Abstract
Tumor hypoksi induserer epitel-mesenchymale overgang (EMT), som induserer invasjon og metastasering, og er knyttet til kreft stamceller (cscs). Enten EMT genererer cscs
de novo
, forbedrer migrering av eksisterende cscs eller begge er uklart. Vi undersøkte pasienten vev av pankreatisk duktus adenokarsinom (PDA) sammen med karsinomer i bryst, lunge, nyre, prostata og ovarier. For
in vitro
studier, fem etablerte PDA cellelinjer klassifiseres som mindre (CSC
lav) og svært aggressive CSC-lignende celler (CSC
høy) ble undersøkt av enkel og dobbel immunfluorescens mikroskopi, sår -, transwell-, og time-lapse mikroskopi. HIF-1α og Slug, samt HIF-2α og CD133 var co-uttrykk som peker mot en antatt sameksistens av hypoksi, EMT og cscs
in vivo
. CSC
høye celler oppviste høy basal ekspresjon av mesenchymale vimentin protein, men lav eller ingen ekspresjon av det epiteliale markør E-cadherin, med det motsatte resultat i CSC
lave celler. Hypoksi utløst endring av celle morfologi fra en epitelial til mesenchymale fenotype, som ble mer uttalt i CSC
høye celler. Samtidig, E-cadherin uttrykk ble redusert og uttrykk for vimentin, Slug, Twist2 og Zeb1 forbedret. Mens hypoksi forårsaket migrasjon i alle cellelinjer, hastighet sammen med andelen migrere, polariserte og pseudopodia dannende celler var signifikant høyere i CSC
høye celler. Disse data indikerer at hypoksi-indusert EMT forekommer i PDA og flere andre tumortyper. Men selv om hypoksi-indusert EMT signalering forekommer i alle tumorcellepopulasjoner, bare stilk-lignende celler skaffe høy vandrende potensial og dermed kan være ansvarlig for invasjon og metastase
Citation. Salnikov AV, Liu L, Platen M , Gladkich J, Salnikova O, Ryschich E et al. (2012) Hypoksi induserer EMT i lav og meget aggressivt bukspyttkjertelen tumorceller, men bare celler med Cancer Stem Cell Kjennetegn Acquire Uttalt Migratory potensial. PLoS ONE 7 (9): e46391. doi: 10,1371 /journal.pone.0046391
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 12. juni 2012; Godkjent: 29 august 2012; Publisert: 26.09.2012
Copyright: © Salnikov et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra det tyske Cancer Aid (Deutsche Krebshilfe 109 362), tysk forskersamfunnet (DFG HE 3186 /11-1) og tysk-israelske Stiftelsen for industriell forskning og utvikling (GIF 1058 til 7,11 /2008). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) er en aggressiv kreft preget av en omfattende lokal invasjon, tidlig systemisk formidling og merket motstand mot kjemoterapi og strålebehandling [1]. I tillegg er de fleste PDA ha en uttalt hypoksisk tumor-mikromiljøet [2]. Tumor hypoksi oppstår når oksygenforbruket overstiger dens levering av det vaskulære system [3]. Dette fører til induksjon av hypoksi-induserbare transkripsjonsfaktorer, f.eks HIF-1α og HIF-2α som regulerer hypoksisk respons ved induksjon av målgener som VEGF [4]. Oksygentrykket i faste tumorer er generelt lavere enn i de omkringliggende ikke-maligne vev og tumorer som oppviser omfattende hypoksi har vist seg å være mer aggressive enn tilsvarende svulster som er bedre oxygenized [5], [6], [7]. Dette omfatter kreft i bukspyttkjertelen, hvor høy ekspresjon av hypoksi markør HIF-1α i pasientens vev har vist seg å være en prediktor for dårlig klinisk resultat [8]. I eksperimentelle studier, spår hypoksi aggressiv vekst og spontane metastasedannelse i bukspyttkjertelkreft xenografter [9]. Følgelig tilbakefall svulster viser en høyere hypoksisk brøkdel i forhold til primærsvulster [10], [11] noe som tyder på en rolle av hypoksi i anriking av kreftceller med stamcelleegenskaper (CSC).
Den lille CSC befolkningen er foreslått å ha selvfornyelse potensial og evnen til å differensiere og derved generere den heterogene cellepopulasjon fra den opprinnelige tumor [12], [13], [14]. Disse funnene er også påvist for bukspyttkjertelkreft [15], [16]. I tillegg CSC er foreslått å megle ukontrollert vekst, terapi motstand, invasjon og metastasering [17]. Men om cscs er virkelig de eneste cellene med
de facto
karsinogent potensial er fortsatt kontroversielt [18], [19], [20], [21]. Nye rapporter viser at fremveksten av cscs skjer delvis som et resultat av epitelial-mesenchymale-overgang (EMT) [21]. Derfor oppstår det spørsmål om EMT påvirker CSC befolkningen bare eller også de mer differensierte stamceller
EMT er en evolusjonært konservert utviklingsprosess i løpet av denne cellene mister epiteliale egenskaper og få mesenchymale egenskaper [22]. Dette er ledsaget av oppløsningen av celle-celle kryss og tap av apico-basolateral polaritet, hvilket resulterer i dannelsen av trekk mesenchymale celler med invasive egenskaper [21]. Derfor er EMT involvert i tumorprogresjon og metastase [23]. EMT-indusere som transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) eller hypoksi, utløse endringer i genuttrykk av komplekse signalveier. En grunnleggende mekanismen som er involvert i utviklingen av EMT er oppregulering av mesenchymale markør vimentin og nedregulering av den epiteliale markør E-cadherin – hovedtrans adhesjonsmolekylet er ansvarlig for celle-til-celle-interaksjoner og vev organisasjon i epitel-celler [24]. E-cadherin er transcriptionally trykt av Twist, snegle, Slug og Zeb proteiner. Redusert E-cadherin uttrykk fører adherens krysset sammenbrudd, og sammen med andre signal hendelser fremmer robuste genuttrykk endringer [21]. Tapet av polaritet og gevinst på bevegelige kjennetegn mesenchymalceller under embryonal utvikling har ført til sammenligninger med metastaserende kreftceller i løpet av ondartet progresjon [25]. Spesielt, nylige data viser at EMT er faktisk er involvert i genererende celler med egenskaper av stamceller som er vist i kreft i bryst [25], [26], colorectum [27] og bukspyttkjertel [28], [29].
Ifølge CSC hypotesen utelukkende CSC befolkningen er ansvarlig for tidlig systemisk spredning og metastasedannelse. Dette innebærer at hypoksi-indusert EMT enten påvirker cscs bare eller aktiverer mer differensierte stamceller for å demme lignende celler eller begge sammen. Siden dette problemet ikke er undersøkt så langt, vi behandlet dette spørsmålet. Ved å fokusere på kreft i bukspyttkjertelen vi funnet co-uttrykk for hypoksi-, EMT og CSC markører i pasient-avledet vev. Ved bruk av etablerte cellelinjer med høy eller lav stamceller egenskaper (CSC
høye eller CSC
lave) vi indusert ved hypoksi en gassblanding av lav oksygen. Dette førte til endringer i cellemorfologi resulterer i en mer fibroblastoid-fenotype og EMT-relaterte protein ekspresjon i begge tumorcellepopulasjoner. Men de mer aggressive cellene hadde en høyere basal EMT-signatur, og dette var forbundet med raskere og høyere hypoksi-mediert induksjon av trekkfugl aktivitet. Våre funn kan ha implikasjoner for flere kreft enheter, siden vi fant uttrykk for hypoksi markør CA IX og av EMT markør Twist2 ikke bare i PDA, men også i pasient avledet kreftvev av bryst, nyre, prostata, lunge og eggstokk.
Materialer og metoder
tumorcellelinjer
BxPc-3, CAPAN-2, MIA-PaCa2, ASPC-en og CAPAN-1 PDA cellelinjer ble hentet fra den amerikanske Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og autentisert gjennom hele kulturen ved den typiske morfologi. Mycoplasma negative kulturer ble sikret av ukentlige tester. Cellene ble dyrket i DMEM (PAA, Pasching, Østerrike) supplert med 10% varme inaktivert FCS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 25 mmol /l HEPES (PAA, Pasching, Østerrike).
Etikk Statement + tumor vevsprøver
Pasient-avledet svulstvev fra bukspyttkjertelen, bryst, nyre, lunge, prostata og eggstokkreft ble oppnådd under godkjenning av etisk komité ved Universitetet i Heidelberg. Vevet ble analysert anonymt og er avledet fra en 30-åring vev bank. Derfor en pasient samtykkeerklæring er ikke aktuelt. Diagnoser ble etablert av konvensjonelle kliniske og histologiske kriterier ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO). All klinisk undersøkelse har blitt gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
In vitro hypoksi modell
For induksjon av hypoksi 80% konfluente celler ble benyttet i en hypoksi kammer (selv- laget), som ble spylt med en gassblanding av 1% O
2, 5% CO
2, 94% N
2 (Grandpair, Heidelberg, Tyskland) i ca 4 min. Celler ble inkubert i hypoksisk miljø for 24, 48 eller 72 timer ved 37 ° C. Kammeret ble etterfylt med gassblandingen etter 24 timer for å sikre konstante gasskonsentrasjoner.
Immunhistokjemi og immunocytokjemi
Immunhistokjemi på 6 um frossen eller parafininnstøpte vevssnitt ble utført som beskrevet tidligere [30 ]. Antistoffer anvendt for immunhistokjemi ble kanin polyklonalt anti-humant CA IX (Santa Cruz Biotechnology) og mus mAb-anti-human Twist2 og vimentin (Abcam, Cambridge, UK). For doble immunocytofluorescence stainings muse mAbs rettet mot HIF-1α (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Expression of hypoksi-, EMT- og CSC-markører i kreft i bukspyttkjertelen vev
Å studie co-uttrykk for hypoksi- og EMT-markører vi utført dobbelt immunfluorescens farging av pasient avledet frosne vevsprøver av bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom. I HIF-1α positive regioner E-cadherin ble nedregulert og Slug oppregulert avslørende tumor-hypoksi-indusert EMT (Fig. 1a). I enkelte tumorområder, ble celler med enten vimentin eller E-cadherin ekspresjon observert i umiddelbar nærhet (fig. 1B). Dette indikerer at omkring stromale celler som er positive for vimentin og negativ for E-cadherin. Mest interessant, hypoksiske områder som var positive for den hypoksi markør HIF-2α viste ko-farging med CD133, noe som tyder på at tumor hypoksi er assosiert med ekspresjon av CSC markører (Fig. 1C). Disse data bekrefter at hypoksi-drevet EMT oppstår i svulstvev fra pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og CSC-positive tumorceller er tilstede i hypoksiske tumor microenvironments.
(A) Double immunofluorescence stainings av tumorprøver fra pasienter med kreft i bukspyttkjertelen . Nuclear uttrykk for HIF-1α (grønn pil) og membran uttrykk for E-cadherin (rød pil) eller Slug (rød pil) vises. Gul farge på fusjonerte bildene viser samtidig uttrykk for E-cadherin eller Slug i HIF-1a-positive celler. (B) Membran ekspresjon av E-cadherin (rød), cytoplasmatisk ekspresjon av vimentin (grønn) sammen med Dapi-farging av kjerner (blå). Hvite firkanter indikerer vimentin-positive celler i svulsten massen som er negative for E-cadherin eller
vice versa
. Bar: 100 mikrometer. Todelt forstørrelser av de områdene som er omgitt av hvite firkanter er vist til venstre. (C) Nuclear uttrykk for HIF-2α og membran uttrykk for CD133 er vist som singel flekker og som fusjonerte flekker der gul farge indikerer dobbel-positivitet.
Hypoksi induserer HIF-1α signalering og morfologisk endringer i vitro
for mer detaljert evaluering av hypoksi-indusert EMT og innflytelsen til differensierte og CSC-lignende kreft i bukspyttkjertelen celler vi brukte fem etablerte humane cellelinjer PDA. I henhold til graden av differensiering av primærtumor, mutasjoner i K-ras eller p53, koloni og sfæroide dannende kapasitet, ALDH-aktivitet, tumorgenisitet i mus og ekspresjon av E-cadherin og vimentin vi klassifiseres disse cellelinjene som CSC
høy eller CSC
lav (tabell 1). Hypoksi ble indusert ved inkubering av celler i en gassblanding av 1% O
2, 5% CO
2 og 94% N
2. Dette resulterte i rask oppregulering av HIF-
1α og målet genet VEGF innen 2 timer i begge, CSC
lav og CSC
høye celler som undersøkes av Western blot analyse. I kontrast, celler dyrket i henhold til normoksisk betingelser ikke oppregulerer disse proteinene (fig. 2A, data ikke vist). CSC
lave cellene hadde et uttrykk topp mellom 6 og 12 timer, noe som gradvis redusert over tid, men var fortsatt synlige på 72 timer. I motsetning til dette, CSC
høy-celler hadde en tidligere topp mellom 4 og 6 timer, som ble redusert til meget lave nivåer allerede etter 24 timer og var ikke målbart på 72 timer i begge cellelinjer. I motsetning til dette, ble VEGF-ekspresjon stadig forbedret i løpet av et tidsrom på 72 timer. På linje med den observerte hypoksi relatert signale antall celler med en fibroblastoid-lignende fenotype øket i løpet av 72 timer 20-28% i CSC
lave celler og 28-33% i CSC
høy-celler (Fig . 2C). Induksjon av prosentandelen av spindelformede celler som var enda mer uttalt og høyere i CSC
høye celler ved TGF-β, en kjent induser av EMT-, som ble benyttet som positiv kontroll. ble observert tilsvarende morfologiske endringer ved eksponering til hypoksi i CAPAN-1, CAPAN-2 og ASPC-1 cancerceller (figur S1). Disse dataene tyder på at
in vitro
induksjon av hypoksi induserer EMT i begge cellepopulasjoner -. Mer differensierte og CSC-lignende kreft i bukspyttkjertelen celler, men effekten er raskere og sterkere i CSC
høye celler
(A) for hypoksi induksjon
in vitro
, ble BxPc-3 og MIA-PaCa2 celler inkubert i en lufttett kammer i en atmosfære av 1% O
2, 5% CO
2 og 94% N
2 i den tidsperioden som er angitt. Kontroller ble inkubert i henhold til normoksisk betingelser for 48 h (N). Proteiner ble høstet og ekspresjon av HIF-1α og VEGF ble undersøkt ved Western blot-analyse. Proteinekstrakter av celler dyrket under betingelser normoksisk (N: 16% O
2, 5% CO
2, 79% N
2) tjente som kontroll for induksjon av hypoksi (H). Farging av Western blot membraner med β-actin fungerte som kontroll for like forhold. (B, C) Morfologiske forandringer i celler eksponert for hypoksi, normoxia, eller TGF-β (5 ng /ml) ble evaluert ved hjelp av et lysmikroskop 72 timer etter inkubering /behandling under 100
x
forstørrelse (innfellinger, 200
x
). Prosentandelen av fibroblastoid spindelformede celler ble telt ved 24, 48 og 72 timer.
Hypoksi opp-regulerer EMT-relatert protein uttrykk
For ytterligere evaluering av celle-type spesifikke effekter av hypoksi-indusert EMT vi undersøkt uttrykk for proteiner involvert i EMT i to CSC
lave cellelinjer BxPc-3 og CAPAN-2 og i de tre CSC
høye cellelinjer MIA-PaCa2, ASPC-en og CAPAN-1. Etter eksponering til normoxia eller hypoksi i 48 timer merkede vi cellene med spesifikke antistoffer og analysert fluorescens av dobbelt immunfluorescens-mikroskopi. Mens begge CSC
lave cellelinjer som hadde sterk basal ekspresjon av E-cadherin, men lav ekspresjon av vimentin, som forventet, induserer hypoksi nedregulering av E-cadherin og oppregulering av vimentin (fig. 3). Dette ble assosiert med oppregulering av EMT-markører Twist2, Slug og Zeb1. I motsetning til CSC
høye celler viste ingen (MIA-PaCa2) eller en svært lav basal uttrykk (ASPC-en, CAPAN-1) av E-cadherin men høyere basal uttrykk for vimentin forhold til CSC
lave celler. Ved eksponering for hypoksi et typisk-EMT-lignende protein ekspresjon oppstått lignende som observert i CSC
lave celler. Immunfluorescens data ble bekreftet ved Western blot-analyse (data ikke vist). Disse dataene antyder at både CSC
lav og CSC
høye celler vise den typiske hypoksi-indusert EMT-relaterte genekspresjon men basal EMT-relatert protein uttrykk i henhold normoksisk forhold er høyere i CSC
høye celler.
BxPc-3 og CAPAN-2 CSC
lav og MIA-PaCa2, ASPC-en og CAPAN-en CSC
høye celler ble utsatt for normoxia eller hypoksi i 48 timer. Uttrykk for EMT-relaterte proteiner ble påvist ved å dobbelt immunfluorescens farging, etterfulgt av å fotografere cellene etter 400
x
forstørrelse. Størrelsen på bilder tatt ble ytterligere tredoblet i Photoshop. E-cadherin (rød), Twist 2 (grønn), Slug (rød), vimentin (grønn), ZEB1 (rød). Kjerner er farget med Dapi (blå). Endringer i nivåene av EMT-relaterte proteiner er vist nedenfor bildene. Ingen uttrykk påviselig (-)., Svak uttrykk (+), median uttrykk (++), sterkt uttrykk (+++)
Hypoksi stimulerer trekkende egenskaper bukspyttkjertelen cscs
For å undersøke hypoksi-indusert forskjeller, analyserte vi kreft celle migrasjon i tre forskjellige migrasjons analyser. Først brukte vi en standard
in vitro
såret analysen. BxPc-3, CAPAN-2, MIA-PaCa2, ASPC-1 eller CAPAN-1-cellene ble utsatt for hypoksi eller normoxia i 24 timer fulgt av å skrape av det sammenflytende cellelaget og videre inkubasjon ved normoksisk betingelser. Bilder av trekkende celler i samme område er vist 12 og 24 timer etter riper. I alle cellelinjer har vi funnet at de sårede regionen ble stengt raskere ved celler som hadde vært utsatt for hypoksi sammenlignet med celler eksponert for normoxia. Men vi kunne ikke finne noen store forskjeller i cellemigrasjon mellom CSC
høy og CSC
lave cellelinjer i denne ikke-kvantitativ analyse (data ikke vist). Representative data for CAPAN-1 er vist (Fig. 4A). Derfor er det benyttet en mer følsom migrasjonsanalysen ble utført i 3D ekstracellulær matriks. Migrasjon av enkeltceller ble dokumentert av time-lapse video mikroskopi. I tråd med de data innhentet av sårtilheling analysen fant vi at 48 timers eksponering av CSC
høy ASPC-en eller CSC
lav BxPc-3 celler til hypoksi indusert raskere bevegelse og en høyere prosentandel av polarisert, migrering og pseudopodia -dannende celler enn normoxia i begge cellelinjer (fig. 4B). I likhet med våre tidligere resultater CSC
høye celler migrert raskere enn CSC
lave celler. Gjennomsnittlig hastighet på ASPC-1 CSC
høye celler eksponert for hypoksi var 7,8 mikrometer /h i motsetning til 5,1 mikrometer /h CSC
lave BxPc-3 celler. Også andelen av basale trekkende celler samt celler som danner pseudopodia eller utviser en polarisert fenotype var høyere i CSC
høy sammenlignet med CSC
lave celler. Disse data ble bekreftet i en standard transwell-analyse. CSC
høy MIA-PaCa2, ASPC-1, CAPAN-1 og CSC
lave BxPc-3 og CAPAN-2-celler ble preinkubert i henhold hypoksiske betingelser i 48 timer i normal cellekulturmedium inneholdende 10% FCS. Vandring mot en gradient på 1%, 10% og 20% FCS i henhold normoxia ble målt ved å evaluere antallet transmigrated celler innenfor 4C (fig.) I 48 timer. Vi har funnet at pre-inkubering av cellene under hypoksiske betingelser økte prosentandelen av transmigrated celler i alle cellelinjer. Den mest åpenbare effekter ble oppnådd med celler som beveger seg mot en gradient på 1% FCS. Ved en gradient av 10% FCS basal migrering av CSC
høye celler allerede var på det høyeste nivå som det fremgår av den positive kontroll med 20% FCS. Dermed hypoksi kan ikke lenger bevege basal migrasjon av MIA-PaCa2 og CAPAN-1 celler mot en stigning på 10% FCS. Helt tilsvarende resultater ble oppnådd når migrering av hypoksi pre-behandlede celler ble analysert under hypoksiske betingelser (Fig. 4D). Disse resultater antyder at selv om hypoksi induserer migrasjon i mer differensierte og CSC-lignende celler, basal og hypoksi-indusert trekkende potensial er høyere i CSC
høye celler. Derfor hypoksi-indusert EMT induserer høy vandrende potensial hovedsakelig i CSC-lignende celler, som kan være ansvarlig for invasjon og metastasering.
(A) CAPAN-1 celler ble inkubert i henhold hypoksisk (H) eller normoksiske (N) betingelser for 24 timer, etterfulgt av å skrape konfluent cellelaget. Migrering av celler inn i såret område ble overvåket i løpet av 24 timer og fotografier er vist på 0, 12 og 24 timer etter riper. Bar: 100 mikrometer. (B) BxPc-3 (CSC
lav) eller ASPC-1 (CSC
høy) celler eksponert for hypoksi (H) eller normoxia (N) i 48 timer ble inkludert i en tre-dimensjonal (3D) kollagen gel og motorisk aktivitet ble analysert i en POCmini kammeret ved mikroskopi under 50
x
forstørrelse som beskrevet i Materiell og amp; § metoder. Fire typer celle motorisk aktivitet ble undersøkt: aktiv dannelse av pseudopodia (1), polarisasjon som det fremgår av celleforlengelse og bipolar form formasjon (2), aktiv migrasjon til mer enn to celle diametere avstand (pil 3) fravær av et påvisbart cellulær polarisering og bevegelse (4). Representative Bildene vises og tidspunkter for analyse indikeres. (C) BxPc-3, CAPAN-2, MIA-PaCa2, ASPC-1 og CAPAN-1-celler ble for-inkubert i henhold til hypoksisk (H) eller normoksisk (N) forhold. Transmigrasjon ble analysert etter ytterligere 48 timers inkubering under normoksiske og hypoksiske (D) betingelser ved anvendelse av en standard Transwell-analyse. Migrering av celler overfor medium med 1% eller 10% FCS i det nedre kammer ble evaluert. Migrasjon mot medium med 20% FCS tjente som positiv kontroll.
Co-uttrykk for hypoksi- og EMT-markører er vanlig i flere kreft enheter
Hypoksi-induserte EMT ble studert i parafin-embedded pasient avledet vevsprøver av bukspyttkjertelen, bryst, nyre, lunge, prostata og eggstokkreft. I alle disse vev identifiserte vi uttrykket for karbonisk anhydrase IX (CA IX), et protein oppregulert etter hypoksi [6], sammen med ekspresjon av vimentin og EMT-relaterte transkripsjonsfaktor Twist2 (fig. 5). I motsetning til ekspresjonen av CA IX, vimentin og Twist2 var fraværende i ikke-ondartet vev som eksemplifisert i normalt lungevev avledet fra den samme pasient fra hvem stainings av den tilsvarende ondartet vev er presentert (figur S2). Disse dataene viser at hypoksi-drevet EMT er et felles trekk ved flere kreft enheter, som kan bli etterfulgt av økt migrasjonspotensialet i CSC befolkningen.
uttrykk for karboanhydrase IX (CA IX), Twist2 og vimentin ble analysert ved vanlig immunhistokjemi i tumorvev avledet fra pasienter med pankreatisk (n = 5), bryst (n = 11), nyre (n = 10), lunge (n = 9), eggstokk (n = 9) og prostata (n = 9) kreft. Positive celler (røde) er rød til mørk rød. Bar: 100 mikrometer. En tredelt forstørrelse (større hvite firkanter) av et lite område med positive-farget celler (mindre hvite firkanter) blir vist innenfor hvert bilde.
Diskusjoner
I denne studien har vi evaluert spørsmålet om hypoksi-indusert EMT påvirker CSC-lignende celler av PDA bare eller også de mer differensierte kreftceller. I pasient svulstvev av PDA identifiserte vi samlokalisering av hypoksi markør HIF-1α og av EMT markør Slug. Tissue regioner av kreft i bukspyttkjertelen positive for hypoksi markør HIF-2α var svært positive for CSC markør CD133.
In vitro
både CSC
høy og CSC
lave kreft i bukspyttkjertelen celler svarte på hypoksi ved å endre celle morfologi fra en epitelial til en mer fibroblastoid eller mesenchymale fenotype med en høyere prosentandel i CSC
høy celler. Morfologiske endringer forårsaket av hypoksi ble assosiert med nedregulert E-cadherin uttrykk og oppregulert uttrykk for vimentin, og EMT-relatert transkripsjon faktorer Slug, Twist2 og Zeb1 i CSC
lave celler. CSC
høye cellene hadde et protein uttrykk signatur av mesenchymalceller nesten under normoksisk forhold, som eksemplifisert ved lave eller manglende E-cadherin nivåer sammen med høy vimentin uttrykk, som bare var marginalt økt med hypoksi. Denne høyere basal EMT status for CSC
høye celler kan være årsaken til den observerte økte vandrende kapasitet i normoksisk og hypoksiske forhold. Vi antar at pankreatiske stammeliknende tumorceller kan ha en overlevelsesfordel under ugunstige hypoksiske betingelser, ettersom emt har vist seg å bidra til legemiddelresistens i bukspyttkjertelkreft [34]. I tråd med denne forutsetningen, har MIA-PaCa2 og ASPC-en med høye basale EMT egenskaper har vist seg å være mye mer motstandsdyktig mot gemcitabin enn BxPC-3 celler med lave basal EMT funksjoner [34], som også er i overensstemmelse med CSC -lignende fenotype av MIA-PaCa2 og ASPC-en.
Nye immunhistokjemi data bekrefter våre resultater fra double immunfluorescens farging av HIF-1α /Slug co-uttrykk, siden 87% av menneskelige PDA vev av 36 undersøkte var funnet å uttrykke sneglen og viste 50% av pasientene positivt uttrykk for Slug, mens Twist viste ingen eller bare svak ekspresjon [35]. Imidlertid Twist ble sterkt indusert ved hypoksi i MIA-PaCa2, ASPC-1 og CAPAN-1-celler som detektert ved hjelp av RT-PCR [35]. Dette samsvarer med våre funn av Twist2 uttrykk i etablerte og primære PDA celler, noe som var sterkere ved induksjon av hypoksi
in vitro
. En annen interessant rapport styrker betydelig disse dataene siden Twist RNA uttrykk ble funnet å være betydelig høyere i invasive PDAer sammenlignet med matchede ikke-tumor og IPMN prøver [36].
Spørsmålet er hvilke molekylære mekanismer ligger bak den forbedrede EMT funksjoner og trekkende kapasiteter på CSC
høye celler. Spesielt har EMT blitt beskrevet å være avhengig av NF-kB signalisering i kreft i bukspyttkjertelen celler [37]. Siden vi nylig identifisert forbedret NF-kB aktivitet i CSC
høy sammenlignet med CSC
lave celler [32], kan NF-kB være involvert i medie økt trekkende egenskaper CSC
høye celler. En annen kjent underliggende årsaken til den svært invasive vekstmønster på f.eks MIA-PaCa2 celler synes å være at invasjonen er helt klart avhengig av CXCR4 [16]. Siden bukspyttkjertelen cscs fortrinnsvis uttrykke CXCR4 reseptoren og metastaserer hjelp av CXCR4 /SDF-1 akse [16] Dette kan lette forbedret vandrende potensial. Videre er p53 foreslått å regulere EMT og stamcelleegenskaper, og dette kan ha bidratt til den observerte forbedrede vandrende potensialet i CSC
høye cellelinjer, siden MIA-PaCa2, ASPC-en, CAPAN-en og BxPc-3, men ikke CAPAN-2 har mutert p53 [31]. Således tap av p53 korrelerer med en MIR-200c avhengig økning i ekspresjonen av EMT, stemness markører og høy grad av tumor som beskrevet nylig i en kohort av brystsvulster [38]. Ganske på samme måte, inhibering av p53 undertrykker E-cadherin av promoteren metylering som vist i ovarietumorceller [39]. Denne observasjonen er i overensstemmelse med den observerte lav E-cadherin uttrykk i CSC
høye cellelinjer med mutert p53.
Vi antar at den observerte raskere respons på stilk-lignende bukspyttkjertelen tumorceller til hypoksi med oppregulert EMT signalering og høyere vandrende potensial kan bli enda mer uttalt i
in vivo
svulstens mikromiljø. Dette kan skyldes det faktum at i faste tumorer gjentatte episoder av hypoksi, etterfulgt av re-oksygenering er et vanlig fenomen. Denne såkalte «intermitterende hypoksi» er beskrevet for å regulere stilk-lignende egenskaper [40]. Forekomsten av intermitterende hypoksiske episoder varierer betydelig i raskt voksende ondartede svulster [41]. I faser av normoxia når EMT-induserende signalene blir fjernet CSC
lave celler som har blitt overtalt til å EMT kan tilbakestilles til den epiteliale tilstand lignende ved å gjennomgå mesenchymale epitel overgang (MET) som har blitt rapportert å forekomme i enkelte carcinoma celler [20 ], [42]. Flere nye data gir innsikt i hvordan dynamiske samspill mellom epitel, selvfornyelse, og mesenchymale genet programmer bestemme plastisitet av CSC i veksling mellom epitel og mesenchymale tilstander [43]. Disse funnene tyder på at CSC
lave celler kan differensiere til CSC-lignende celler ved induksjon av EMT ved hypoksi og dedifferentiate ved uttak av hypoksi.
