Abstract
Genistein er en isoflavon funnet i soya, og dens chemo-forebyggende og -therapeutic effekter har blitt godt etablert fra
in vitro
studier. Nylig har imidlertid sine terapeutiske tiltak
in vivo
har blitt avhørt på grunn av motstridende rapporter fra dyrestudier, som er avhengige av gnagermodeller eller implantasjon av cellelinjer i dyr. For å klargjøre
in vivo
effekter av genistein i avansert prostatakreftpasienter, har vi utviklet en pasient-avledet prostatakreft xenograft modell, der en klinisk prostatektomi prøve ble podet inn immunmangelfull mus. Våre resultater viste en økt lymfeknuter (LN) og sekundære metastaser i organgenistein-behandlede mus sammenlignet med ubehandlede kontroller. Interessant, invasive maligne celler samles for å danne øyer /micrometastasis bare i de sekundære organer av genistein-behandlede grupper, og ikke i den ubehandlede kontrollgruppe. For å forstå den underliggende mekanismen for metastatisk progresjon, undersøkte vi celleproliferasjon og apoptose på parafin-seksjoner. Immunohistologiske data viser at tumorer av genistein-behandlede gruppene har mer prolifererende og færre apoptotiske kreftceller liknet med den ubehandlede gruppen. Våre immunoblottingforsøk data tyder på at økt spredning og metastasering er knyttet til forbedrede aktiviteter tyrosin kinaser, EGFR og dens nedstrøms Src, i genistein-behandlede grupper. Til tross for de chemopreventive effekter foreslått av tidligere
in vitro
studier kreftfremmende effekten av genistein observert her antyder behovet for nøye utvalg av pasienter og tryggere planlegging av kliniske studier
Citation. Nakamura H Wang Y, Kurita T, Adomat H, Cunha GR, Wang Y (2011) Genistein Øker epidermal vekstfaktor reseptor signalisering og fremmer tumorprogresjon hos Avansert Menneskelig prostatakreft. PLoS ONE 6 (5): e20034. doi: 10,1371 /journal.pone.0020034
Editor: Robert Z. Qi, Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong
mottatt: 07.02.2011; Godkjent: 10 april 2011; Publisert: May 16, 2011
Copyright: © 2011 Nakamura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av den kanadiske Institute of Health Research (MOP-86730: YZW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen noncutaneous malignitet blant nordamerikanske menn [1]. I 2009, ca 192, ble 280 nye tilfeller av prostatakreft diagnostisert, og 27 360 dødsfall ble rapportert i USA, ranking den nest høyeste i dødelighet etter lungekreft [2]. Sammenlignet med USA, forekomst og dødelighet av prostatakreft er betydelig lavere i Asia [3], [4], [5]. Innvandring studier har vist at asiater, som har vedtatt den vestlige kosthold etter innvandring til USA, hadde en signifikant høyere forekomsten av prostatakreft enn innfødte i asiatiske land [6], [7]. Blant mange kosttilskudd forskjeller mellom Nord-Amerika og Asia, forskjellen i soya forbruket er eksepsjonelle. Det er anslått at asiater bruker 20-50 ganger mer soya-baserte matvarer per innbygger i forhold til nord-amerikanerne [8]. Tidligere epidemiologiske rapporter har indikert en invers korrelasjon mellom soya forbruk og PCa risiko, noe som tyder på soya er chemopreventive effekter [9]. Den primære aktive komponenten av soya er en isoflavone kalt genistein (4,5,7-trihydroxyisoflavone) [10], [11], [12], [13]. På grunn av lignende molekylstruktur til østradiol, er genistein er kjent for å fremvise svak østrogen aktivitet ved å bindes til østrogenreseptoren (ER) og således modulere østrogen-regulert gen-transkripsjon i målorganene [14], [15].
de kreft effekter av genistein har blitt godt undersøkt
in vitro Hotell og rapportert i flere kreftcellelinjer inkludert leukemi, lunge, prostata og bryst [16], [17], [18], [19]. Data fra tidligere studier viser at genistein har et bredt spektrum av biologiske effekter, som inkluderer: induksjon av celledifferensiering og apoptose [17], [18], [19], [20], inhibering av cellevekst [19], [21 ], [22], [23], [24], og oppheving av signaltransduksjonsveier [25], [26], [27]. Genistein, og dermed har tiltrukket seg en betydelig mengde oppmerksomhet i kreftforskningen spesielt for sin hemmende effekt på protein tyrosin kinase (PTK) aktiviteter som er viktige i celle overlevelse og spredning [25], [26], [27].
Til tross for slike lovende
in vitro
kreft data, siste
in vivo
studier har rapportert motstridende resultater om genistein effekter på metastasering. Studier med tramp og PC-tre dyremodeller har vist at genistein uventet økt metastase [28], [29], mens en annen studie hvor en PC-3M
in vivo
modellen viste motsatt effekt [30]. Disse rapportene i kombinasjon med mangelfulle foreløpige resultater fra kliniske fase II-studier [31], [32] antyder et behov for nærmere undersøkelse av virkningene av genistein
in vivo
ved hjelp av modeller som er mer klinisk relevant enn andre konvensjonelle
in vivo
modeller som baserer seg på bruk av cellelinjer.
i vår studie har vi benyttet en subrenal xenograft teknikk ansette en lav passering av pasient avledet PCA prøven i ikke-overvektige diabetikere, alvorlig kombinert immunmangel (NOD-SCID) mus. De humane cancer xenografter trofast bevare de histopatologiske og genotypical egenskapene til den opprinnelige kliniske prøven [33], [34]. Ved å bruke vår pasient-avledet PCa xenograft-system, har man funnet at genistein ved farmakologisk dose øker celleformering, avtar apoptose og fremmer metastase i et avansert human PCa. Slike tumor-fremme effekter av genistein er assosiert med økt fosforylering av EGFR og Src tyrosin kinaser.
Metoder
1. Materialer og dyr
LTL163a tumorlinje (www.livingtumorlab.com) er avledet fra et høyverdig prostatacancer prøve erholdt fra en pasient, og den xenograft tumor transplantasjon linje ble utviklet fra denne klinisk prøve vev som tidligere beskrevet [33], [34]. Skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienten samt etikk godkjenning fra University of British Columbia-British Columbia Cancer Agency forskningsetikk Board (UBC BCCA REB), Vancouver, Canada. Dyr omsorg og eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene i den kanadiske Council of Animal Care (CCAC), og bruk av dyr for våre eksperimenter ble undersøkt og godkjent av Animal Care komité University of British Columbia (tillatelse #: A10 -0100).
i korthet svulstvev ble kuttet jevnt i flere små biter, 1 × 3 × 3 mm, og podet under nyrekapselen av NOD-SCID hannmus som var 6-8 uker gammel [33 ], [34]. To stykker av tumor pr nyre ble plassert under nyrekapselen. Host mus ble supplert med testosteron pellets (10 mg /mus), som ble utarbeidet med en PARR pellet press (PARR Instrument Co., Moline, Illinois) og implantert subkutant for å fremme cellevekst. Transplantatene ble dyrket i nyre området for 60~90 dager, høstet, og deler av transplantater ble fiksert for histopatologisk analyse. For å utvikle en tumor transplantasjon linje, ble høstede tumortransplantater som oppviser hurtig vekst skåret i små biter og re-podet på nyrene av nye verter. Etter tre transplantasjon generasjoner, ble hovne lymfeknuter bemerket, som ble delt i to og histologisk undersøkes for metastasering. Når metastaser ble bekreftet, friske lymfeknute vev som inneholder metastatisk innskudd ble gjen transplantert på nyrene å utvikle en metastatisk svulst linje og utpekt LTL163a.
2. Genistein behandling
For å studere de farmakologiske effektene av genistein i metastasering av menneskelig prostatakreft, valgte vi å bruke LTL163a metastatisk tumor-linjen, som ble hentet fra 10
th transplantasjon generasjon. Svulstene ble skåret i 1 × 3 × 3 mm biter og podet inn atten NOD-SCID hannmus med hver nyre har en svulst pode (2 grafts /mus). Testosteron pellets (10 mg) ble implantert subkutant som beskrevet ovenfor i alle dyr ved tidspunktet for poding for å opprettholde en tilfredsstillende serumtestosteronnivået fordi genistein-behandling er blitt vist å redusere serumtestosteronnivået til ved hypothalamus /hypofyse /gonadalaksen [35] . Syv dager etter podingen ble dyrene tilfeldig delt inn i tre grupper; kontroll (ubehandlet), lavdose og høydose av genistein (renhet 99%, LC Laboratories, Woburn, MA). Mus i lavdose gruppe ble gitt genistein oppløst i jordnøttolje ved gavage ved 2 mg /dag (80 mg /kg kroppsvekt /dag). Mus i høydose gruppen fikk 10 mg /dag (400 mg /kg /dag) av genistein. Kontrollmus mottok 0,1 ml av bare olje-kjøretøy. Alle gruppene ble matet samme gnagerdiett (PicoLab Rodent Diet 20) og gitt autoklaveres drikkevann. Genistein behandling ble startet en uke etter podning og fortsatte i tre uker. Transplantatene ble dyrket på nyrene for totalt 4 uker. Ved slutten av den 4
th uke, blodprøver og organer (nyre med tumor grafts, lever, lunge, milt og lymfeknuter) ble samlet for analyse.
3. Måling av serumnivåer genistein
LC-MS (væskekromatografi-massespektrometri) ble anvendt for å måle serumnivået av genistein. Først ble det frosne serumprøver tint på is, og 5 ul av 1 ug /ml luteolin i etanol ble tilsatt til 25 ul av serum som en indre standard (IS). Ekstraksjon ble utført ved å virvle med 80 mL acetonitril og 5 ul 0,2 M HCl. Ekstraktet ble klaret ved sentrifugering i 5 minutter ved 20 000 x g, og supernatanten ble oppsamlet, fortynnet 1:01 med destillert vann og sentrifugert i ytterligere 5 minutter. De resulterende supernatanter ble analysert. En Acquity UPLC med en 2,1 x 100 mm BEH 1,7 pM C18-kolonne koplet til en PDA detektor i samsvar med et Quattro Premier XE (Waters, Milford, MA) ble anvendt sammen med vann og acetonitril inneholdende 0,1% maursyre som mobilfaser. En 25-100% acetonitril-gradient fra 0,2-2,0 minutter ble anvendt, fulgt av re-ekvilibrering til startbetingelser for en total kjøretid på 4,5 min. MS ble kjørt ved enhet oppløsning med 3 kV kapillær, 120 ° C og 350 ° C kilde- og desolvation temperaturer, 50 og 1000 liter /time kjegle og desolvation N
2 gass flyter og Ar kollisjonsgass satt til 5.0e
-3 mbar. M /z 287 89 og 287 153 ble brukt for å oppdage luteolin IS, og m /z 271 91 og 271 153 ble brukt til genistein med kjegle spenning og kollisjonsenergier optimalisert for hver. OD data fra 210-600 nm, ble samlet opp med PDA detektor og OD260 ble også brukt som et endepunkt. En 5 punkt lineær kalibreringskurve fra 1-800 ng /ml til 218 ng /ml ble brukt for kvantifisering (R2 0,99; skjevhet 10%). Genistein-glucoronide ble antatt å være den vanligste formen for konjugat, og nivåene ble beregnet fra OD260 data med den forutsetning at utryddelse koeffisienten er lik som genistein.
4. Histopatologi og immunhistokjemi
Høstet kreft grafts ble halvert på det tykkeste punktet av svulsten. Den ene halvdelen ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin for histologisk /immunhistokjemi (IHC) analyser. Den andre halvparten var snap-frosset for protein analyse. Den faste vev ble bearbeidet til parafin og innebygd med midtlinjen snittflaten vender ned i parafin blokk, slik at delene begynte på den opprinnelige kuttet linjen overflaten. Fremstilling av parafininnstøpte vev og IHC-analyser ble utført som tidligere beskrevet [34]. De primære antistoffer som brukes i denne studien er Ki67 (Dako, Carpinteria, CA), caspase-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ERα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og ERβ (Biogenex Laboratories, San Ramon , CA). Alle vevssnitt var kontra farget med 5% (w /v) Harris hematoxylin og coverslipped med Permount (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA).
5. Lokal invasjon og metastase analyser
For å undersøke metastatisk forekomst, lunge, lever, nyre, bukspyttkjertel, lumbale og thorax lymfeknuter ble samlet inn fra hver mus. Hver av disse organene ble fiksert og behandlet som ovenfor for IHC analyse. Snittene ble farget med et anti-humant antistoff spesifikt mitokondrier (Millipore, Billerica, Massachusetts) og screenet for tilstedeværelse av metastatiske celler. Bilder av IHC-fargede seksjoner fra hvert organ ble tatt med en AxioCam HR CCD montert på en Axioplan 2 mikroskop og Axiovision 3.1 programvare (Carl Zeiss, Toronto, ON), med slutt forstørrelser av × 400. Prosenter av dyr som inneholder humane metastatiske celler i enten korsryggen eller thorax lymfeknuter ble beregnet. (I nyre- og bukspyttkjertelen lymfeknuter, alle dyr i tre grupper viste bevis på humane kreftceller, uavhengig av behandlingen og dermed utelatt i beregningen.) For lunge og lever, ble antallet positivt fargede celler telles innenfor tilfeldig utvalgte mikroskopiske felt per eksemplar .
6. Celleproliferasjon og apoptose analyser
spredningsindeks (PI) ble vurdert ved IHC ved bruk av en menneskelig bestemt spredning markør, Ki67. Bilder av IHC-fargede seksjoner fra hver pode ble tatt til fange som ovenfor. Midten delen av pode med de tettest befolkede humane kreftceller ble valgt for bildebehandling for alle svulster. Tallene for Ki67 positiv og negativ-humane celler ble tellet innenfor hele det mikroskopiske feltet for hvert graft av alle dyr og i gjennomsnitt. På grunnlag av den gjennomsnittlige celletall for hver behandlingsgruppe, ble PI beregnet som følger:. PI (%) = (Ki67-positiv celletall /total human celletall) x 100
Tilsvarende apoptotisk indeks (AI) var beregnet fra spaltes-caspase-3 farget IHC deler av kreft grafts. Antallet av apoptotiske celler pr 10000 humane celler ble tellet for hver tumor pode og i gjennomsnitt. AI ble beregnet som ovenfor.
7. Western blot analyse
De resterende halvdelene av høstes tumorvev var snap-frosset for protein analyse, som mus nyre vev ble kirurgisk fjernet ved hjelp av en dissekere mikroskop før frysing. Disse frosne vev ble homogenisert ved bruk av en morter og støter i NP-40 lyseringsbuffer (150 mM natriumklorid, 1,0% NP40, og 50 mM Tris-HCl pH 8,0) på is, sentrifugert ved 12.000 rpm i 20 minutter ved 4 grader Celsius i en mikrosentrifuge, og supernatanten ble oppsamlet. Den bicinchoninic syre (BCA) analyse (Thermo Scientific, Waltham, MA) ble utført i henhold til selskapets instrukser for å måle proteinkonsentrasjonen for hver tumorprøve, og absorbans ble målt ved 562 nm. For gel elektroforese ble proteinprøver kokt i 5 minutter, og 20 ug protein ble separert på SDS-PAGE (polyakrylamid gelelektroforese) gel og elektrooverført til en PVDF-membran. Membranen ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eller 5% ikke-fettmelk i Tris-bufret saltvann (pH 7,4) inneholdende 0,1% Tween 20 (TBST) og inkubert med primære antistoffer mot alfa aktin, fosfor (p) tyrosin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), total EGFR, p-EGFR (tyr1068), p-Src (tyr416) og total Src (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Etter primært antistoff inkubasjon ble membranene vasket med TBST og probet med passende HRP-konjugert sekundært anti-mus (Pierce, Rockford, IL) eller anti-kanin (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA) antistoffer. For å oppdage proteiner av interesse, ble en forbedret chemiluminescence Western blotting kit brukes (Pierce, Rockford, IL).
8. Statistisk analyse
Metastatisk Forekomst, sammenligning av serumnivåer, PI og AI ble evaluert ved hjelp av en to-tailed uparede Student
t
-test. Forskjeller ble ansett statistisk signifikant hvis
p
verdiene var mindre enn 0,05.
Resultater
Serum nivå av genistein
For å sikre at genistein behandlet gruppene fikk en farmakologisk dose av forbindelsen, serumkonsentrasjonen av genistein ble målt ved hjelp av høy-ytelse væske chromatography- massespektrometri (HPLC-MS). Våre HPLC-MS-analyse viste at den ubehandlede kontrollgruppen hadde en meget lav spor av serum genistein (0,002 ug /ml), som mest sannsynlig kilde er deres chow (PicoLab Rodent Diet 20, Delta, BC). Til sammenligning, lavdose og høydose behandlede dyr var 1,30 ug /ml til 6,63 ug /ml av fri genistein, respektivt. I våre behandlede mus, inntatt genistein dannet glukuronidkonjugater, og bare en liten del av genistein forble som frie aglycones i blodet. Nivåene av både frie og konjugerte genistein var betydelig høyere i lave (
p
0,04) og høy dose-behandlede mus (
p
0,0006) enn i kontrollgruppen (figur 1).
For behandling, seks dyr i lavdose gruppe ble gitt genistein oppløst i jordnøttolje ved gavage ved 2 mg /dag (80 mg /kg kroppsvekt /dag). Seks mus i høydose gruppen fikk 10 mg /dag (400 mg /kg /dag) av genistein. Fem kontroll mus (en døde før slutten av behandlingen) mottok 0,1 ml av bilen bare. Blod ble oppsamlet ved slutten av den 3 ukers behandling.
Kolonner
. Bety serumkonsentrasjon av genistein ± SD
Tumor vekst av pasient-avledet PCa xenograft etter genistein behandling
Effekter av genistein på metastasering av avansert menneskelig PCa ble undersøkt ved hjelp av vår pasient-avledet PCa xenograft tumor transplantasjon linje, LTL163a, som ble utviklet fra en prostatektomi utvalg av avansert stadium og valgt for metastatisk aktivitet. Svulster fra 10
th transplantasjon generasjon LTL163a svulst linjen ble kuttet i jevnstore biter (1 × 3 × 3 mm) og dyrket under nyre kapsler (en svulst stykke /nyre, to kreft grafts /mus) av atten mannlig NOD SCID-mus supplert med en 10 mg subkutan testosteron pellets. Syv dager etter podingen ble vertsdyr tilfeldig plassert i tre behandlingsgrupper; ubehandlet kontroll, lavdose og høydose genistein. Oral administrering av genistein eller olje (for kontrollgruppen) ble fortsatt i tre uker. På tidspunktet for innhøsting, ble forstørrede nyrer med velvoksne svulster kjent for alle tre gruppene. Det gjennomsnittlige volum av tumorer for kontroll, lavdose og høydose-grupper er; 650 mm
3, 655 mm
3 og 670 mm
3, henholdsvis. Til tross for økende tumorvolum trend for genistein behandling, var det ingen statistisk signifikant blant gruppene. I tillegg til den oppadgående ekspansiv tumorvekst fra nyrene overflaten, svulster fra alle tre gruppene invaderte lokalt inn i nyrene (data ikke vist).
Genistein fremmer lymfeknute og sekundære organ metastase
i for å kunne vurdere den fjerne spredning av kreftceller, samles vi i bukspyttkjertelen, thorax, lumbal og nyrenes lymfeknuter samt indre organer. Alle gruppene viste bevis på menneskelige kreftceller i nyre og bukspyttkjertelen lymfeknuter uavhengig av behandlingen (data ikke vist). Men i korsryggen og thorax noder, kontrollgruppen hadde ingen eller lav forekomst av metastaser (0% i korsryggen og 17% i thorax). I motsetning til dette, både lav- og høy-dose genistein behandlinger viste høyere metastatisk forekomst i disse to noder sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppen (figur 2a); (17% for lav-dose og 50% for høy-dose i lumbal-node. 50% for lav-dose og 83% for høy-dose i thorax node). Tilsvarende antallet metastatiske kreftceller i sekundære organer som lunge og lever var signifikant høyere i genistein-behandlede grupper enn kontroll (figur 2b). Selv om spredte kreftceller ble observert i sekundære organer hos alle musene (figur 2c), bare genistein-behandlede mus viste aggregasjonen av kreftceller ( 75 celleaggregater) i de organer for å danne øyer /micrometastasis som vist i figur 2d. Således, ved flere kriterier, genistein hadde en doseavhengig metastase fremme effekt på LN og sekundære organer i vår modell.
På tidspunktet for innhøsting, lunge, lever og fire lymfeknuter inkludert renal, bukspyttkjertel, korsryggen og thorax noder ble samlet inn fra alle dyr. Hver av disse organene er festet, behandles farget med et anti-humant antistoff spesifikt mitokondrier og screenet for tilstedeværelse av humane metastatiske celler. Bilder av IHC-fargede seksjoner fra hvert organ ble tatt med en AxioCam HR CCD montert på en Axioplan 2 mikroskop med endelige forstørrelser av × 400. a) Prosenter av dyr som inneholder humane metastatiske celler i enten korsryggen eller thorax lymfeknuter ble beregnet. I nyre- og bukspyttkjertelen lymfeknuter, alle dyr i alle tre gruppene viste bevis på humane kreftceller, uavhengig av behandlingen (data ikke vist) og dermed utelatt i beregningen. Men genistein behandlede gruppene viste økt forekomst av metastaser i korsryggen og thorax noder sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe. Den metastatisk spredning i korsryggen og thorax lymfeknuter er presentert som gjennomsnittlig prosent i mus som bærer LTL163A kreft grafts fra tre grupper (ubehandlet-kontroll, lavdose og høydose genistein).
Svart kolonne: metastatisk forekomsten av thorax lymfeknute. Hvit kolonne: metastatisk forekomst av kors lymfeknute
. b) For lunge og lever, ble antallet positivt fargede celler telles i løpet av tilfeldig valgte mikroskopiske felt.
Kolonne
: gjennomsnittlig antall invadere kreftceller per mikroskopisk felt observert i lunge og lever av de tre gruppene ± SD. Resultatene ble statistisk analysert ved t-test på 95% konfidensintervall. c) Ki67-IHC farging av representative deler av sekundære organer (lever og lunge) fra ubehandlet-kontroll og genistein-behandlede mus. Ki67-antistoff anvendt i denne studien er human spesifikk. Alle forstørrelser er × 400. d) Ki67-IHC-farging av leveren fra en genistein-behandlede dyr viser aggregering av invaderende kreftceller. Rød sirkel indikerer en liten øy /micrometastasis fokus inneholder 75 humane kreftceller, som ble observert bare i genistein-behandlede mus. Forstørrelse er × 400.
Genistein påvirker celleproliferasjon og apoptose
Fordi våre data viste at genistein fremmet spredningen av humane kreftceller i mus verter, vi undersøkt dens virkning på tumorcelle spredning og apoptose. Immunhistokjemi ved anvendelse av en human-spesifikt Ki67-antistoffet ble utført for å måle hastigheten av tumorcelle-proliferasjon. Resultatet viste sterk positiv intensitet innenfor tumor grafts i alle grupper, så vel som i den lokalt invaderte region til mus nyre (data ikke vist). Spredning indeks (PI) ble målt fra midtpartiet av svulst pode området. Sammenligningen mellom gruppene viste at både lav- og høydose gruppene hadde høyere PI (77,3% og 86,1%, henholdsvis) enn ubehandlet kontroll (70,0%), men bare i høydose gruppen var signifikant forskjellig fra den ubehandlede kontrollgruppen (
p = 0,004
) som vist i figur 3.
spredningsindeks (PI) ble bestemt ved hjelp av IHC en human spesifikk proliferasjon markør, Ki67. Tallene for Ki67 positiv og negativ-humane celler ble tellet i løpet av tilfeldig valgt mikroskopisk felt for hver tumor graft av alle dyr og i gjennomsnitt. Spredning Index (%):. (Ki67 positive celletall /total human legemer) × 100
Vi har også undersøkt om genistein påvirket utbredelsen av programmert celledød, apoptose. Immunhistokjemisk analyse med et anti-kaspase 3-antistoff viste at svulster hos genistein-behandlede mus hadde færre caspase-3-positive celler enn i kontrollgruppen (Figur 4). Kontrollgruppen hadde høyest apoptotisk indeks (AI) på 0,18%, mens både lav- og høydose gruppene hadde en AI på bare 0,07% (
p = 0,05
: Figur 4a), noe som indikerer en betydelig redusert frekvensen av celledød i genistein-behandlede svulster.
apoptotisk indeks (AI) ble beregnet ut fra caspase-3 farget IHC deler av kreft grafts fra alle mus. Antallet av apoptotiske celler pr 10000 humane celler ble tellet for hver tumor pode og i gjennomsnitt. a) apoptotisk Index (%) = (Caspase-3 positive celletall /total human celletall) × 100. b) Caspase-3 immunhistokjemi farging av tumor grafts fra ubehandlede og behandlede dyr. Røde piler indikerer positive /apoptotiske celler. Alle forstørrelser er × 400. Innfelt er et forstørret bilde av positive celler.
Genistein øker fosforylering av protein tyrosin kinaser
Forrige
in vitro
studier har vist at genistein modulerer tyrosin signalveier etter endrer kinase aktivitet [25], [26], [27]. For å bestemme om forbedret metastase observert i den genistein-behandlede mus var knyttet til endret fosforylering mønstre, ble utført Western blot-analyse på tumor-avledede proteinlysatene ved hjelp av et anti-fosfotyrosin-antistoff. Immunoblotting viste at genistein-behandlede tumorer hadde høyere grad av fosforylering ved en 60 kDa proteinbånd i forhold til den ubehandlede kontrollgruppen. Interessant, ved lengre eksponering av røntgenfilm, ble mer intens båndmønster ble observert for høymolekylære proteiner i den genistein-behandlede gruppen sammenlignet med kontroll (figur S1). Av spesiell interesse var et band på 170 kd. Lengre eksponering avslørte band i genistein-behandlede gruppen mens ingen fosforylering ble observert i kontrollgruppen på denne størrelse protein.
For å undersøke dette nærmere, vi utførte immunblotting med antistoffer rettet mot spesifikke tyrosin kinaser. De mulige kandidater for 60 kDa og 170 kDa proteiner (pilene på figur 5 og figur S1) er Src og dets potensial oppstrøms molekyl, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Som vist i figur 6a, genistein økt total EGFR proteinekspresjon litt når sammenlignet med kontroll. Mens nesten alle ubehandlede kontroll svulster (unntatt én) viste svært lite eller ingen fosforylering av dette proteinet, de fleste genistein behandlet svulster viste høy band-intensitet (figur 6a). På samme måte, Src, et mål av EGFR, viste svak oppregulering av totalt protein ekspresjon sammenlignet med kontrollgruppen. Igjen ble ingen fosforylering av Src observert i kontrollgruppen (bortsett fra en tumor i et lengre eksponeringstid), mens en betydelig høyere grad av fosforylering ble observert i de genistein-behandlede tumorprøver (figur 6b). Disse spesifikke EGFR og Src immunoblot bandet mønstre (figur 6) bekrefter den generelle p-tyrosin fargemønstre observert tidligere (figur 5).
Etter tre ukers behandling av genistein, ble svulster høstet, og protein ble hentet fra seks genistein-behandlede og ubehandlede fem-kontroll mus (en av kontrollmusene døde i løpet av behandlingen). Western blot-analyse ble utført på tumoravledet protein lysatene for fosfotyrosin som beskrevet i Materialer og Metoder. Den samme blott ble farget med et anti-a-aktin-antistoff for å evaluere protein lasting. Lanes representerer proteiner fra enkelte svulster.
a) Genistein øker fosforylering av EGFR på tyrosin 1068 rest. Nedenfor er kvantifisering av bandet intensiteten for fosforylert EGFR fra proteinlysatene av 5 ubehandlet kontroll og 6 genistein behandlet svulster.
Kolonner
: gjennomsnittsratio av fosforylert EGFR /totalt EGFR proteinbåndet intensitet ± SD. b) Genistein påvirker fosforylering av Src på tyrosin 416 rester. Aktivert Src-ekspresjon er signifikant høyere i genistein-behandlede tumorer enn det som i ubehandlet kontroll. Lanes representerer proteiner fra individuelle svulster.
Diskusjoner
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i Nord-Amerika. Siden introduksjonen av androgen ablasjon terapi ved Huggins og Hodges i 1940, har hormon manipulasjon blitt brukt som den viktigste behandling ved avansert PCa [36]. Til tross for innledende tumor regresjon etter hormonbehandling, kan enkelte gjenværende PCA cellene overleve denne behandlingen, erverve androgen uavhengighet og bli hormon ildfast [37]. Når sykdommen utvikler seg til den hormon ildfaste tilstand, er det ingen effektiv behandling for tiden tilgjengelige [38]. Derfor har en betydelig mengde arbeid blitt investert i strategier for å behandle avansert PCa. Tidligere
in vitro
studier har antydet at genistein har kjemoterapeutisk potensialet på hormonavhengige kreftcellelinjer. Men genistein er
in vivo
handlinger har nylig blitt utfordret av motstridende rapporter [28], [29], [30], [39], [40], [41], [42]. For eksempel, en studie rapporterte at genistein inhiberte PC3 ben tumorvekst i SCID-mus [43], og en annen viste at genistein redusert lungemetastase i androgen-reseptor-negative PC3-M implanterte mus, som ble matet genistein anriket chow [30]. I motsetning til dette, Raffoul
et al. Fant
at genistein inntak fører til en økning av lymfeknutemetastase i sin PC3 implantert dyremodell [29]. I 2009 Touny og Banerjee demonstrerte bifasisk effekter av genistein ved hjelp av TRAMP mus (transgene adenokarsinom mus prostata) modell. Genistein hemmet dårlig differensiert PCa i disse musene når innlemmet i kostholdet før startfasen (dvs. når musene ble matet genistein-diett mellom 4~12 ukers alder). Men hvis genistein-diett ble gitt til de eldre trampe mus i alderen 12~20 uker, når prostata intraepitelial neoplasi (PIN) var allerede til stede, det fremmet PCa progresjon og indusert lymfeknutemetastase [28]. Fra slike data kan det underforstått at levetiden moderat forbruk av (eller tidlig eksponering for) genistein er viktig i forebygging av sykdommen, men som genistein kan ikke oppvise kjemoterapeutiske virkningene
in vivo
gang PCa har allerede det er etablert eller kommet til et avansert stadium.
for å løse striden av genistein effekter
in vivo
, har vi utviklet en klinisk relevant xenograft modell som har blitt generert fra en pasient prostatektomi prøven. Den resulterende pasient avledet prostata svulst linje som brukes i vår studie, LTL163a har blitt dyrket for bare 10 generasjoner i immun-mangelfull mus og har beholdt de opprinnelige histopatologiske og genotypical karakteristikker av den opprinnelige prøvematerialet [33], [34]. Våre data viser at både lave og høye dosegenistein behandlinger fremmer metastase i denne avanserte human PCa transplantasjon linje. Selv om tumorstørrelse var ikke signifikant forskjellig mellom kontroll og genistein behandlede grupper etter 3 ukers behandling, metastatisk insidensen var større i genistein behandlet vs ubehandlede kontroller. Den metastatisk progresjon observert i vår modell ble preget av økt celleproliferasjon og redusert apoptose.
