Abstract
Selenoproteins mediere mye av de kreftforebyggende egenskaper av de essensielle næringsstoffer selen, men noen av disse proteiner er blitt vist å også ha kreftfrembringende effekt. Vi undersøkte bidragene fra de 15kDa selenoprotein (Sep15) og tioredoksinreduktase 1 (TR1) til kreftutvikling. Målrettet nedregulering av enten genet inhiberes forankringsavhengige og forankrings-uavhengig vekst og dannelse av eksperimentelle metastaser i mus colon carcinoma CT26 celler. Overraskende, kombinert mangel av Sep15 og TR1 reversert anti-kreft effekt observert med nedregulering av hver enkelt gen. Vi fant at inflammasjonsrelaterte gener som reguleres av Stat-1, spesielt interferon-y-regulert guanylat-bindende proteiner, ble sterkt forhøyet i Sep15-mangelfull, men ikke i TR1-manglende celler. Interessant, komponenter av Wnt /β-catenin signalveien var oppregulert i celler som mangler både TR1 og Sep15. Disse resultatene tyder på at Sep15 og TR1 delta i interfererende regulatoriske reaksjonsveier i tykktarmskreftceller. Tatt i betraktning de variable uttrykk nivåer av Sep15 og TR1 innenfor den menneskelige befolkning, våre resultater gir innsikt i nye roller selenoproteins i kreft
Citation. Tsuji PA, Carlson BA, Yoo MH, Naranjo-Suarez S, Xu XM, Han Y, et al. (2015) The 15kDa Selenoprotein og tioredoksinreduktase en fremme tykktarmskreft med ulike veier. PLoS ONE 10 (4): e0124487. doi: 10,1371 /journal.pone.0124487
Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 30 desember 2014; Godkjent: 03.03.2015; Publisert: 17 april 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet: Relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Microarray data er tilgjengelige gjennom Gene Expression Omnibus database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; tiltredelse # GSE55488)
Finansiering:. Finansiert av Towson University Fisher College of Science and Mathematics (Velsignet Chair, PAT), National Cancer Institute utført støtte, National Cancer Institute Cancer Prevention Fellowship Program (PAT), og National Institutes of Health tilskudd (CA080946, GM065204 til VNG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er fortsatt den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall [1]. Supplemental kosten selen har blitt rapportert å redusere forekomsten og dødeligheten av kreft i tykktarmen hos mennesker [2] og dyr med suboptimale nivåer selen [3]. Disse kreft-forebyggende egenskaper er først og fremst formidlet gjennom selenoproteins [4], noe som tyder på en underliggende genetisk disposisjon for tykktarmskreft. Tre selenoproteins har vært innblandet i både forebygging og fremming av kreft: den 15kDa selenoprotein (Sep15) [5-7], tioredoksinreduktase 1 (Txnrd1, TR1) [8], og glutationperoksidase 2 (GPx2) [9]. Videre studier av enkeltnukleotidpolymorfi avslørte en sammenslutning av både TR1 og selenoprotein P (SEPP1) med avansert colorectal adenomer hos mennesker [10]. Vi har tidligere undersøkt de to personlighetene til de to første selenoproteins [7,8,11,12], og her har vi ytterligere undersøkt deres interaksjoner i sin regulering av tykktarmskreft. Sep15 og TR1 hører til tiol-oksidoreduktase gruppe av selenoproteins [13]. TR1 er en stor redoks-regulator i pattedyrceller, og er også involvert i celle-proliferasjon, angiogenese, transkripsjon og DNA-reparasjon [14,15]. Den fysiologiske funksjon av Sep15 fremdeles dårlig forstått, men det kan være involvert i omleiring av disulfidbindinger eller tjene som et reduktase for feil som dannes disulfidbindinger i misfoldede glykoproteiner bundet til UDP-glukose: glykoprotein-glukosyl-transferase (UGGT) [16].
Vi har tidligere vist at tap av TR1 reverseres de ondartede egenskaper LLC1 muselungekreftceller [17]. Tilsvarende tap av Sep15 reverseres kreft fenotypen til murine [18] og humane tarmkreftceller [19]. Fordi begge proteiner er selenoproteins, er det mulig at de har additive eller synergistiske effekter. Sep15 blir uttrykt forskjellig i noen humane cancere [20,21], og TR1 er oppregulert i mange krefttyper [14]. Heri, undersøkte vi sammenhengen mellom Sep15 og TR1 i mus CT26 tykktarm adenokarcinomceller med hensyn til roller disse selenoproteins i tykktarm tumorigenesis. Interessant, fjernelse av disse to selenoproteins syntes å oppnå reversering av kreft fenotyper gjennom svært ulike veier, og uventet ble en kombinert mangel på Sep15 og TR1 kompenseres ved oppregulering av komponenter i Wnt /β-catenin signalveien.
Materialer og metoder
tiltredelses Codes
Microarray data er tilgjengelige gjennom Gene Expression Omnibus database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; tiltredelse # GSE55488).
Material
Murine CT26 tykktarm kreft celler ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA), og bare lave passasje tall ble brukt. Den pSilencer2.0 U6-Hygro-vektoren var fra Ambion (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL), føtalt bovint serum, fosfat-bufret saltvann (PBS), RPMI 1640, hygromycin B, NuPAGE 4-12% polyakrylamidgeler, SeeBlue plus2 protein markører, litium-dodecylsulfat (LDS) prøvebuffer, Lipofectamine2000, polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner, og TRIzol reagens fra Invitrogen (Carlsbad, CA), og 5,5′-ditiobis (2-nitrobenzosyre) og aurothioglucose fra Sigma-Aldrich ( St. Louis, MO). Antistoffer mot Sep15 og TR1 ble generert i kaniner ved Epitomics /Abcam (Cambridge, MA) ved hjelp av et syntetisk peptid (Sep15) eller rekombinant protein (TR1) som antigener, og ble validert i vårt laboratorium for dette selskapet. Kanin-anti-alfa fetoprotein (AFP) antistoff og pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff mot geit ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA), og mus anti-fosfo-β-catenin primære antistoff fra Cell Signaling (Danvers, MA). Antistoffer mot β-actin, tubulin-α, guanylat-bindende protein-1 (GBP-1), STAT1 (p84 /P91), og interferon-induserte protein 44 (Ifi44) var fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas). Pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff mot kanin var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SuperSignal West Dura substrat og pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff mot mus var fra Pierce (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL), og iScript cDNA syntese kit og SYBRGreen Supermix fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Real-time RT-PCR primere var fra Sigma-Genosys (St. Louis, MO), edel agar fra Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ), og svart tusj fra Winsor Newton. Andre reagenser var av høyeste kommersielt tilgjengelige kvalitet.
Målrettet nedregulering av Sep15, TR1, og TR1 /Sep15
pU6-m3 vektor brukes for å generere kort hårnål RNA (shRNA) mål, og stabil transfeksjon av shSep15 og shTR1 CT26 tykktarmskreftceller ble konstruert som beskrevet [17,18,22], og bare lav passasje tall ble anvendt for forsøkene. Sep15- og TR1-mangelfull, og de tilsvarende paren CT26 celler ble transfektert med identiske vektorer (se [15,17] for detaljer), bortsett fra shRNAs. Vi undersøkte to shRNA oligonukleotid-sekvenser, og flere uavhengige cellekloner av disse sekvenser resulterte i meget lignende reduksjoner i både mRNA og proteinnivåer. De to shRNA oligonukleotidsekvenser for Sep15 og TR1 er blitt vist tidligere å resultere i tilsvarende reversering av kreft fenotype [17,18]. Den dobbeltknockdown celler innlemmet begge validerte konstruksjoner. Celler med dobbeltknockdown av Sep15 og TR1 sammen ble fremstilt som beskrevet [22].
Cell kultur og cellevekstanalyser
Mus tykktarmskreft CT26 celler dyrket i fullstendig vekstmedium (RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% natriumpyruvat) i en fuktet atmosfære (5% CO
2, 37 ° C). -Celler ble stabilt transfektert med shSep15, shTR1, en kombinasjon av de shTR1 og shSep15 konstruksjoner, eller i det åpne pU6-m3 vektor (kontroll) ved bruk av Lipofectamine2000 ved å velge celler i nærvær av 500 ug /ml hygromycin B. Celleveksten ble overvåket ved poding 1 x 10
5-celler /brønn i seks-brønns plater i fullstendig vekstmedium og telle celler for fire dager.
RNA analyse
Total RNA ble ekstrahert fra celler med TRIzol. cDNA ble syntetisert med iScript og 1,5 mikrogram av total RNA i henhold til produsentens instruksjoner. For kvantitativ real-time RT-PCR (qPCR), ble 1,5 mL cDNA lagt til 20-mL reaksjoner med DNA Engine Opticon2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Primerne for qPCR er vist i tabell S1. mRNA-nivåene av selenoproteins ble beregnet i forhold til ekspresjon av glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
), anvendt som en intern kontroll.
Western blotting analyser
Proteinprøver ekstraheres fra de fire stabilt transfekterte-CT26 cellelinjer ble elektroforert på NuPAGE 4-12% polyakrylamidgeler, etterfulgt av overføring til PVDF-membraner. Membranene ble inkubert med primære antistoffer (1: 200 til 1: 2000) over natt ved 4 ° C. Pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1: 10.000). Ble påført, membranene inkubert i kjemiluminescerende substrat, og eksponert for røntgenfilm
tioredoksinreduktase (TR) aktivitet
TR aktivitet var bestemt spektrofotometrisk [23], basert på den modifiserte metoden til Holmgren og Björnstedt [24]. I korthet ble TR-aktivitet bestemt som forskjellen mellom total TR aktivitet og tidsavhengig økning i absorbans ved 412 nm i nærvær av inhibitor TR, aurothioglucose. En aktivitetsenhet ble definert som 1,0 umol 5-tio-2-nitrobenzosyre som dannes /min /mg protein. Proteinkonsentrasjoner ble målt med bicinchoninic syre.
Soft agar assay
Anchorage-uavhengig vekst ble undersøkt av myke agar analyser [17,18]. I motsetning til de fleste celler med en normal fenotype, mange kreftceller er i stand til å vokse i bløt agar unanchored. Omtrent 3.000 celler av hver stabilt-transfektert CT26 cellelinje ble suspendert i 3 ml 0,35% edel agar i fullstendig RPMI 1640 og spredd på 60-mm skåler maskert med en basal lag med 3 ml 0,7% agar i edel media. Celler ble inkubert ved 37 ° C i tre uker, og komplett vekstmedium ble påført på serviset hver tredje dag. Koloniene ble visualisert ved farging natten med
p
-iodonitrotetrazolium fiolett, skannet og telles.
Cell syklus analyse
CT26 celler ble dyrket i komplett medium til 50% samløpet, vasket to ganger med sterilt PBS, og opprettholdt i serumfritt medium i 48 timer for å indusere G0-G1 cellesyklus synkronisering. Cellene ble deretter inkubert med fullstendig vekstmedium for 0, 6, 24 eller 48 timer, vasket to ganger med PBS, trypsinert og suspendert i PBS (1 x 10
7-2 x 10
7 celler /ml) i is. Iskald 70% etanol ble tilsatt gradvis, og cellene ble fiksert over natten. Cellene ble sentrifugert, resuspendert i RNase (100 enheter) og inkubert ved 37 ° C i 20 min. Suspensjonen ble farget med propidiumjodid i mørke ved 4 ° C over natten, filtrert gjennom en 50 pm sikt, og ervervet med et FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble analysert ved ModFitLT versjon 3.0 (Verity, Topsham, ME).
Dyrestudier
Denne undersøkelsen ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av NCI-Bethesda Animal Care og bruk Committee (tillatelse nummer for denne studien er LCP-005). Dannelse av eksperimentelle lungemetastaser ved
i
.
v
. injeksjon av plasmid-transfektert kontroll ble shSep15, shTR1, eller shTR1 /shSep15 celler undersøkt i BALB /c-mus (Jackson Laboratories), som har den samme genetisk bakgrunn som CT26 adenokarsinomceller. Dyrene ble gitt fri tilgang til vann og ble overvåket nøye for kliniske tegn på dårlig helse gjennom hele studien. Seks uker gamle BALB /c mus ble opprettholdt på et Torula gjær basert diett supplert med tilstrekkelig selen (0,1 mikrogram selen /g diett) som natrium selenitt (Harlan-Teklad, Indianapolis, IN). Etter tre uker, 5 x 10
5 CT26 celler i 200 ul PBS (
n
= 10 hver for plasmid-transfektert kontroller, shSep15, shTR1, eller shTR1 /shSep15 celler) ble injisert i halevenen . Ble dyrene avlivet, og lungene ble undersøkt 12 dager etter injeksjon. Tre milliliter 15% India blekk /PBS-oppløsning ble injisert inn i lungene gjennom luftrøret. Lunge-vev ble skåret ut og «bleket» med Fekete løsning (60% etanol, 3,2% formaldehyd og 0,75 mol /l eddiksyre) i 48 timer. Pulmonære lesjoner på overflaten av hver lapp ble tellet med et disseksjonsmikroskop. Lungene med . 250 lesjoner ble tildelt en verdi av 250, som det er naturlig vanskelig å sikkert telle mer enn 250 lesjoner /lunge [18]
Microarray analyse
Totalt mRNA ble isolert fra plasmid-transfektert kontroll, shSep15, shTR1 og shTR1 /shSep15 CT26 celler. Microarray analyse ble utført på Affymetrix Mouse 430_2.0A genet chips. Fire arrays ble analysert fra fire forskjellige mRNA prøver per konstruere. Robust Multi-Array analyse algoritme ble brukt til bakgrunn og støy korreksjon i omdanning av sonden nivå til genuttrykk data. Kontroller og celler med målrettet nedregulering av Sep15, TR1 eller TR1 /Sep15 ble sammenlignet med ANOVA. Gener som var signifikant forskjellig fra plasmid-transfektert kontrollceller (
P
0,05) ble utsatt for funksjonelt gen analyse av Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA, versjon 7.5), som oppdager nettverk av genuttrykk endringer i henhold til funksjonelle biologiske prosesser snarere enn å fokusere utelukkende på de mer dramatiske endringer i uttrykket av noen få utvalgte gener. Tidligere publisert, og offentlig tilgjengelig, ble microarray data fra en studie med Sep15 knockout mus vist for sammenligningsformål [7].
Statistiske analyser
Datapresentert som gjennomsnitt ± SE ble analysert ved en veis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel-sammenligning
post-hoc
test med GraphPad Prism (versjon 5, La Jolla, CA). Signifikansnivået ble satt til α = 0.05, og statistisk signifikante endringer ble antydet i figurene som følger:
* P
0,05,
** P
0,01,
*** P
0,001, sammenlignet med kontrollen. CellMiner er NCI-60 Analysis Tool, som integrerer molekylære datasett av 60 humane kreftcellelinjer som ofte brukes for farmakologisk screening og komparative molekylære analyser, ble brukt til å identifisere gener signifikant korrelert med Sep15 uttrykk (https://discover.nci.nih.gov/cellminer, database versjon 1.4) basert på Pearsons korrelasjonskoeffisient med en bestandsstørrelse på 60, r = 0,254, og
P
0,05 uten multiple sammenligninger korreksjon. Gene avskrift uttrykk mønstre ble også sammenlignet. CellMiner baser transkripsjon intensitetsnivåer på målinger fra fem mikromatriser (Affymetrix HG-U95, HG-U133, HG-U133 pluss 2,0, og HuEx 1.0 og Agilent Whole Human Genome Microarray) som beskrevet [25].
resultater
Individ og samtidig mangel på TR1 og Sep15
mus tykktarmskreft CT26 celler ble stabilt transfektert med shSep15, shTR1, shTR1 /shSep15, eller tilsvarende pU6-M3 (tom vektor) – kontroll konstruksjoner. Vi brukte to shRNA oligonukleotider, og flere uavhengige cellekloner ble valgt for analyse for å utelukke off-target effekter på grunn av konstruksjoner eller transfeksjon prosessen, som publisert [17,18]. qPCR og Western blotting viste at Sep15 mRNA (figur 1A, øvre panel) og proteinnivåer (figur 1A, nedre panel) ble effektivt ( 90%) ble redusert i celler transfektert med shSep15 eller shTR1 /shSep15. qPCR, Western blotting, og katalytiske aktivitetsanalyser viste at TR1 mRNA (figur 1B, øvre panel) og protein ekspresjon (fig 1B, nedre panel), samt katalytisk aktivitet (figur 1C) ble redusert med 90% i shTR1 og shTR1 /shSep15 celler. MRNA uttrykk for glutation peroksidase 1 (GPx1) og 2 (GPx2) ble ikke vesentlig endret, og selenoprotein M (Selm) ble bare beskjedent økt i shSep15 (
P
0,05) og shTR1 /Sep15 celler (
P
0,05), som forventet (S1 figur)
Celler ble stabilt transfektert med pU6-m3 kontroll, shSep15, shTR1 eller shTR1 /shSep15 (som angitt).. (A) Uttrykk for Sep15 ved real-time RT-PCR (øvre panel) og Western blotting (nedre panel). (B) Uttrykk for TR1 ved real-time RT-PCR (øvre panel) og Western blotting (nedre panel). (C) tioredoksinreduktase aktivitet. Kolonner, mener (
n
= 3-6); barer, SE; (
* P
0,05,
** P
0,01, sammenlignet med kontroll).
shSep15 eller shTR1 hemme celledeling og utvikling av eksperimentell metastaser
Anchorage-avhengige spredning av både shSep15 og shTR1 celler ble betydelig redusert (
P
0,001) (figur 2A). I hvert tilfelle var det 60% færre celler på dag 4 sammenlignet med kontroller. Overraskende, vekstmønster av shTR1 /shSep15 cellene var lik for å kontrollere celler. shSep15 og shTR1-transfekterte CT26 celler dannet vesentlig (
P
0.001) færre kolonier enn kontrollcellene i forankringsuavhengig vekst analyser (Fig 2B). I kontrast, gjorde TR1 /Sep15 knockdown ikke påvirke koloni vekst i myk agar.
(A) en vekstrate på shSep15, shTR1 og shTR1 /Sep15 celler sammenlignet med kontroller (
n
= 6) . (B) Anchorage uavhengig vekst i myk agar av shSep15, shTR1 og shTR1 /Sep15 celler sammenlignet med kontroller (
n
= 4-8). (C) Dannelse av eksperimentelle lungemetastaser etter intravenøs injeksjon av 5 × 10
5 celler (kontroll, shSep15, shTR1 eller shTR1 /shSep15) i BALB /c mus (
n
= 10 /konstruksjon). (
*** P
0,001, sammenlignet med kontroll).
Kontrollceller dannet et stort antall (188,6 ± 32,0) av eksperimentelle lungemetastaser i BALB /c mus ( fig 2C), som forventet. Som også tidligere vist [18], målrettet reduksjon av Sep15 signifikant (
P
0,001) hemmet dannelsen av slike lungemetastaser (0,5 ± 0,2). Tilsvarende shTR1 celler dannes færre eksperimentelle metastaser (2 ± 0,4) sammenlignet med kontroller (
P
0,001). Mus injisert med shTR1 /shSep15 celler utviklet færre eksperimentelle metastaser enn kontrollene (100,4 ± 14,1;
P
0,001), men mer enn 50 ganger mer (
P
0,01) sammenlignet med de injisert med enkeltknockdown celler.
shTR1 /shSep15 reverserer cellesyklus fenotyper observert i enkeltknockdown celler
de mest slående cellesyklus endringer ble observert i shSep15 celler (figur 3A-3D), og enig med våre tidligere publiserte observasjoner, at de mest signifikante forskjeller mellom shSep15 og kontrollceller dukket opp rundt 24 h siste utgivelse fra serum sult [18]. shSep15 celler hadde en betydelig høyere prosentandel av befolkningen i G2 /M-fase (27,8 ± 0,8%) enn kontrollcellene (11,5 ± 2,1%;
P
0,001), og en mindre andel i S- fase (25,1 ± 0,9% vs. 42,3 ± 1,9%), i likhet med tidligere observasjoner [18]. Men shTR1 og shTR1 /shSep15 celler hadde færre celler i G2 /M-fase (15,6 ± 1,2% og 17,7 ± 0,7%, henholdsvis) sammenlignet med shSep15 celler (
P
0,001). shTR1 celler, som observert i fibroblast-avledede DT-celler tidligere [15], manifestert defekt progresjon i S-fase, synlig som en økt prosentandel av cellepopulasjonen ved 6 og 48 timer. CyclinB1 (Ccnb1) mRNA nivåer var ikke signifikant forskjellig (figur 3E), men mRNA nivåer av CyclinB1-samspill-protein-1 (Ccnbip1) ble sterkt forhøyet i shTR1 og shSep15 celler (
P
0,01), men ikke i shTR1 /shSep15 celler, sammenlignet med kontroller, respektivt (figur 3F)
Prosent av cellene i hver cellesyklus fase som bestemt ved FACS-analyse ved (A) 0 t.; (B) i 6 timer; (C) 24 timer; og (D) 48 timer etter frigjøring fra celle synkronisering. mRNA uttrykk for (E) CyclinB1 (
Ccnb1
), og (F) CyclinB1 Samhandle-Protein-en (
Ccnb1ip1
), som bestemmes av real-time RT-PCR. Kolonner, mener (
n
= 3-9); barer, SE; (
* P
0,05,
** P
0,01,
*** P
0,001).
genuttrykk analyser identifisere interferon-γ- og wnt /β-catenin-regulert trasé i shSep15 og shTR1 /shSep15 celler henholdsvis
For å belyse de signalveier som er berørt av Sep15- og TR1-mangel i tykktarm kreft celler, og reversering av disse effektene i dobbeltrom knockdown celler, ble global genekspresjon analysert ved hjelp av mikromatriser (N = 4 /konstruksjon). De tjue mest vesentlig endrede genet signaler er oppført i S2 tabell. Utvalgte gener ble undersøkt ved qPCR forhold til uttrykk for en intern kontroll,
GAPDH
, å validere microarray resultater.
De fleste sterkt oppregulert genet signaler i shSep15 celler ble interferon-induced- protein-44 (
Ifi44
), ubiquitin-spesifikk-peptidase-18 (
Usp18
), immunitet relaterte-GTPase familie M-medlem-2 (
Irgm2
), interferon-regulerende-faktor-7 (
Irf7
), interferon-γ-indusert-GTPase
(Igtp
), veldig stort interferon-induserbar-GTPase
(Gvin1
), og guanylate-bindende-proteiner
Gbp-en
,
-2 Hotell og
-6
. Betydelig økt mRNA uttrykk for
Ifi44 product: (
P
0,001, figur 4A, øvre panel),
Irf7 product: (
P
0,001, fig 4B), og
Usp18 product: (
P
0,05, fig 4C) i shSep15 celler sammenlignet med kontrollene ble validert med qPCR. Protein uttrykk nivåer av Ifi44 (figur 4A, nedre panel), ble noe økt i shSep15 celler. De mRNA nivåer av
Gbp-6
(
P
0,05; fig 4D) og interferon-γ (IFNy) (
P
0,05; Fig 4E) var signifikant høyere i shSep15 forhold til shTR1 /shSep15 celler. Nivåene av GBP-1 mRNA ble tidligere rapportert å være svært oppregulert i Sep15 knockout mus [7]. I samsvar med disse observasjonene, fant vi at Gbp-1 mRNA (fig 4F, øvre panel) og proteinnivåer (Fig 4F, nedre panel) ble betydelig økt utelukkende i shSep15 celler. Oppfinnsomhet Pathway Analyser (IPA) indikerte at inflammasjonsrelaterte gener oppregulert i shSep15 cellene delte en felles node i
Stat-en product: (S3A figur), og inkludert
Gbp-to plakater (31,1 fold),
Gbp-6 plakater (30,1 ganger),
NMI plakater (2,8 ganger),
Irgm2 plakater (20,7 ganger), og
Gbp -1 product: (14,3 ganger, inkludert i «GBP-2 * «). Andre signifikant oppregulert
Stat-1
-associated gener inkludert
Usp18 plakater (65,1 ganger),
Irf7 plakater (9,9 ganger) og
Irf9
(3,6 ganger).
Stat-en
mRNA ble kvantifisert med qPCR og funnet å være signifikant bare økt i shSep15 celler sammenlignet med kontroller (
P
0,01, Fig 4G, øvre panel), men protein nivåer av ufosforylerte stat-en uendret (figur 4G, nedre panel). Stat-1 antas å fremme aktivering av forskjellige caspaser, og mRNA-nivåer av kaspase 6 (figur 4H) og caspase 12 (fig 4I) signifikant øket bare i shSep15-celler (
P
0,05). Støtte dette mønsteret av involvering av interferon-γ og Sep15 er flere sammenligninger med våre tidligere publiserte microarray data [7], som viste en beskjeden, men signifikant (
P
0,05) økte mRNA ekspresjon av interferon-γ- regulert Stat-1, Stat-5A, IRF-2, og IRF-3, i Sep15 knockout mus (N = 4) sammenlignet med kull mate-kontroller (N = 4). Genet mest signifikant nedregulert i shSep15 celler var alfaføtoprotein (
Afp
). Interessant, mRNA nivåer av
Afp
ble økt 1,5 ganger i shTR1 /shSep15 celler som bestemmes av qPCR (figur 4J), men protein nivåer forble uendret (S2A figur).
Expression of ( A) Ifi44 mRNA (øvre panel) og protein (nedre panel); (B) IRF-7 mRNA; (C) Usp18 mRNA; (D) GBP-6 mRNA; (E) IFNy-mRNA; (F) GBP-1 mRNA (øvre panel) og protein (nedre panel); (G) Stat-1 mRNA (øvre panel) og protein (nedre panel); (H), Casp6 mRNA; (I) Casp12 mRNA; og (J) Afp mRNA. Uttrykk av mRNA i kontroll, shSep15, shTR1, og shTR1 /Sep15 celler ble bestemt ved real-time RT-PCR, og uttrykt i forhold til
GAPDH
. Kolonner, mener (
n
= 3-6); barer, SE; (
* P
0,05,
** P
0,01,
*** P
0,001). Protein ble bestemt ved Western blotting, og uttrykt i forhold til p-aktin eller α-tubulin, som angitt.
I microarray analyser, gener med vesentlig endret uttrykk i shTR1 celler sammenlignet med kontroller (S2 Tabell) inkludert chemokine reseptor-type-1 (
CCR1
, 9,0 ganger), som også ble økt i shTR1 /shSep15 celler (5,1 ganger), og den tverrstripet fortrinnsvis uttrykt-genet (
Speg
5,8-fold), som er kjent for å inhibere celleproliferering [26]. Påfølgende qPCR analyser viste en om to ganger økning i Speg mRNA uttrykk i shTR1 celler sammenlignet med kontroller (
P
= 0,09, figur 5A), og bare signifikante økninger i CCR1 mRNA uttrykk i shTR1 /Sep15 celler sammenlignet med kontroller (
P
0,001, figur 5B). De mRNA nivåer i cellesyklusen regulator
Ccnb1ip1
, som også tidligere er rapportert som dramatisk økt i shSep15 CT26 celler [18], ble også økt i shTR1 celler (
P
0,01, fig 3F). Usp18 mRNA uttrykk, som microarray analyser identifisert som 16 ganger høyere (
P
= 0,09) i shTR1 celler, ble også betydelig økt (
P
0,05) som godkjent av qPCR (Fig 4C). Vesentlige genet endringer i shTR1 celler inkludert de som er involvert i DNA-reparasjon, redox regulering, ATP-bindende kassett transport, ubiquitinering og kreftrelaterte pathways
mRNA nivåer av (A) Speg.; (B) CCR1; og (C) Tnc; og (D) APC i kontroll, shSep15, shTR1, og shTR1 /Sep15 celler, som bestemmes av real-time RT-PCR, og uttrykt i forhold til
GAPDH
. Kolonner, mener (
n
= 3-6); barer, SE; (
** P
0,01,
*** P
0,001).
Kombinert nedregulering av Sep15 og TR1 resulterte i ganske uventet Endringer. Microarray-analyser viste at den mest up-regulerte gener som utelukkende ble endret i shTR1 /shSep15 celler (S2 tabell) sammenlignet med kontroller ble tenascin (
Tnc
, 9,0 ganger) og mitogen-regulert prolaktin-familien -2 underfamilie-c-medlem-2 (
Prl2c2
, 7,5 ganger). Betydelig oppregulering av tenascin mRNA (
P
0,01) ble senere verifisert av qPCR (figur 5C). IPA ble utført for 984 genet signaler som var signifikant forskjellig mellom shTR1 /shSep15 og kontroller, men var ikke annerledes i begge mono-knockdown celler versus kontroller. To nettverk som er involvert i
Apc /Wnt /β-catenin
trasé ble identifisert (S3b og S3C figur), som kan kompensere for kombinerte tap av Sep15 og TR1. Interessant, tenascin ble indirekte nettverk med
Wnt plakater (S3C fig). Expression nivåer av adenomatøs polypose coli-genet (
APC
, S3b figur) og negativ regulator av vingeløse-type (
Wnt
) gener,
Axin1
, var signifikant men bare beskjedent redusert (1,4 ganger, henholdsvis) i mikromatriseanalyser. Påfølgende qPCR ikke oppdage eventuelle forskjeller i
Apc
mRNA uttrykk blant konstruksjoner (Fig 5D). Annet
Wnt
-type gener (
e
.
g
.,
Wnt10a
) og β-catenin-samspill protein-1 (
Ctnnbip1
) var signifikant oppregulert (1,9 ganger og 1,6 ganger, henholdsvis) i mikromatriseanalyser. Men protein nivåer av fosforylert β-catenin selv, som analysert gjennom Western blotting, dukket uendret (S2B figur).
Sep15 uttrykket er negativt korrelert med Stat-1 /Stat-2 og Usp18 i NCI-60 celle linjer
i NCI-60 cellelinjer, CellMiner negativt korrelert (
P
0,05) mRNA uttrykk for Sep15, men ikke TR1, med Stat-2 (Pearsons koeffisient: -0,29) og med Usp18 (Pearsons koeffisient: -0,43), den nest høyeste oppregulert genet signal i celler som mangler Sep15. Sammenligning av cellelinje signaturer avslørte at de motsatte retninger av mRNA transkripsjon intensitetspoeng (z-score) for Sep15 og Stat-1 (figur 6) var spesielt signifikant (r = -0,65,
P
0,01) for humane kreftcellelinjer avledet fra sentralnervesystemet, leukemi og eggstokk-kreft. Stat-1 proteinnivåer i NCI-60 cellelinjer støttet negativ korrelasjon med Sep15 mRNA uttrykk (Fig 6).
motsatte retninger av transkripsjon intensitetspoeng (z-score) for Sep15 og statistikk-1 mRNA var svært signifikant (r = -0,646,
P
0,01) for menneskets sentralnervesystemet (CNS), leukemi og eggstokkreft cellelinjer. Mean sentrert gjennomsnitt protein aktivitetsmønstre for Stat-en (Stat-1_20 antistoff) signifikant korrelert (r = 0,661,
P
0,01). Med Stat-1 mRNA uttrykk
Diskusjoner
Vårt mål har vært å forstå rollene til de selenoproteins Sep15 og TR1 i kreft initiering og utvikling [8,11,17-19,27]. Den aktuelle studien utsatt uventede komplikasjoner og interaksjoner mellom disse to selenoproteins i sin regulering av tykktarmskreft. I lys av fordelene ved økt inntaket finnes i tykktarmskreft forebygging [28,29] og de kontroversielle resultater i den siste studie på mennesker velger [30], hvor ingen fordeler ble funnet, våre resultater er særlig relevant som kosttilskudd selen kreft -Prevantiv eiendommene er i hovedsak mediert gjennom selenoproteins [31].
selenoproteins Sep15 og TR1 har viktige roller i cellulære redoks-homeostase. Forskjellene mellom disse to systemene er klare fra
in vivo
studier. En fullstendig mangel på cytosolisk TR1 er embryo dødelig [12], mens en systemisk Sep15 mangel ikke medfører en åpenbar fenotype i andre enn dannelse av grå stær [32] mus. Målrettet nedregulering av disse to genene gir effektivt middel for å undersøke deres funksjon, regulering og vekselvirkninger. Våre resultater i mus kolon kreftcellene viser at forskjeller i cellesyklusregulering kan ha delvis bidratt til reversering av de observerte kreft fenotyper. Men den underliggende mekanismen få fram denne fenotype ser ut til å variere mellom celler som mangler Sep15 versus de som mangler TR1. Sep15 mangel ble tidligere funnet å hemme celleproliferasjon i mus [18] og humane tarmkreftceller [19], men ikke i muselungecancerceller [18]. I motsetning til dette mangel på TR1 betydelig redusert vekst av muselungecancerceller [17]. Tatt i betraktning de tilsvarende effekter av Sep15 og TR1 på kreft fenotype, ble mangel på både selenoproteins forventet å gi additiv eller synergistisk svar. (
P
0.05).
doi:10.1371/journal.pone.0124487.s005
(DOCX)
Acknowledgments
We
