Abstract
multiresistens drevet av ABC membran transportører er en av de viktigste årsakene til behandlingssvikt i menneskelig malignitet. Noen begrenset bevis har tidligere blitt rapportert på cellesyklusen avhengighet av ABC transportør uttrykk. Det har imidlertid aldri blitt demonstrert at den funksjonelle aktiviteten til disse transportører korrelerer med cellesyklusen stilling. Her studerte vi frekvensen av indre ABC transport i forskjellige faser av cellesyklusen i dyrkede MCF-7 brystkreftceller. Kursen ble preget i form av utstrømningen kinetikk fra celler lastet med en ABC transportør underlaget. Som gjennomsnittet av de kinetikk i løpet av en cellepopulasjon kan føre til feil, studerte vi kinetikken av ABC transport på enkeltcellenivå. Vi fant at frekvensen av ABC transport i MCF-7 celler kan beskrives ved Michaelis-Menten kinetikk med to klassiske parametere,
V
max og
K
M. Hver av disse parametrene viste lignende unimodale distribusjoner med forskjellige posisjoner av maxima for celle subpopulasjoner i 2c og 4c stater. Sammenlignet med de 2c celler, 4C celler utstilt større
V
max verdier, noe som indikerer en høyere
aktivitet
av transport. De har også vist en større
V
max /
K
M-forhold, noe som indikerer en høyere
effektivitet
av transport. Våre funn tyder på at cellesyklusrelaterte modulering av MDR kanskje må tas i betraktning når man utformer kjemoterapiregimer som inkluderer cytostatika
Citation. Koshkin V, Krylov SN (2012) Sammenheng mellom Multi-Drug resistens Associated Membran Transport i Klonale kreft celler og cellesyklus fase. PLoS ONE syv (7): e41368. doi: 10,1371 /journal.pone.0041368
Redaktør: Henning Ulrich, Universitetet i São Paulo, Brasil
mottatt: 12. april 2012; Godkjent: 20 juni 2012; Publisert: 25.07.2012
Copyright: © 2012 Koshkin, Krylov. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kilde finansiering: naturvitenskap og Engineering Research Council Canada (https://www.nserc-crsng.gc.ca/), Grant nummer~~POS=HEADCOMP: 238990-1011. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
et av de største problemene i kreftbehandlingen blir redusert eller opphevet tumor respons på kjemoterapi, som er forbundet med såkalt multiresistens (MDR)
1, drevet av en superfamilie av ATP-bindende kassett (ABC) plasma membran transportører [1]. Disse ABC-transportører utføre energiavhengig utover transport av et bredt spekter av xeno- og endo-biotika fra celler; spesielt, antikreftmidler fra kreftceller. Forsøk på å kontrollere MDR i kreftceller har, så langt, ikke produsert klinisk merk resultater.
Det ble tidligere antydet at multiresistens er korrelert med en celle posisjon i cellesyklusen [2]. Denne korrelasjonen kan være nyttig for nåværende kjemoterapi behandlinger som kombinerer både cytotoksiske og cytostatiske midler [3], for å tillate den foretrukne akkumulering av tumorceller i en eller annen fase av cellesyklusen. Å forstå forholdet mellom MDR og cellesyklus er nødvendig for å sikre at celler ikke blir bedt inn i et cytotoksin bestandige fase av cellesyklusen.
Den nåværende bevis knytter cellesyklusprogresjon med MDR er fragmentarisk eller ufullstendig, og presentert for det meste av korrelasjonsdata mellom mobilfaser og uttrykket nivåer av visse ABC-transportører [2], [4], [5]. Ekspresjonselementene data ikke være avgjørende, som MDR kapasitet i kreftceller bestemmes ikke bare ved ekspresjon av plasmamembran transportører av ABC-familien, men ved en rekke andre faktorer, deriblant sammensetning og det fluid tilstand av plasmamembranen, den tilstedeværelsen av relevante kofaktorer, modulatorer, etc. Således kan vanlig brukte vurdering av MDR kapasitet gjennom analyse av transportøren ekspresjon ble funnet å være upålitelige i en rekke tilfeller [6] – [8]. Vårt arbeid var motivert av den innsikt at de direkte kinetiske målinger av MDR transport kan tjene som en ultimate indikator på celle chemoresistance. Vi antok at cellene progresjon gjennom cellesyklusen kan være sammen med en modulasjon i narkotika efflux kinetikk – et resultat av cellesyklus-relaterte proteomikk, membran, og metabolske endringer i cellen. I et forsøk på å avsløre subtile inter forskjeller i MDR aktivitet, vi nylig utviklet en encellede-kinetikk tilnærming og demonstrerte sin høye følsomhet for deteksjon inter variasjon av membrantransport [9]. Her presenterer vi en detaljert studie av cellesyklus modulering av MDR transport ved å bruke encellede-kinetikk tilnærming (Fig. 1). Det tilbyr funksjonelle bevis for celle-syklus-relaterte modulering av MDR aktivitet og foreslår at denne effekten bør potensielt bli vurdert i utformingen av kombinasjonen kjemoterapiregimer.
Fastsettelse av
V
max og
K
M for cellepopulasjon ved gjennomsnittsberegning: (i) encellede
V
max og
K
M (enkelt- celle tilnærming) og (ii) encellede rå signaler (befolkning tilnærming).
Materialer og metoder
kjemikalier og materialer
MCF-7 celler (human brystkreftcellelinjen [10], [11]) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ATCC # HTB-22), dyrket i de anbefalte media og kosttilskudd ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 miljø og brukes innen en 6-måneders periode. Fluorescerende prober MDR rhodamin 123, fluorescein, mithoxantrone, samt propidiumjodid (PI), ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Alle andre reagenser ble oppnådd fra Sigma-Aldrich, Fluka AG Buchs (Sveits), og BDH Chemicals Ltd. (Poole, England).
Måling av Oppsamling og effluks av Fluorescent MDR prober i cellepopulasjoner ved flowcytometri
Cellular innholdet fluorescerende MDR-prober ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri (BD FACSCanto II strømningscytometer, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i et medium bestående av 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na
2HPO
4, 2 mM KH
2PO
4 2 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, og 10 mM glukose. Etter å ha blitt lastet med proben (1-5 pM, 30-45 min, 37 ° C), celler (ca. 10
6 celler /ml) ble sedimentert, vasket, resuspendert i friskt medium (inneholdende 5 uM PI), og undersøkt for intracellulær sonde innhold ved hjelp av en standard argon-ion laser utslipp ved 488 nm for fluorescens eksitasjon og 530/30 nm båndpass utslipp filter for fluorescens deteksjon av rhodamine 123, calcein, og fluorescein og en 585/42 bånd passere utslipp filter for påvisning av PI. For å evaluere akkumulering av mitoxantron, prøvene var spent med en 635 nm-rød diode laser, og en 680/32 nm båndpass utslipp filter ble anvendt for å detektere fluorescens. For den kvantitative kinetic MDR studien, ble utviklingen av fargestoff effluks overvåket av flowcytometrisk repetitive prøvetaking av cellesuspensjoner på passende tidspunkter.
Måling av MDR Transport i enkeltceller ved fluorescens Kinetic Mikros
celler dyrket til 50-60% konfluens ble supplert med 10 uM glyburid (MDR inhibitor) og lastet med 5 pM fluorescein i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter vasket fritt for ekstracellulært fluorescein og glyburid og plassert i KRB buffer. Kinetikken til fluorescein-utstrømningen ble overvåket med 5 minutters intervaller ved bruk av en laser scanning konfokal fluorescens mikroskop (Fluoview FV300, Olympus, Japan), med en argon-ion-laser eksitasjon ved 488 nm og den XF75 Omega filtersett (Omega optisk, Inc. Brattleboro , VT) ved å følge en metode som er beskrevet andre steder [12].
Bestemmelse av celleviabilitet og Cell Cycle Posisjon
Etter fullførelse av fluorescein effluks, ble cellene ladet med PI (10 uM, 10 min ) for å identifisere apoptotiske celler. Cellene ble deretter behandlet med plasmamembranen-spesifikke detergent, saponin (80 ug /ml) og RNAase A (0,02 mg /ml) for å tillate innskyting PI med kjerne-DNA. Fluorescens fra PI-behandlede celler var begeistret med en grønn Kr laser og oppdaget med XF35 Omega filtersett (Omega Optical, Inc. Brattleboro, VT). Fluorescensintensitet av PI ble anvendt for å bestemme celle stilling i cellesyklusen [12] – [14]
Kinetic Montering og simuleringsmetoder
Kinetikk av MDR transport ble beskrevet av fremdrifts kurver av fluorescein. efflux som ble tilpasset til den integrerte Michaelis-Menten-ligningen for en enkelt-substrat irreversibel reaksjon: hvor [S]
0 og [S] er de første og nåværende substratkonsentrasjoner, henholdsvis [15], [16]. Denne ligning ble også brukt for å bygge befolkningen kinetiske modeller. Montering og modellsimuleringer ble utført med KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) og Origin (Microcal Software, Northampton, MA) programvare.
Resultater
Generelt Karakterisering av Intrinsic multiresistens i MCF -7 celler
Første studium på den indre chemoresistance av MCF-7-celler ble utført ved anvendelse av strømningscytometriske målinger av MDR substrat opphopning i celler og dens avhengighet av MDR-inhibitorer. Celler ble lastet med kombinasjoner av klassisk brukte fluorescerende substrater (rhodamin 123, mitoksantron, og fluorescein) og hemmere (ciklosporin A, verapamil og glibenklamid) spesifikke for ulike familier av MDR-tilhengere [17], [18]. Disse målingene viste at kun den fluorescein /glyburid par oppviste inhibitor (glyburid) Avhengigheten i cellulært opptak av fluorescerende probe (fluorescein) i MCF-7-celler (Fig. 2A). Cellenes evne til å utelukke fluorescein (men ikke rhodamin 123 og mitoxanthrone) er karakteristisk for MRP-type transport [17], [19]. Dette stemmer med tidligere rapporter om iboende narkotika-utstrømning aktivitet i MCF-7 celler [20] – [22] og i bryst kreft [23]. Dermed er det bare MRP type transport og dens regulering ble videre undersøkt i dybden
A
, tilstedeværelse av iboende MDR-aktivitet i MCF-7-celler ble beregnet ved akkumulering av:. Rodamin 123 uten eller med ciklosporin A (- /+ inh) – for MDR familie av transportører; fluorescein uten eller med glibenklamid – for MRP familien; mithoxantrone uten eller med ciklosporin A – for BCRP familien.
B
, representant sekvens av flowcytometrisk histogrammer, i løpet av fluorescein utstrømming kjøpte 0, 30, 60 og 90 min etter lasting.
C
, kinetikken til fluorescein effluks, effekten av glyburid anvendelse (inhibitor av MRP-type transportører), glukose tilbaketrekking, og anvendelse av etylesteren av GSH.
D
, Michaelis passer til fremdriften av fluorescein utstrømming i cellepopulasjon.
For kinetisk karakterisering av MDR i MCF-7 cellepopulasjoner, ble cellene først lastet med fluorescein i tilstedeværelsen av glyburid og tillates deretter å ekstrudere det etter fjerning av ekstracellulær fluorescein og glibenklamid ved gjentatt sentrifugering og vasking. Kinetikken for fluorescein-utstrømning ble avledet fra de midlere verdier av den fluorescerende intensitet oppnådd fra flowcytometri målinger ved passende tidsintervaller (fig. 2b, 2c). Alt flowcytometri histogrammer ervervet i denne studien viste at en gradvis utstøtning av fluorescein fra MCF-7-celler produsert en unimodal mønster (fig. 2B). Dette tyder på at de observerte fluorescens kinetikken i hovedsak reflekterer fluorescein transport i bulk populasjon av celler som har en ensartet fordeling av MDR-aktivitet. På denne måte noen viktige aspekter av indre MDR transport i MCF-7-celler ble etablert som beskrevet nedenfor.
Først, bestemmes at det er forholdet mellom den observerte totale transmembranstrømmen til fluorescein og MDR transport. Den sterke glyburid-indusert hemming av transport, er vist på fig. 2C, viser at nesten hele fluorescein fluks av MCF-7-celler ble drevet av MDR pumper (glyburid-inhiberbare transportører), som er blitt funnet i noen andre celletyper [24], [25] Kinetiske spor av fluorescein-utstrømning kan monteres ved å bruke den integrerte Michaelis-Menten-ligningen (fig. 2D) som er i overensstemmelse med tidligere rapporterte Michaelis oppførsel av ABC-transportører [26], [27]. Dermed Michaelis kinetiske parametere av fluorescein utstrømming,
V
max og
V
max /
K
M, kan tjene som en indikator av MDR aktivitet og effektivitet, henholdsvis.
for det andre, vi vurderte faktorer (annet enn transporter og substrat konsentrasjoner) som var potensielt kunne påvirke tidsforløpet av fluorescein utstrømming. Disse faktorene er: tilførsel av energi (ATP) for aktiv transport og leveranse av en sannsynlig co-substrat (redusert glutation, GSH) for MRP transportører. For å utelukke disse mulighetene, varieres vi mediet innholdet av ATP-produksjon av glukose og den membran-gjennomtrengelige etylesteren av GSH (Fig. 2C). Resultatene indikerte at disse faktorene ikke begrense transport av fluorescein fra MCF-7-celler under betingelser som anvendes. Disse fakta ytterligere bekreftet gyldigheten av å bruke de kinetiske parametere av fluorescein utstrømning i disse cellene for å karakterisere MDR aktivitet.
Befolkning vs encellede tilnærming i Kinetic Studier av unimodalt celle populasjoner
Kinetics av MDR transport er vanligvis studerer ved hjelp av hele cellepopulasjoner [25], [28], [29], en tilnærming som er ansett for å være nøyaktig i å etablere de viktigste trendene i unimodale celle ensembler [30]. En nyere arbeid utført av Wong og co-forfattere har vist at gjennomsnittscellekinetikk over hele cellepopulasjonen betydelig grad kan forstyrre reaksjonen for å bestemme når den celle-til-celle variasjon innenfor en befolkning er høyt (25-160 ganger i enzym aktivitet og /eller substrat innhold) [31]. For systemet vårt, var vi interessert i om ikke befolkningen i snitt kunne innføre betydelige feil i målinger av Michaelis-Menten parametre ved moderat (2-10 ganger) celle-til-celle variasjon i transportaktiviteten. For å besvare dette spørsmålet, vi opprinnelig utført kinetisk simulering på cellepopulasjon modell. Vi vurderte en gruppe av celler med identisk
K
M verdier og opprinnelige underlaget nivåer, men med varierende
V
max (fordelt på en Gaussian måte over en 9-fold range ) (fig. 3A, tabell 1). Kinetiske spor av substrat ekstrudering for hver celle, ble simulert ved hjelp av den integrerte Michaelis-Menten-ligningen (fig. 3B). Kinetikken for enkeltceller kan behandles på to måter er beskrevet nedenfor (se fig. 1).
Simulering av encellede og populasjonskinetikken til en Michaelis-Menten-type reaksjon.
En
, variant av
V
maks i en befolkning på 10 individuelle celle celler.
B
, simulert encellede og gjennomsnittlig befolkningskinetikk, simulering utføres ved hjelp av den integrerte Michaelis-Menten ligningen:
V
max
t
= ([S]
0 – [S]) +
K
M ln ([S]
0 /([S]
0 – [S]).)
for det første kan de kinetiske parametere for hver celle utledes fra encellede kinetiske spor ved å tilpasse til den integrerte Michaelis-Menten ligningen og deretter gjennomsnitt for befolkningen. Disse gjennomsnitt vil være lik gjennomsnitt av inngangsparametre som benyttes for simuleringene (tabell 1, rad 6). Spesielt i gjennomsnitt
V
max er lik
V
max verdien av modale celletype (Fig. 3A, sentral bin). Således, de gjennomsnittlige kinetiske parametere av befolkningen faller sammen med parametrene til sperrende celletype som er forventet for Gaussiske distribusjoner.
For det andre, i stedet for i snitt Michaelis-Menten parametre, kan man med midlere kinetisk traser (fig. 3B). Legg merke til at i et eksperiment, dette skjer når det totale signalet fra cellepopulasjonen er registrert ved hjelp av metoder slik som kinetisk flowcytometri, spectrofluorometry, og hel-felt mikroskopi. Fra fig. 3B, kan man se at i gjennomsnitt populasjonskinetikk som genereres på denne måten avviker vesentlig fra kinetikken av den sperrende celletype (fig. 3B korresponderer tykkere trase til celler av type 3). Den gjennomsnittlige befolkningen spor avviker fra den modale befolkningen spor fordi de raskest celler har en tendens til å bremse ned og fullføre reaksjonen tidligere enn de tregeste de, og jo lenger reaksjonen løper mot fullførelse, de større bidrag treg celler har på de gjennomsnittlige befolkningskinetikk. Av denne grunn, i gjennomsnitt populasjons traser generert på denne måten har en større krumning enn de modale populasjons spor, og føre til en feilaktig oppfatning av cellulære kinetikk. Som et resultat, selv om hver enkelt celle tett retter seg etter Michaelis-Menten kinetikk, for en 9 gangers variasjon i
V
max, passer populasjonen middelverdien spor denne meget dårlig kinetikk. For en tre-fold variasjon, synes Michaelis passende å være tilfredsstillende visuelt, men gir en flere ganger overvurdering av
V
max og
K
M (tabell 1, rad 7).
To andre kinetiske parametre,
K
M og [S]
0, ble utsatt for analog variant på enkeltcellenivå, og forårsaket kvalitativt lignende, men kvantitativt mindre overestimering i deres gjennomsnitt populasjonsnivå-verdier (20-50% av den midlere parameterverdi ved 3-gangers variasjon, data ikke vist). En slik forskjell kan være av begrenset betydning i analysen av fast spredte eksperimentelle data. Samtidig, en flere ganger overvurdering av befolkningen
V
max og
K
M, forårsaket av celle-til-celle
V
max variasjon, vil skape en helt galt bilde av prosessen som studeres.
det skal bemerkes at både ne populasjonen og encellede tilnærming ville gi identiske resultater hvis cellepopulasjonen analysert var fullstendig homogen , som er åpenbart ikke tilfelle. Befolkningen tilnærming alltid resulterer i systematiske feil når den brukes til en heterogen cellepopulasjon og feilene øke med økende heterogenitet. Den encellede tilnærming er riktig sett ut fra matematisk statistikk og således alltid returnerer kinetiske data på riktig måte beskriver den analyserte cellepopulasjon uansett hvor heterogen er befolkningen. Dermed, for belysning av mulige kinetiske forskjeller mellom celler i ulike stadier av cellesyklus, søkte vi den encellede tilnærming.
Modulation av MDR Kinetics i løpet av Cells «Progresjon gjennom cellesyklusen
kinetikk fluorescein utstrømming fra enkeltceller ble målt ved hjelp av kvantitativ time-lapse fluorescens konfokalmikroskopi. Kalibrering av cellulær fluorescens ble utført i to trinn. Først fluorescens fra intracellulær fluorescein og fluorescein i oppløsning ble sammenlignet. For dette formål, testet vi utslipp fra suspensjonen av fluorescein-lastet-celler før og etter cellelyse med 0,1% Triton X-100. Frigjøringen av farvestoffet fra cellene hadde ingen signifikant effekt på dets fluorescens, hvilket viser at det fluorescente signalet fra intracellulær fluorescein kan bli kvantifisert ved å bruke fluorescein-løsninger for kalibrering. For det andre, etter hver serie av celle målinger, standard oppløsninger av fluorescein ble plassert inn i cellen kammeret, og deres signaler ble tatt opp med de samme optiske innstillinger. Lineær utslippskonsentrasjon avhengighet generert på denne måten (data ikke vist) tillater oss å bestemme absolutte konsentrasjoner av intracellulær fluorescein (fokus volum var mindre enn cellevolumet).
Fluorescein-utstrømning ble initiert ved fjerning av glyburid, som hemmer membranpumpe, og overvåkes inntil tilsynelatende avslutning (fig. 4AA og 4ba). Etterpå ble cellene behandlet med PI for å identifisere apoptotiske celler for å utelukke dem fra den kvantitative analysen. Til slutt, ved tilsetning av saponin (som syrer plasmamembranen) og RNAase (som fjerner interfererende RNA), ble PI tillatt å gå inn alle celler og beis DNA (fig. 4ab). Fluorescensintensitet av PI ble anvendt for å tildele celler til enten 2c (G1 /G0) fase eller 4c (G2 /M) fase (Fig. 4BB) slik at kinetikken av fargestoff-utstrømning fra enkeltceller som tilhører den første og andre halvdelene av cellecyklusen (før og etter DNA-duplisering) kunne estimeres
Representative fluorescens bilder (scan format 100 x 100 um) av fluorescein-utstrømning, etterfulgt av farging PI (b) i MCF-7-celler som anvendes for målinger av transport kinetikk og cellesyklusprogresjon, henholdsvis.
B
, (a) typisk kinetisk kurve som viser transport av fluorescein fra en enkelt celle og dens Michaelis-Menten-form, og (b) cellesyklus-histogram oppnådd etter fullføring av fluorescein transport.
C
, frekvens polygoner som viser karakteristiske distribusjoner av
V
max (a), og
V
max /
K
M (b) verdier hos celler i 2c og 4c stater (typiske distribusjoner som representerer 4 uavhengige cellepopulasjoner blir vist). Pilene viser gjennomsnitts og modale stillinger i fordelinger av MDR parametre (tykke og tynne pilene tilsvarer 2c og 4c celler, henholdsvis).
D
, 4c /2c forhold mellom gjennomsnittsverdier for
V
max, og
V
max /
K
M oppnås ved parallell anvendelse av enkelt celle- (tomme kolonner) og population- (fylte søyler) -orientert analyse for å MDR kinetikk i 2c og 4C subpopulasjoner, som representerer 4 uavhengige cellepreparater.
Fluorescein utstrømming fra flertallet av enkelt MCF-7 celler dannet Michaelis-Menten kinetikk, med unntak av ca. 5% av cellene som hadde vist PI farging før gjennomtrengning og /eller unormale efflux kinetikk; Disse celler ble ekskludert fra analysen. Figur 4C viser at cellesyklus overgang fra den 2c fasen til 4c fase ble fulgt med en forskyvning i MDR-aktivitet (karakterisert ved
V
max) og effektivitet (karakterisert ved
V
max /
K
M) fordelinger mot høyere karakterer. Følgelig 4N celler viste forhøyede middelverdier av
V
max og
V
max /
K
M (øvre pilene i fig . 4C frekvens polygoner, og statistisk oversikt i fig. 4D). Denne forskjellen var enda større i form av modale nivåer av MDR i 4c og 2c subpopulasjoner (lavere pilene i fig. 4C frekvens polygoner). De modale verdier av MDR aktivitet preger den mest tallrike celletype i befolkningen og bestemmer ofte svulst oppførsel [32]. Her kan vi ikke vurdere den sannsynlige tilstedeværelsen av en side befolkningen med forhøyet MDR aktivitet (
V
max), som kan utøve bare et mindre bidrag til den totale fordelingen av MDR aktivitet i hele befolkningen.
for å sammenligne oppløsningsevne av befolkningen og encellede kinetikk tilnærminger, gjennomførte vi en parallell analyse av de samme rådata som bruker begge metodene. Figur 4D viser MDR kinetiske parametre i 4C og 2C stater, fastsatt med de to tilnærmingene. Den encellede avledet 4C /2c prosenter av
V
max og
V
max /
K
M var høyere enn de som oppnås fra folkemidlings beregninger, og bare den encellede verdiene var signifikant forskjellig fra enhet, noe som tyder på en høyere oppløsningsevne for den encellede tilnærming.
Diskusjoner
de mange narkotika utvalgte resistente celletyper mye brukt i MDR studier har en tendens til å få en større-enn fysiologisk nivå av motstand, og vil trolig bli regulert i varierende moter [33], noe som gjør deres relevans for MDR fungerer in vivo gjenstand for debatt [34], [35]. Derfor, i dette arbeidet, studerte vi det fysiologisk forekommende indre multimedikamentresistens, som bestemmer medikamentseleksjon og resultatet for den første runden av kjemoterapi.
Flertallet av cellulære prosesser som moduleres av cellens progresjon gjennom cellesyklusen [ ,,,0],36], og man kan forvente at den iboende aktivitet av MDR transport i kreftceller er ikke et unntak. Få studier, hvor dette problemet ble adressert, regnes som uttrykk for bestemte ABC transportører i ulike faser av cellesyklus [2], [4], [5]. På samme tid, ble det lagt merke til at utbredte målinger av MDR-genekspresjon i tumorprøver var ikke alltid klinisk effektive fordi de ikke nødvendigvis gi informasjon om den funksjonelle aktiviteten til medikamentet efflukspumper [6], [37]. Kontroversielle kliniske resultatene på korrelasjonen mellom chemoresistance og ekspresjonen av ABC-transportører [38], [39] er sannsynlig å reflektere bidrag av faktorer andre enn transporter ekspresjon, for å bestemme MDR-aktivitet. Spesielt er det progresjon av celler gjennom cellesyklusen ledsaget av endringer i mange parametere (celleenergitilstand, fysisk tilstand av plasmamembranen, og nivåer av kofaktorer), kan det potensielt påvirke de kinetiske parameterne for MDR transportører. Vi antok at intensiteten av medikament dyseutstrømningen er det mest relevante indikator på et celler chemoresistance kapasitet og reflekterer både MDR pumpe ekspresjon og molekyl katalytisk aktivitet i sin helhet. Den detekterte her MDR transport av MRP-type bare i MCF-7-celler stemmer overens med iboende ekspresjon av MRP1 proteiner og en mangel på proteiner MDR1 rapportert tidligere (24).
Noen funksjonelt rettede studier ble utført som tidligere hadde ansatt en indirekte, semikvantitativ vurdering av MDR effektivitet og foreslo aktivering av MDR transport i S og G2 /M faser i leukemiceller [40]. Her har vi brukt en streng kvantitativ metode for å studere cellesyklus-relaterte MDR modulasjon.
I løpet av det siste tiåret, en neoadjuvant terapeutisk tilnærming, med sikte på en reduksjon i tumormasse som å legge til rette for videre behandling, er å finne økende bruk. I lys av denne tilnærming, chemoresistance av hoved populasjon av tumorceller sammen med den for tumorceller å initiere, av avgjørende betydning. Således, i dette arbeidet har vi studert hele populasjonen av MCF-7-celler.
Anvendelse av enkelt-celle tilnærming til 2c og 4C subpopulasjoner av klonal brystcancerceller viste en økning i de midlere verdier av både MDR-aktivitet og effektivitet i 4N celler; Dette gir den første kvantitative kinetiske bevis for endringer i MDR transport i løpet av cellesyklusprogresjonen. MDR-aktivering i 4N cellene var enda mer uttalt når kjennetegnet ved modal (i stedet for midlere) verdier av MDR parametre innenfor subpopulasjoner (Fig. 4C). Karakteriseringen av MDR i de mest tallrike celletype i en tumor vil være viktig i det prognose av tumoren umiddelbare reaksjon på kjemoterapi, som spiller rolle i basal neoadjuvant terapeutisk tilnærming. Undersøkelse av stammen lignende subpopulasjon av kreftceller vil være nødvendig for å forstå hvis økningen i langvarig effektivitet av cellesyklus-selektive kjemoterapi kan forventes.
Fordelene ved den encellede kinetikk tilnærming for studier av den unimodale cellepopulasjoner som brukes i våre eksperimenter, ble testet ved å sammenligne resultater fra encellede og populasjonen (fig. 1) analyser av de samme datasettene (fig. 4D). De befolkningskinetiske parametre (
V
max og
V
max /
K
M) hentet fra encellede tilnærming vokste betydelig på celler «overgang fra 2c til den 4c tilstand. Samtidig er disse parameterne som oppnås fra populasjonen tilnærmingen forble nesten uendret ved en slik overgang.
fleste svulster antas å stamme fra en enkelt celle, men multiple kloner blir typisk valgt i løpet av tumorigenese og oppfattes ved avanserte stadier . Følgelig er virkelige tumorvev, forventes å være mer heterogene enn en enkelt klon dyrket. Som et resultat av befolkningen tilnærming, som gir feil for et enkelt klon dyrket, vil føre til enda større feil for virkelige tumorer. Følgelig vil dra nytte av å bruke encellede tilnærming bli enda større hvis real tumorvev er analysert.
Når encellede metoden anvendes på reelle tumorvev, den analyserte cellepopulasjon kan inneholde celler fra forskjellige kloner. Mens den encellede tilnærming vil riktig bestemme kinetiske parametere som beskriver den analyserte populasjonen, bør tolkningen av resultatene alltid gjøres forsiktig. For eksempel, hvis den encellede tilnærmingen viser at MDR-utstrømning korrelerer med cellesyklusen for en blanding av kloner, kan vi konkludere med stor sikkerhet for at alle klonene oppfører seg på en lignende måte med hensyn til MDR effluks. Hvis imidlertid ingen korrelasjon blir funnet, to tolkninger er mulige: (i) MDR ikke korrelert med cellesyklusen eller (ii) MDR henger sammen forskjellig for forskjellige kloner og de forskjellige sammenhenger kansellere hverandre når en blanding av kloner blir trukket sammen. For å finne det rette svaret, ville man trenger for å gjennomføre omfattende tilleggsundersøkelser på MDR kinetikk i individuelle kloner. Vi tror at å sammenligne ulike kultur kloner bør være neste skritt i et forsøk på å finne ut om ulike kloner innenfor samme svulst variere med hensyn til MDR-cellesyklus korrelasjon. Mens være veldig tungvint med en vanlig mikroskop, kan en slik studie være fullt mulig hvis en automatisert bilde cytometri brukes.
eksperimentelt funnet bred variasjon av Michaelis-Menten parametre i enkeltceller er i samsvar med noen rapporter hvor encellede Michaelis parametre ble behandlet [41]. En av grunnene for denne variasjon kan være eksistensen av to former av transportøren, med hver har unike egenskaper, [42], [43].
Det ble vist at mange celletyper arrestert i cellesyklusen [ ,,,0],44], inkludert de arrestert i G2-fasen [3], [45] kan demonstrere en forhøyet resistens mot anticancer behandling som vanligvis skyldes moduleringen av apoptotiske og mitotiske mekanismer. Konseptet med cellesyklus-mediert medikamentresistens er avledet fra disse studiene tar sikte på å forstå og å optimalisere cellesyklus-baserte interaksjoner [3]. Våre data tyder på at variasjonen i multilegemiddeltransportaktivitet kan sterkt bidra til cellesyklus-relaterte modulering av chemoresistance.
Potential oversettelse av vår eksperimentell tilnærming til klinisk praksis vil kreve ytterligere omfattende arbeid, spesielt, studerer relasjoner mellom bestemte ABC transportører og cytostatika. Siden en kan forvente at heterogeniteten av tumorvev er høyere enn for cellelinjer, ville den encellede metode være spesielt fordelaktig i dette tilfellet.
tilstedeværelse og aktivitet av MDR-transportører i kliniske prøver er ansett å være en verdifull prognostisk indikator for mange former for kreft [8], [46].
