DHT) i 24 timer. Cellene ble deretter høstet, og deres lysater ble anvendt for luciferase-assay. B,
SRD5A3
har en Nare. LNCaP celler ble transfektert med pGL3-4ARE-E4 konstruerer med og uten innsetting av
SRD5A3
promoter (-191 /-72 bp) sekvens i begge retninger eller med innsetting av en
SRD5A1
promoter fragment (-1601 /-1501 bp). Celler ble behandlet med etanol (bærer) eller 100 nM DHT i 24 timer og deretter høstet for luciferase-assay. C, Mutasjoner i Nare avskaffet sin undertrykkende effekt. LNCaP celler ble transfektert med pGL3-4ARE-E4 konstruerer med og uten innsetting av
SRD5A3
promoter (-191 /-72 bp) eller med innsetting av det muterte
SRD5A3
promoter (-191 /-72 bp) og deretter utsatt for DHT behandling og luciferase assay
for å identifisere de antatte ER, har vi gjort en rekke sletting konstruksjoner i
SRD5A3
promoter-regionen.; konstruksjonene beholdt respons til androgen behandling inntil -191 /-91 bps ble slettet, noe som tyder på at den antatte ARE ligger i denne regionen (Fig. 5A).
For ytterligere å vurdere om denne regionen faktisk inneholder en Nare , innsatt vi området ved -191 /-72 bp mellom 4ARE og E4 kjerne promoter i pGL3-4ARE-E4-Luc konstruktet [41], transfekterte LNCaP-celler med det, og deretter behandles cellene med DHT. Den pGL3-4ARE-E4-luc konstruksjonen inneholder fire tandem gjentakelser av ARE av
PSA
genet og en E4 kjerne promoter [41]. Som vist i figur 5B, DHT behandling indusert om en 24-ganger økning i luciferase-aktivitet av de pGL3-4ARE-E4-Luc konstruktet. Når -191 /-72-bp region av
SRD5A3
promoter ble satt inn mellom 4ARE og E4, ble luciferase aktiviteten økt bare 3 til 6 ganger av DHT behandling, noe som tyder på at denne regionen inneholder en Nare. Når en 101-bp region avledet fra
SRD5A1
promoter (-1601 /-1501 bp) ble lignende inn mellom 4ARE og E4 som en kontroll, DHT behandling fortsatt induserte en 26-dobling av luciferase aktivitet. Videre mutasjoner i -191 /-72-bp regionen
SRD5A3
avskaffet sin undertrykkende evne (Fig. 5C). Sammen utgjør disse data tyder på at
SRD5A3
har en funksjonell Nare i sin promoter.
AR er rekruttert til Nare holdige regionen
SRD5A3
for å undersøke om AR er rekruttert til arrangøren av
SRD5A3 in vivo
, utførte vi brikken ved hjelp av genomiske DNA-fragmenter fra LNCaP celler (150-900 bp, fig. 6A) med primere spesifikt rettet mot Nare regionen
SRD5A3
. Som vist på PCR, ble AR anriket på nblir region når cellene vokste i nærvær av DHT (fig. 6B). Normal mus immunoglobulin G (som en negativ kontroll) ble også anvendt for immunopresipitering med LNCaP genomisk DNA; immunglobulin G ikke trekke ned noen AR-forbundet DNA-sekvenser av
SRD5A3
promoter (fig. 6B). Disse resultater antyder at AR er rekruttert til nblir region i promoteren
SRD5A3
.
A, Agarosegel-elektroforese av det spaltede kromatin av LNCaP-celler dyrket i fravær og nærvær av 100 nM DHT. DNA-fragmenter som vanligvis varierer mellom 150 og 900 bp. B, i samle kromatin av LNCaP-celler dyrket i fravær og nærvær av 100 nM DHT ble anvendt i forsøket immunoutfelling med anti-AR-antistoff eller normal mus immunoglobulin G. Etterpå ble protein-DNA-kryssbindende reversert, og renset DNA ble anvendt i PCR reaksjoner med primere flankerer Nare regionen. C, Tre oligo prober ble utformet for å dekke -191 /-91 bp regionen arrangøren av
SRD5A3
. D, AR binder seg til Nare av
SRD5A3
. De tre (biotin-merket) oligo prober ble inkubert med LNCaP cellekjerneekstrakt, med LNCaP cellekjerneekstrakt pluss umerkede oligo prober, eller med LNCaP cellekjerneekstrakt pluss AR-spesifikt antistoff.
For å finne ut om AR kan direkte samhandle med Nare av
SRD5A3
, gjennomførte vi EMSA med tre oligo prober, hver på 40 bp, for å dekke -191 /-91-bp region av
SRD5A3
promoter (fig. 6C). Bare sonde 1 viste en mobilitetsskift (fig. 6D). For å bekrefte at denne mobiliteten skiftet er spesifikke for AR, la vi anti-AR antistoffer mot reaksjonene; Sonden 1 viste en ytterligere mobilitetsskift (fig. 6D). Selv om umerket villtype sonden 1 var i stand til å konkurrere med merket probe 1 for AR-binding i EMSA, det mistet evnen til at når vi har gjort mutasjoner i sonden 1-sekvensen (figur S5).
Disse resultatene viste at proben 1 inneholder Nare og at AR binder direkte til denne regionen
in vitro
.
for
SRD5A1 Hotell og
SRD5A2
, vi også gjennomført promoter analyse og chip, men vi gjorde ikke oppdage et ARE region eller direkte AR binding til sine proksimale promoter regioner. Den regulational mekanisme for deres uttrykk er fortsatt under etterforskning.
SRD5A3
mRNA økning i AR-negative SCPC xenograft modell
På observere androgen-negative regulering av
SRD5A3
i de testede cellelinjer, var vi interessert i å undersøke om dette AR avhengig regulering forekommer også
in vivo
. Derfor undersøkte vi mRNA nivået av
SRD5A3
i forskjellige xenograft modeller, inkludert MDA PCa 183, en AR-uttrykke androgen-avhengige prostatakreft xenograft, og tre AR-negative androgen-uavhengig SCPC xenografter, MDA PCa 144 , MDA PCa 146, og MDA PCa 155. på QRT-PCR, ble det observert en bemerkelsesverdig høyere mRNA-nivå på
PSA
i MDA PCa 183 xenograft enn i den andre (fig. 7, øverst), som er i overensstemmelse med AR statusen til disse cellelinjer.
