Abstract
kreft stamceller (cscs) er en liten del av kreftceller som er ansvarlige for vedlikehold og progresjon av flere typer kreft. Isolasjon, forplantning, og differensiering av cscs i de riktige stammen nisjer eksponere de iboende vanskeligheter for videre studier. Her viser vi at indusert kreft som stamceller (iCLSCs) kan genereres ved
in vitro
onkogene manipulering av mus embryonale stamceller (mESCs) med veldefinerte onkogene elementer; SV40 LTG og H
ras
V12 ved hjelp av en mus stilk virus lang terminal gjenta (MSCV-LTR) -baserte retroviral system. De omprogrammeres mESCs med både onkogener ble karakterisert gjennom deres onkogene genekspresjon, styrking av spredning, og uhindret vedlikehold av stam egenskaper
in vitro Hotell og
in vivo
. I tillegg er disse transformerte celler resulterte i dannelsen av ondartede, umodne eggstokkene teratomas
i viv
o. For å kunne videreutvikle disse egenskapene til andre organer og arter, må mer forskning må gjøres for å fullt ut forstå rollen som en tumor- gunstig mikromiljøet. Vår nåværende studie har gitt en ny tilnærming til å generere indusert kreft som stamceller gjennom
in vitro
onkogene omprogrammering og vellykket igangorganspesifikk ondartet svulst formasjon i et orthotopic små dyr kreft modell.
Citation : Cho S, Park H, Jarboe EA, Peterson CM, Bae YH, Janát-Amsbury MM (2015) design og karakterisering av bioengineered Cancer-Like stamceller. PLoS ONE 10 (10): e0141172. doi: 10,1371 /journal.pone.0141172
Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, JAPAN
mottatt: 21 juli 2015; Godkjent: 03.10.2015; Publisert: 21 oktober 2015
Copyright: © 2015 Cho et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den hierarkiske teorien om organiseringen av kreft tyder på at bare en liten del av cellene er ansvarlig for initiering og videre vekst av kreft [1-3]. De små populasjoner av celler har blitt definert som kreft stamceller (cscs). Blant annet cscs utstillingen funksjoner som selvfornyelse og evne til differensiering i heterogene og tumorigene kreftceller [1, 4]. Putative cscs fra forskjellige tumorer, inkludert hjerne, bryst og eggstokk-kreft, ble isolert oppdatert basert på deres ekspresjon av spesifikke molekyler eller kombinasjoner av cellulære markører (f.eks CD133, CD44, ALDH) [5-9]. Den tumorigent potensialet til disse cellene er blitt vist i forskjellige xenograft studier med immun kompromittert mus [5, 6, 10]. Men ytterligere karakterisering av cscs «egenskaper og evner har vært hemmet av iboende vanskeligheter med å isolere rene cscs bestander, forplantning av disse isolerte cscs, og differensiering av cscs i de riktige stammen nisjer [11].
Normal fibroblast og bryst celler kan bli forvandlet til sine induserte kreftceller ved å
in vitro
omprogrammering gjennom eksogene innføring av genetiske alter ansvarlig for å øke lengden på telomerer (hTERT), som gir konstitutive spredning signaler (H
ras
V12), og hemmer vekst suppressor trasé som p53 og pRB av simian virus 40 (SV40) antigener [12, 13]. Langs de samme linjene
in vitro
omprogrammering, Scaffidi
et al
rapportert at somatiske celler har nok plastisitet å være nytt og skaffe CSC egenskaper gjennom
in vitro
onkogene introduksjon [ ,,,0],14]. Tallrike referanser, spesielt i studiet av hematologiske kreftformer, indikerte at cscs kan være avledet fra vev stammen, progenitor-celler, og til og med fra somatiske celler [10, 14-18]. Imidlertid har potensial til å
in vitro
reprograming av embryonale stamceller i cscs forble uklart.
Heri vi undersøkt om mus embryonale stamceller (mESCs) kan være vellykket omprogrammeres til indusert kreft som stamceller (iCLSCs) gjennom
in vitro
onkogene manipulasjon. I tillegg, ved å utsette iCLSCs til ulike spesifikke microenvironments
in vivo
, kunne vi observere potensialet i disse iCLSCs å generere stedsspesifikke iCLSC svulster i immun kompetente mus.
Materialer og metoder
Kjemi og Plasmider
følgende materialer ble hentet fra produsentene indikerte: (a) Fugene 6 (Promega, Madison, WI), (b) polybrene og FBS (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO), (c) Geltrex (Invitrogen, Carlsbad, California) (d) Mycozap pluss CL (Lonza, Allendale, NJ), (e) pBABE-H
ras
V12 (# 1768), pBabe- SV40 LTG (# 10891), pMSCV-GFP (# 33336), og pMSCV-RFP (# 33337) (Addgene, Cambridge, MA), (f) pVSV-G (Clontech, Mountain view, CA).
Cell Kultur
GP2-293 celler (Clontech) og deres derivater, og γ-bestrålte mus embryonale fibroblast (MEF) celler (Cyagen, Santa Clara, CA) ble opprettholdt i DMEM (ATCC, Manassas, VA ) supplementert med enten 10% eller 15% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich,), henholdsvis. Muse embryonale stamceller (mESCs) (C57BL /6 mus embryonale stamceller, # MUBES-01001, Cyagen) ble opprettholdt i Knockout DMEM (Invitrogen) supplert med 15% knockout serum erstatning (Invitrogen), 1% L-glutamin (Invitrogen) , 1% ikke-essensielle aminosyrer (Invitrogen), 0,1% beta-mercaptanol (Invitrogen), leukemi hemmende faktor (LIF, 10 ng /ml i kultur media; StemRD, Burlingame, California). Alle celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator med 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C.
Under Kloning av gener til pMSCV
For å utføre sub-kloning, H
ras
V12 og SV40 stor T antigenaktivitet (LTG) ble skilt fra pBABE-H
ras
V12 og pBABE-SV40 LTG ved enzymatisk fordøyelse med BamHI og EcoRI (NEB, Ipswich, MA), eller med BamHI (NEB), respektivt. Integrering av H
ras
V12 og SV40LTg inn enten pMSCV-GFP eller pMSCV-RFP ble utført ved ligering med T4-ligase (NEB) og produsert pMSCV-H
ras
V12-GFP og pMSCV -SV40 LTG-RFP. Integrering av innleggene ble bekreftet av både enzymatisk fordøyelse og DNA-sekvensering.
Generering av Retrovirus
For å generere retroviral supernatant, GP2-293 celler ble transient transfektert med enten pMSCV-H
ras
V12-GFP eller pMSCV-SV40 LTG-RFP kombinert med den replikasjons-inkompetente hjelper-vektor pVSV-G i en 60 mm kulturskål ved hjelp av Fugene 6. cellene ble tilført ved 24 timer etter transfeksjon, og retroviral supernatant var samlet fra samlingen ved 48 og 72 timer etter transfeksjon. Supernatanten ble porsjonert etter sentrifugering og lagret ved -80 ° C for fremtidig bruk. Den viral titer ble verifisert ved FACS-analyse (FACSCanto Analyzer, BD Biosciences, San Jose, California) etter smitte til 1x 10
5 NIH-3T3 (ATCC) mus fibroblast celler.
etablering av stabile GP2- 293 derivater
For å generere GP2-293 derivater med stabil genet integrasjon, GP2-293 ble cellene enten infisert med H
ras
V12 eller SV40 LTG ved hjelp av en retroviral system. FACS sortering ble utført for å velge stabilt infiserte celler i henhold til GFP eller RFP uttrykk (FACSAria celle sorter, BD Biosciences, San Jose, California). Genuttrykket i stabile celler ble verifisert av western blot.
Retroviral Infeksjon å mESCs
mESCs ble vasket og trypsinert. Etter sentrifugering ble de resuspendert i serumfritt mESCs medium inneholdende 8 ug per ml polybren-PBS og belagt på 1×10
5 celler /1 ml pr brønn av en tolv-brønns plate. Retroviral supernatant fra enkelt virus tilsatt ved en ml /1×10
5 celler eller samme volumforholdet retroviral supernatant fra enkelte virus ble lagt for co-infeksjon. Etter 1 time inkubering i CO
2 inkubator, ble platen sentrifugert i 2 timer ved 1000 g ved romtemperatur. Neste dag, de retrovirale supernatantene ble fjernet; ble cellene resuspendert i mESCs medium og sådd ut på servise, enten belagt med Geltrex eller belagt med bestrålte MEF. De stabilt infiserte mESCs sortert etter FACS basert på GFP eller RFP uttrykk (FACSAria celle sorter).
Western blotting
Cellene ble lysert med RIPA buffer (# 9806, Cell Signaling) supplert med 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich). Western blotting ble utført ved anvendelse av 4-20% gradient SDS-polyakrylamid-TRIS-HCI gel (Mini-Protean TGX
®, BioRad) i henhold til produsentens protokoll (Biorad). Antistoffer som benyttes for Western-blotting ble anti-ras (# 610 001, 1: 1000, BD Bioscience), anti-SV40 stort T og lite T-antigen (# 554 150, 1: 1000, BD Bioscience), anti-β-aktin (# A5441 1: 2500, Sigma-Aldrich), og anti-mus IgG-HRP (# 7076S, 1:. 5000, Cell Signaling)
alkalisk fosfatase Farging og Immunocytochemistry Farging av levende celler
alkalisk fosfatase farging ble utført ved hjelp av alkalisk fosfatase farging kit II i henhold til produsentens protokoll (Stemgent). For immunocytokjemi farging av levende celler, ble celler dyrket i en 12-brønners plate inntil viser synlige kolonier ble behandlet med antistoff (StainAlive ™ SSEA-1 (DyLight 550 ™), Stemgent) oppløsning fremstilt i frisk cellekulturmedium med en endelig konsentrasjon på 2,5 ug /ml. Etter inkubering i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO
2,-celler ble undersøkt under et fluorescerende mikroskop (automatisert mikroskop, Nikon, Japan) med TRITC filter.
celleproliferasjonsanalyse
celle proliferasjonsanalyse ble utført ved å benytte celletelling analysesett-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, MD). I korte trekk ble de 100 ul av cellesuspensjonen (3000 celler /brønn) sådd ut i 96-brønners kulturplate belagt med Geltrex (Invitrogen). I løpet av vekstperioden, ble celleformering i hver brønn målt etter 1 timers inkubering med 10 ul av CCK-8-løsning ved anvendelse av en mikroplateleser (Spectramax 250, Molecular Device Inc., Sunnyvale, CA) ved en bølgelengde på 540 nm. Etter subtraksjon av indre absorbans av media ved en bølgelengde på 540 nm, ble den relative celleproliferasjon (%) beregnet fra ([Absorbance]
test /[Absorbance]
kontroll) × 100. [Absorbance]
kontroll refererer til absorbans av celler dyrket i media på dag 1 etter såing av cellene til platen.
in vivo tumor produksjon benytter modifiserte mESCs og histo-patologisk vev evaluering
Denne studien ble gjennomført ut i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved Universitetet i Utah (Permit Number: 14-08011).
Både modifiserte mESCs og naive (kontroll) mESCs ble dyrket i en uke på MEF mateceller inntil synlige kolonier ble sett før implantasjon. For orthotopic eggstokkreft bursa inokulering av celler til dyr, seks til åtte uker gamle, ble kvinnelige C57BL /6 mus (Jackson lab, Bar Harbor, ME) veies før intraperitoneal bedøvende injeksjoner (xylazein-ketamin, 0,1 ml /10 g kroppsvekt). Hvert dyr plasseres i liggende stilling ble mottatt ca ~ 1,5 cm i lengde dorsal snitt, litt til venstre for midtlinjen. Dermis ble skilt fra underliggende vev, og et mindre snitt ble gjort gjennom den dorsale fascia flat muskel for å få tilgang til abdominal peritoneum. Etter identifisering av venstre nyre, ble området umiddelbart nedenfor nyrene dissekert for å finne den venstre eggstokk, som deretter ble ekstern gjennom snittet. 1x 10
5-celler (50 pl i 1: 1 blanding av PBS og Matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury, MA)) ble injisert direkte inn i eggstokk bursa ved hjelp av en Hamilton-sprøyte (30 G nål). Etter celle inokulasjon, eggstokk var stedet tilbake til sin opprinnelige posisjon i bukhulen. 4-0 suturer ble anvendt for å sy snitt av bakveggen og hud [19, 20]. Orthotopic inokulering av celler til brystet av mus ble utført ved direkte injeksjon av 1x 10
5 celler (50 pl i 1: 1 blanding av PBS og matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury, MA)) til høyre nederst pattedyr fett . puten
Dette pilot
in vivo
studien inkluderte (n = 16; S1 Table) dyr. I korte trekk, avhengig av svulststedet (melkekjertlene versus eggstokkene bursa), enten umodne teratomer med maligne egenskaper (eggstokk) eller modne teratomer (bryst) dannet. Det totale antall dyr (n = 16) ble delt inn i fire eksperimentelle grupper. Group1: melkekjertlene inokulert med Mesc; Gruppe 2: Ovarian bursa inokulert med Mesc; Gruppe 3: melkekjertlene inokulert med Mesc-Ras-LTG (iCLSCs), Gruppe 4: Ovarian bursa inokulert med Mesc-Ras-LTG (iCLSCs). Etter orthotopic celle inokulasjon, ble musene overvåket bi-ukentlig gjennom hele 15 ukers eksperimentelle perioder. Dyrene ble plassert under standardbetingelser i Senter for komparativ medisin Animal Facility i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Utah. For den histo-patologiske evaluering av vev, hematoxylin og eosin (H E) flekker ble utført på representative deler av tumormasse etter ARUP laboratorium (ARUP, Salt Lake City, UT). En patolog med gynekologisk onkologi spesialisering evaluert digitale mikroskopiske bilder.
Statistisk analyse
Statistisk analyse og plotting av grafer ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) . Alle resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD og p. 0,05 ble brukt for statistisk signifikans
Resultater
Bygging av pMSCV-HrasV12 og pMSCV-LTG
Retrovirale plasmider med MSCV LTR (mus stamcelle virus lang terminal gjenta) ble konstruert gjennom sub-kloning av enten H
ras
V12 eller SV40 LTG gen inn i en multippel kloningssete (MSC) etterfulgt av en IRES kjøring uttrykk av GFP eller RFP gen vist skjematisk diagram i figur 1A. Skjærene i konstruksjonene ble verifisert gjennom enzymatisk fordøyelse (fig 1B), og DNA-sekvensering.
(A) Gener av interesse (dvs. HrasV12 eller LTG) ble satt inn i mellom MSCV LTR, og enten GFP eller RFP gen var anvendt som en tracer-gen. (B) Setter klonet inn pMSCV plasmider ble bekreftet av enzymatiske digestions med enten BamHI eller EcoRI. M: DNA ladder, 1: pMSCV-GFP; 2: pMSCV-H
ras
V12-GFP; 3: pMSCV-GFP
kutt; 4: pMSCV-H
ras
V12-GFP
kutt; 5: pBABE-H
ras
V12
cut (+ kontroll); 6: pMSCV-RFP; 7: pMSCV-SV40 LTG-RFP; 8: pMSCV-RFP
kutte 9: pMSCV-SV40 LTG-RFP
kutt; 10: pBABE-SV40 LTG
cut (+ kontroll). Hvite piler indikerer innsatser. Sekvenser av innsatsen ble også verifisert ved DNA-sekvensering.
Etablering av GP2-293 derivater til å generere retrovirus
For å etablere stabile cellelinjer som produserer retrovirus, GP2-293 celler, et derivat av 293 human nyrecellelinje med stabil integrering av
gag /pol
retrovirale komponenter, ble omformet med pMSCV plasmider. Cellene som uttrykker enten GFP eller RFP sortert ved hjelp av FACS (Fig 2A og 2B) ble ytterligere bekreftet å observere deres tilsvarende genekspresjon med immunoblotanalyse vist på fig 2C. De bekreftede stabile celler ble videre anvendt for å danne retrovirus ved transfeksjon av en viruskapselen plasmid, pVSV-G. Infeksjon evne av disse retrovirus ble påvist ved FACS-analyse gjennom måling av mengden av retroviralt infiserte-NIH3T3 muse fibroblast-celler som uttrykker enten GFP eller RFP (figur 2D).
(A) Bekreftelse på vellykket GFP-ekspresjon i GP2 -293 celler, og (B) bekreftelse på vellykket RFP ekspresjon i GP2-293 celler etter innføringen av pMSCV plasmider. BF: lyse felt bilde; FL: fluorescens bilde. Scale bare er 400 mikrometer. (C) Immun analyse illustrerer stabil uttrykk for H
ras
V12 og SV40 LTG i GP2-293 celle derivater; 1. BL: GP2-293 tom celle; 2. GFP: GFP inneholder GP2-293 celle 3. HrasV12-GFP: H
ras inneholder
GP2-293 celle; 4. BL: GP2-293 tom celle; 5. RFP: RFP inneholder GP2-293 celle 6. SV40LTg-RFP: SV40LTg og RFP inneholder GP2-293 celle; M: Protein stige. (D) Flowcytometri analyse (FACS) fra 1x 10
5 NIH-3T3 mus fibroblast etter infeksjon med retrovirus produsert fra GP2-293 derivater.
Generering av genmodifiserte mESCs
Mus embryonale stamceller (Mesc) ble forvandlet av infeksjon med retrovirus produsert fra stabile GP2-293 celle derivater. Ekspresjon av gener som innføres i mESCs ble verifisert ved immunoblotanalyse (Fig 3A og 3B). For å bekrefte endringer av celleproliferasjon ble celleproliferasjonsprosesser analyser utført på transform mESCs, som ble også sammenlignet med kontroll mESCs (Fig 3C). Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG viste signifikant økning i spredning i forhold til Mesc-GFP og -H
Ras
V12 på dag 7 (Fig 3D). Videre sammenligner spredning av Mesc-SV40 LTG og Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG med Mesc-RFP, Mesc-SV40 LTG og Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG viste signifikant forbedring av spredning (figur 3D). Men det var ingen forskjell i spredning mellom Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG og Mesc-SV40 LTG (Fig 3D)
Representative bilder fra immunoblot analyse:. (A) H
ras
V12, (B) SV40 LTG. (C) CCK-celleproliferasjonsanalyse for 7 dagers formering periode på mESCs og transform mESCs. (D) Sammenligning av proliferations ved dag 7. Gjennomsnitt ± S.D. (N = 3), *, ** og #, ## p 0,05. ANOVA test ble utført med Tukey post-test ved bruk av GraphPad Prism programvare.
Vedlikehold av stemness etter retroviral forbehold mESCs
For å bekrefte stemness av transform mESCs uttrykket av alkalisk fosfatase (AP) og scene-spesifikke embryonale anitigen-en (SSEA-1) stamcelle markør ble evaluert. De transformerte mESCs (figur 4Å (c) – (e)), uttrykt tilsvarende nivåer av AP-farging sammenlignet med ubehandlede (ikke-transformerte) mESCs (figur 4Å (b)) som indikerer uavbrutt vedlikehold av udifferensierte celler som beholdt sin selvfornyelse potensial . Under ytterligere verifisering av udifferensiert tilstand av transformerte mESCs med SSEA-1-spesifikt antistoff, transform mESCs (figur 4B (b) – (d)) viste en positiv for dette overflatemarkør som som ikke-transform mESCs (figur 4B (a )). Påvisning av både AP og SSEA-en i transform mESCs vist at transformasjon prosedyrer ikke synes å påvirke stemness av mESCs.
(A) alkalisk fosfatase (AP) farging. Red-farget områder indikerer alkalisk fosfatase aktivitet. (en). Bright felt bilde av mESCs; AP-farging: (b). mESCs; (C). Mesc-H
ras
V12; (D). Mesc-SV40 LTG; (E). Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG. Scale bare er 10 mikrometer. (B) Immunocytochemistry farging av levende-celler som uttrykker SSEA1. Par av lyse arkivert og SSEA1 bilder: (a). mESCs; (B). Mesc-H
ras
V12; (C) .mESC-SV40 LTG; (D). Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG. De representative bildene ble hentet fra fluorescerende mikroskop med TRITC filter. Scale bar er 100 mikrometer.
karakterisering av bioengineered kreftlignende stamceller
For å bekrefte onkogene potensialet omprogrammerte mESCs, Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG celler ble enten orthotopically inokulert til venstre eggstokk bursa eller ryddet inguinal melkefettputer. På 31 dager etter vaksinasjonen, hadde en ovarian masse dannet i mus som gjennomgikk orthotopic poding av eggstokkene bursa. I motsetning til mus som har gjennomgått ortotopisk inokulering av lyskemelkefettpute ikke danner noen masser. Abdominal situs i mus etter eggstokk vaksinasjon viste en eggstokkmasse (figur 5A) i form av forstørret venstre eggstokk i forhold til normal contra-lateral, ikke-injisert høyre eggstokk (Fig 5B). Ved ekstra grov undersøkelse, den injiserte venstre eggstokk også synlig demonstrert dannet masse bryte gjennom eggstokk overflaten samt å feste seg til peritoneal veggen. Den retroperitoneale rom ble også funnet å være okkupert av massen man følger til bakveggen, og venstre nyre (Fig 5C). Det var ingen brutto bevis for magemetastaser som følger av dette eggstokk massen.
(A). Abdominal nettsted med eggstokkmasse (blå sirkel); (B). Livmorhalsen med livmor, akkurat normal eggstokk (blå pil) og venstre eggstokk-masse (hvit pil); (C). Venstre eggstokk med delvis intakt kapsel og masse bryte gjennom eggstokk overflaten (blå sirkel).
histo-patologiske analyse av eggstokkene injisert med Mesc avslørte generering av et modent teratom utviser godt differensiert plateepitel med keratinisering og respiratorisk epitel-lignende (fig 6a-(b)) i forhold til histologiske trekk ved normal ovarie (figur 6a-(a)). Interessant, eggstokkene injisert med Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG også dannet modne teratomer, men i tillegg avdekket deler av en umoden teratom inneholder spredte områder med en høy grad av ondartet svulst, preget av ondartede celler arrangert lineært , i små klynger, og av og til som rudimentære kjertel-lignende strukturer (fig 6a-(c) lite vindu). Høyere forstørrelse avslørte disse ondartede celler til å være dårlig differensiert med høy kjerne: cytoplasma ratio, markert atypiske kjerner med grov klumpet kromatin, variabelt fremtredende nucleoli, og mange mitotiske tall (figur 6a-(c)). Mus som hadde sine lyskemelkefettputer injisert med mESCs syntes å ha generert modne teratomas stiller godt differensiert plateepitel, også inneholder bukspyttkjertelen vev, og luftlignende epitel med velformet cilier (Fig 6B- (b)) sammenlignet med histologisk vurdering av normalt brystvev (fig 6B- (a). i kontrast, bryst injisert Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG ikke viste noen nevneverdige histologiske forskjeller i forhold til vanlig, ikke-injisert … brystvev
(A) Ovarian Panel: (a) Normal høyre (ikke-injisert) eggstokk (100X) Scale bar er 100 mikrometer, (b) Venstre Ovarian massen (etter orthotopic inokulering med Mesc. ) viser tegn til en moden teratom (lite vindu, 100X) kjennetegnes med fokus på modne, keratiniserende plateepiteldysplasi innenfor området avbildet inne i boksen (200X) Scale bar er 100 mikrometer,.. (c) Ovarian massen (etter orthotopic inokulasjon med Mesc-H
ras
V12 /SV40-LTG) viser tegn på umoden teratom (lite vindu, 100X) kjennetegnes med spredt foci av et høyverdig ondartet svulst innenfor området avbildet inne i boksen (400X). Scale bar er 100 mikrometer. (B) Brystpanel: (a). Normal murine brystvev (100X). Scale bar er 100 mikrometer; (B). Bryst masse (etter orthotopic inokulering av Mesc inn ryddet lyskemelkefettpute) som viser tegn på modne teratom (lite vindu, 100X) kjennetegnes med luftlignende epitel har vel dannet flimmerhårene innenfor området avbildet inne i boksen (200X). Scale bar er 100 mikrometer.
Diskusjoner
Denne studien viser at mus embryonale stamceller (mESCs) kan reprogramed inn indusert kreft som stamceller (iCLSC) ved innføring av godt definerte onkogene elementer (simian virus 40 store T onkogen (SV40 LTG) og en onkogene ras (H
ras
V12)) ved å bruke en mus stilk virus lang terminal gjenta (MSCV-LTR) -baserte retroviral plasmid .
in vitro
omprogrammeres mESCs utstilt forbedring av spredning og vedlikehold av stamcelleegenskaper under
in vitro
dyrkningsforhold. I tillegg de transformerte celler viste også stedsspesifikke forskjeller i orthotopic tumor dannelse av følgende inokulering av eggstokk og brystvev i immun kompetente mus. Derfor foreslår vi at
in vitro
omprogrammering av mESCs med onkogene elementer kan være en potensiell tilnærming til å generere indusert kreft som stamceller.
MSCV-LTR retrovirale systemet ble funnet å være et potensielt nyttig verktøy for en effektiv, onkogene transformasjon av mESCs. Retroviral infeksjon av mESCs virker svært avhengig av virus som genereres fra forskjellige typer retrovirale plasmider. I vår MSCV-LTR retrovirus-systemet, ble det observert større infeksjon evne og vedlikehold av en stabil genekspresjon, sammenlignet med den vanlige Moloney-virus-baserte retrovirale system (dvs. pBABE serie). Våre siste funnene er i tråd med tidligere rapporter om at retrovirus, som ble generert fra en MSCV-LTR baserte retroviral plasmid, kunne opprettholde langsiktig og stabilt uttrykk av gener i både embryonale stamceller (ES) celler og blodkreft stilk (HS) celler [ ,,,0],21, 22].
In vitro
omprogrammering av mESCs til iCLSC oppfylt kravene i veldefinerte onkogene gener, H
ras
V12 og SV40 LTG, for både neoplastisk transformasjon og anti apoptose. Onkogene ras-mutasjon, som forekommer hos ca. 30% av alle humane tumorer, er kjent for å være involvert i prosessen med neoplastisk transformasjon av celler
in vitro
og har blitt godt rapportert [13, 23, 24]. Men innføring av et konstitutivt aktiv form for ras alene (dvs. H
ras
V12) viste sitt potensial for sensibiliserende celler til apoptose [24-26] og selv induksjon av for tidlig celle senescence gjennom sammenslutningen av p53 opphopning [27 ]. I vår proliferasjonsanalyse med omprogrammert Mesc, er mangelen på en betydelig forbedring av proliferasjon av den omprogrammert Mesc med H
ras
V12 alene kan være delvis forklares ved induksjon av cellulær enten senescens eller apoptose ved ekspresjon av en konstitutivt aktiv form for H
ras
V12 alene. I kontrast, Mesc-SV40 LTG og Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG vist sin styrke proliferative effekter. Vurderer en anti-apoptotiske rollen til SV40 LTG ved inaktivering av p53 [28], foreslår vi at innføringen av SV40 LTG inn i Mesc kan spille en rolle i å forhindre Mesc fra for tidlig senescens cellulær eller induksjon av apoptose. Videre kan SV40-LTG samarbeide med H
ras
V12 under neoplastisk transformasjon av mESCs med forebygging av H
ras
V12-indusert celledød, som ble funnet å være i samsvar med ulike tidligere rapporter [13, 29, 30].
Den vellykkede vedlikehold av stamcelleegenskaper i omprogrammerte mESCs kunne bekreftes
in vitro Hotell og
in vivo
. I prosessen med
in vitro
omprogrammering av mESCs, brukte vi retroviral infeksjon for å innføre onkogene komponenter. Selv om retrovirale innføring av gener som har fordelene av høye infeksjon og stabil integrering av eksogene gener inn i vertens kromosom, kan tilfeldig innsetting av retrovirale komponenter i verts genomer ikke utelukke forstyrrelse eller tap av ekspresjon av stamcelleegenskaper i mESCs. Men vi observere en stabil uttrykk for de to stamcellemarkører, alkalisk fosfatase (AP) og SSEA-1 etter retroviral transformasjon av mESCs. For å få en mer omfattende forståelse av mekanismene for den underliggende denne opprettholdelsen av stammen genekspresjon etter retroviral infeksjon, blir videre studier nødvendig. I tillegg til vedlikehold av stamcelleegenskaper
in vitro
, orthotopic inokulering av omprogrammerte mESCs
in vivo
viste også dannelsen av umodne teratomas i eggstokken av mus. Faktisk, den observerte teratom formasjon
in vivo
, inkludert umoden, ondartede komponenter også eksemplifiseres vellykket vedlikehold av stamcelleegenskaper
in vivo
gjennom hele omprogrammering prosessen.
Dersom utviklingen av ulike maligne svulster fra stamcellene vil faktisk være mulig, kan dette kreve ytterligere studier for å undersøke nærmere den spesifikke rollen til ulike microenvironments i tumorigenesis [31]. Våre dyreforsøk tillatt oss å observere forskjellene i teratom formasjonen i to forskjellige ortotopiske implantasjoner (ovarie og bryst). I orthotopic eggstokkene implantasjon, Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG induserer dannelsen av umodne teratom stille spredt områder med en høy grad av ondartet svulst. Men bryst plassert med Mesc-H
ras
V12 /SV40 LTG ikke viser dannelsen av teratom. Selv om bidraget fra mikromiljøet i de to språk for generering av malignitet gjenstår å bli studert, en fersk rapport fra Yan T
et al
foreslo potensielt bidrag fra tumor gunstig microenvironmental faktorer under transformasjon av mus indusert pluripotent stamceller (miPSCs) i kreft stamceller (cscs) [32]. Derfor tror vi at ovarialt mikromiljøet kan være stedet gunstig for fremme av tumorigenesis av mESC- H
ras
V12 /SV40 LTG forhold til stedet for brystet.
I konklusjonen, vi demonstrert den vellykkede generasjonen av indusert kreft som stamceller ved hjelp av onkogene
in vitro
reprograming av mESCs. De omprogrammeres mESCs ble karakterisert gjennom deres onkogene genekspresjon og uhindret vedlikehold av stam egenskaper
in vitro Hotell og
in vivo
. I tillegg er disse modifiserte celler viste dannelse av teratomas inneholder umodne, ondartede deler når det vokser orthotopically på implantasjonsstedet gunstig for tumorigenesis. Begrensninger av denne forskningen eksisterer basert på dannelsen av avanserte teratomas
in vivo
i forhold til spørsmålet om tumor- gunstige microenvironments. Videre foreslår vi nødvendigheten av en avvikende mikromiljøet for utvikling og vedlikehold av svulster avledet fra indusert kreft som stamceller. For bedre å forstå prosessene av naturlig tumorigenesis, samt å etablere mer forutsigbare kreft dyremodeller, videre studier av de detaljerte rollene svulsten mikromiljøet samt identifisering av potensielt avvik microenvironmental faktorer vil være nødvendig for å få innsikt i
in vivo
generasjon av ulike kreftformer som stammer fra indusert kreft som stamceller. Vårt arbeid har gitt banebrytende grunnlag for å muliggjøre en rekke andre fremtidige forsknings søknader om disse indusert kreft som stamceller, men mer forskning er nødvendig for å bedre forstå underliggende mekanismene for iCLSCs tumorigenesis.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table . Tumordannelse hos mus
doi:. 10,1371 /journal.pone.0141172.s001 plakater (TIF)
Takk
Forfatterens ønsker å takke Dr.Yongen Sun for hans støtte gjennomføre alle dyre operasjoner, Ms Kathy Harvey for henne korrekturlesing av manuskriptet, den biorepository og molekylær patologi (BMP) gruppe på Huntsman Cancer Institute for støtten i håndtering av histopatologiske farging av vev, og Dr. James Marvin og Mr. Chris Leukel for støtten fra FACS sortering celler i University of Utah flowcytometri kjerne.
