Abstract
Lunge kreft uttrykke kolinerge autokrint loop, noe som letter utviklingen av kreftceller. De antagonister av mAChRs har vist seg å hemme veksten av småcellet lungekreft (SCLCs). I denne studien ment vi å undersøke den veksthemmende virkning av R2HBJJ, en roman muskarin-antagonist, på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler og de mulige mekanismer. Konkurransebindingsprøve avslørte at R2HBJJ hadde en høy affinitet til M3 og M1 AChRs. R2HBJJ presentert en sterk antikolinerg aktivitet på karbakol-indusert sammentrekning av marsvin luftrøret. R2HBJJ markert undertrykket vekst av NSCLC-celler, slik som H1299, H460 og H157. I H1299-celler, både R2HBJJ og dens ledende forbindelse R2-PHC vist betydelig anti-proliferativ aktivitet som M3-reseptorantagonist darifenacin. Eksogene Replenish av ACh kunne dempe R2HBJJ-indusert veksthemming. Dempe M3 reseptoren eller prate med spesifikke-sirnas resulterte i en veksthemming på 55,5% og 37,9% på H1299 cellene 96 timer etter transfeksjon, henholdsvis. Videre undersøkelser viste at behandling med R2HBJJ arrestert cellesyklus i G0 /G1 ved nedregulering av cyclin-D1 CDK4 /6-Rb. Derfor er denne studien viser at NSCLC-celler uttrykker en autokrin og parakrin cholinergiske system som stimulerer veksten av NSCLC-celler. R2HBJJ, som en roman mAChRs antagonist, kan blokkere den lokale kolinerge løkke ved å motvirke overveiende M3 reseptorer og hemmer NSCLC cellevekst, noe som tyder på at M3 reseptor antagonist kan være en potensiell kjemoterapeutisk regime for NSCLC
Citation. Hua N Wei X, Liu X, Ma X, Han X, Zhuo R, et al. (2012) A Novel Muscarinic antagonist R2HBJJ hemmer ikke-småcellet lungekreft cellevekst og arrestasjoner cellesyklus i G0 /G1. PLoS ONE 7 (12): e53170. doi: 10,1371 /journal.pone.0053170
Redaktør: Michihiko Kuwano, Kyushu University, Japan
mottatt: 14. august 2012; Godkjent: 26 november 2012; Publisert: 28.12.2012
Copyright: © 2012 Hua et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis, og antallet tilfeller og dødsfall relatert til lungekreft er på vei oppover i mange deler av verden. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for nesten 80% av alle tilfeller av lungekreft. Til tross for aggressiv innsats, behandlinger er utilfredsstillende og overlevelse forbli sturen ( 20%) [1]. Derfor er ytterligere forståelse av biologi NSCLC og utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for lungekreft nødvendig behandling.
Acetylkolin (ACH) er et viktig signalstoff i de sentrale og perifere nervesystemet og spiller viktige roller i å lære, hukommelse, autonom styring, og muskelkontraksjon via aktivering av acetylcholin-reseptorer (AChRs), inkludert den muskariniske (mAChRs) og nikotiniske (nAChR). Nylig har det blitt funnet at ACh er også vidt syntetiseres ved hjelp av en rekke ikke-nevronale celletyper, inkludert luftveis epitelceller [2], lunge pleura [3], tynn- og tykktarm, galleblæren, keratinocytter [4], gliaceller [5], vaskulær endotel [6] og mest vanlige kreftceller som for eksempel NSCLC, småcellet lungekreft (SCLC), tykktarmskreft, glial og ovariekarsinomer [7]. Den utbredte uttrykk for ikke-nevronale acetylkolin er ledsaget av den allestedsnærværende tilstedeværelse av choline acetyltransferase (chat), cholinesterase og (nAChR, mAChRs). Selv om den primære funksjon klarlagt ufullstendig, vises ikke-neuronal acetylkolin for å være involvert i reguleringen av viktige cellefunksjoner, for eksempel celledeling, trofiske funksjon, automatikk, bevegelse, ciliær aktivitet, celle-celle kontakt, cytoskjelettet, samt barriere og immun funksjoner [7] – [9]. Derfor er den ikke-nevronale kolinerge system og acetylkolin, som virker som en lokal autokrine og parakrine hormon, bør skjelnes fra den neuronale kolinerge system og neuronal acetylkolin.
På samme måte stimulerer ikke-neuronal ACh cellevekst gjennom enten muskarine kolinerge eller nikotin kolinerge baner. Det har blitt rapportert at veksten av tumorceller ble akselerert via aktivering av mAChRs i tykktarmen [10], lunge [11] – [12], glial [13], og prostata [14]. I eggstokkene karsinomer, uttrykk for mAChR korrelerer med dårlig prognose [15]. Song
et al
rapportert at avbrytelse av autokrin muskarine kolinerge signalering med M3-reseptor-antagonist-1,1-dimetyl-4-diphenylacetoxypiperidinium jodid (4-DAMP) eller darifenacin har potensiale til å hemme SCLC-cellevekst både
i vitro Hotell og
in vivo product: [16]. I tillegg har mange forskere vist at aktivering av nAChR-er av nikotin eller dets kreftfremkallende derivatet 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK) stimulerte tumorceller vekst i bryst [17], lunge [18 ], pleural mesothelioma [19], tykktarm [20], blære [21] og livmorhalskreft [22]. Disse studiene har vist at a7 er hoved nAChR subenheten som medierer de proliferative effektene av nikotin i kreftceller.
Penehyclidine hydroklorid (PHC) er en anti-kolinerge stoff hentet fra hyoscyamin og utviklet uavhengig av vårt institutt. Som dens potensial antikolinerg aktivitet, har det vært markedsført for behandling av akutt forgiftning fosfororganiske pesticider og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) [23] – [24]. PHC er en racemisk forbindelse med to kirale sentre, som utgjør fire optiske isomerer (Fig. 1). Vår tidligere arbeid avdekket at isomer med R, R»-konfigurasjon (R2-PHC) viser den høyeste antikolinerg aktivitet. For å redusere bivirkningene ved å trykke tilgang til sentralnervesystemet, er en ny antikolinergisk middel (R2HBJJ) utformet ved å innføre et kvaternært ammoniumsalt gruppe til R2-PHC-molekylet for behandling av perifere sykdommer, for eksempel lunge cancer og COPD. I denne studien, er selektiviteten av R2HBJJ for M1-M5 reseptorer evaluert i detalj og antitumor aktivitet av R2HBJJ på NSCLC cellelinjer
in vitro Hotell og dets potensielle mekanismer er utforsket. Så vidt vi vet, er dette den første studien å undersøke effekten av M3 antagonist på NSCLC celler.
Resultater
R2HBJJ vises høyere selektiv affinitet til M
3 og M
1 reseptorsubtypene
Saturation bindende analyse ga affinitet bindende konstant (K
D) verdier for [
3H] NMS på menneskelig M1, M2, M3, M4 og M5 på 0,29 ± 0,04, 0,81 ± 0,17, 0,53 ± 0,09, 0,19 ± 0,03 og 0,48 ± 0,13 nM, respektivt. Den relative selektivitet for M1-M5 AChR subtyper av R2HBJJ ble først bestemt ved nivået for reseptor-bindingsaffinitet på humane mAChRs proteiner (Fig. 2). Verdiene av IC
50 og K
i av R2HBJJ inhibering av [
3H] NMS binding til M1-M5 reseptorundertyper ble oppsummert i Tabell 1. R2HBJJ utviste en relativ høyere affinitet for M3 og M1-reseptoren enn M2 reseptoren. Rangeringen av affinitet R2HBJJ for fem forskjellige mAChRs var M3 M1 M4 M5 . M2
mAChRs proteiner ble inkubert med [
3H] -NMS ved 37 ° C i 2 timer i fravær og nærvær av økende konsentrasjoner av R2HBJJ. Data representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
R2HBJJ hemmet karbakol-indusert tracheal sammentrekning
For å bestemme blokkerende effekt av R2HBJJ på mAChR, en ex vivo modell av marsvin tracheal sammentrekning ble brukt. Sammentrekning av tracheal strip isolert fra marsvin ble indusert ved en uM karbakol, en ikke-selektiv muskarin agonist. Og så, økende konsentrasjoner av R2HBJJ (10
-10 til 10
-6,5 M) eller atropin som en kontroll antagonist, ble tilsatt kumulativt i organbadet. Den inhibitoriske konsentrasjon respons mot karbakol-induserte kontraksjon ble oppnådd. Resultatene viste at R2HBJJ konsentrasjonsavhengig inhibert de sammentrekkende responser hos guinea-gris tracheae til karbakol (fig. 3). Den 50% inhiberingskonsentrasjon (IC
50) var 7,58 ± 1,05 nM, noe som var statistisk signifikant mindre enn for atropin (10,21 ± 1,04 nM,
P
0,05). Dataene viste at R2HBJJ viste en kraftig antagonistisk aktivitet på mAChRs uttrykt i marsvin luftrøret.
Karbakol (1 mm) ble brukt til å indusere kontraktile respons. Etter dette ble de angitte konsentrasjoner av R2HBJJ eller atropin tilsatt kumulativt til organbadet, og de inhiberende konsentrasjonsrespons mot karbachol-induserte kontraksjon ble oppnådd. Verdiene ble uttrykt som prosentandeler av den maksimale kontraktile respons i fravær av antagonist. Hvert punkt representerer middelverdien ± SD av fem uavhengige eksperimenter.
NSCLC cellelinjer uttrykte kolinerge reseptorer og choline acetyltransferase
Hvis en kolinerge autokrint sløyfe er funksjonell i NSCLC, da cellene må uttrykke choline acetyltransferase (chat), til mAChRs og /eller nAChR for ACh gi autokrint cholinergic stimulering til NSCLC cellevekst. For å avgjøre om NSCLC cellelinjer uttrykke AChRs og prate, det mRNA av fem undergrupper av mAChRs (M1-M5), tre undergrupper av nAChR (α7, α9 og α10) og Chat ble undersøkt ved RT-PCR i humane NSCLC-cellelinjer H1299, H157, H460, A549 og menneskelig udødelig bronkiene epitelceller BEP2D. Som vist på fig. 4, M1, M2, M5, α7, α9, α10 reseptorsubtypene og chatte ble nesten uttrykt i alle NSCLC celler testet. M3 reseptor subtype ble uttrykt i H1299, H157and H460, og var fraværende i A549. M4-reseptor subtype ble uttrykt i H1299 og H157, men ikke i H460 og A549. I kontrast, uttrykte menneskets udødelig bronkiene epitelcelledifferensiering BEP2D de mRNA av ulike AChRs undergrupper i lavere nivåer, med unntak av α10 subtype og chat. Resultatene antyder en acetylkolin autokrint sløyfe eksisterende hos NSCLC celler.
RT-PCR ble utført på total RNA forberedt fra de angitte cellelinjer. Primere ble beskrevet i Tabell 3. GAPDH ble brukt som lasting kontroll.
R2HBJJ hemmet NSCLC celledeling in vitro
For å evaluere effekten av R2HBJJ på cellevekst av NSCLCs, cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner av R2HBJJ (1,6 til 100 uM) i 72 timer og cellelevedyktigheten ble bestemt ved å bruke sulforhodamin B (SRB) assay. Resultatene viste at behandling med R2HBJJ markert undertrykket cellevekst på en konsentrasjonsavhengig måte i H1299, H460 og H157-celler, med en 50% vekst-inhibitorisk konsentrasjon (GI
50) på 8,5, 8,8 og 28,5 uM, respektivt. Til sammenligning, A549 og BEP2D celler var resistente mot R2HBJJ, med en GI
50 på mer enn 100 uM, den høyeste konsentrasjonen testet (Fig. 5A). Dataene antydet at den anti-proliferative effekt av R2HBJJ var avhengig av egenskapene til cellelinjer og ikke den ikke-selektive cytotoksisitet.
Effekter av R2HBJJ på humane NSCLC-cellelinjer og humane bronkier immortalisert epitelcelle BEP2D (A ) og virkninger av mAChR og nAChR antagonister på H1299 cellelinjer (B og C, henholdsvis). Cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av R2HBJJ eller cholinergiske reseptor antagonister for 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved SRB-analysen. Celler behandlet med oppløsningsmiddel (DMSO) ble anvendt som en kontroll, med levedyktighet satt ved 100%. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Videre er effekten av andre mAChRs (fig. 5B) og nAChR-er (fig. 5C) ble observert antagonister på H1299. Som vist på fig. 5B og 5C, de kjente selektive M3 mAChR antagonister darifenacin signifikant inhiberte H1299 celleproliferasjon på en konsentrasjonsavhengig måte, mens den ikke-selektive mAChR antagonist atropin, ikke-selektiv nAChR antagonist mekamylamin, selektiv M1 mAChR antagonist pirenzepin, selektiv α4β2 /α4β4 antagonist DhβE, og selektive α7 antagonist α-bgt hadde ingen åpenbare effekter på cellevekst. M2 /M4-selektiv antagonist AF-DX116 hadde også inhibering av celleproliferasjon ved den høyeste konsentrasjonen testet. Til sammenligning R2HBJJ og dets parentale forbindelse R2-PHC inhiberte signifikant H1299 celleformering i en konsentrasjonsavhengig måte, som inhibitorisk potens var omtrent 3,7 ganger større enn den av darifenacin, den beste blant de antagonister som ble testet ovenfor. Fordi ingen eksogene AChR agonist ble brukt, dataene viste at endogen ACh fungerte som en autokrin vekstfaktor signalering i humane NSCLC-celler, blant annet gjennom aktivering av M3 reseptoren.
Eksogene AChR agonist dempes R2HBJJ-indusert veksthemming
For å bestemme sammenhengen mellom kolinerge signalveier og R2HBJJ-indusert veksthemming, ble eksogene AChR agonist ACh brukt. Effektene av ACh på veksten av H1299 og på R2HBJJ-indusert veksthemming ble observert. Det ble funnet at eksogent ACh alene ved 1, 10 og 100 uM i 72 timer hadde ingen signifikant effekt på H1299 cellevekst (tabell 2). R2HBJJ alene ved 10 uM og 20 uM redusert cellelevedyktighet fra 100 ± 1,61% til 54,13 ± 3,89% og 23,23 ± 2,14% (n = 3), henholdsvis. Når ACh ble administrert før R2HBJJ behandling, veksthemming indusert av R2HBJJ (både 10 og 20 uM) ble atttenuated i nærvær av eksogent ACh på en konsentrasjonsavhengig måte. To-veis analyse av varians (ANOVA) viste en siginificant effekt av R2HBJJ behandling, ACh behandling, og behandling R2HBJJ x ACh behandling interaksjon (
P
0,0001, henholdsvis). Post-hoc tester bekreftet at de følgende forbehandling konsentrasjoner av ACh, 10 uM og 100 uM, betydelig dempet veksthemmende indusert ved 10 uM eller 20 uM av R2HBJJ. Sammenlignet med R2HBJJ behandling alene på nivå med 10 uM, 10 uM og 100 uM av ACh-behandling økte cellenes levedyktighet fra 54,13 ± 3,89% til 82,29 ± 5,82% (
P
0,01) og 91,1 ± 3,65% (
P
0,01), henholdsvis. Sammenlignet med R2HBJJ behandling alene på nivå med 20 uM, 10 uM og 100 uM av ACh-behandling økte cellenes levedyktighet fra 23,23 ± 2,14% til 35,57 ± 4,48% (
P
0,05) og 58,55 ± 2,83% (
P
0,01)., (Tabell 2)
M3 og chat spesifikke sirnas redusert kreftcelle spredning
For ytterligere å demonstrere at endogen ACh og M3 reseptoren signal var involvert i celle spredning av humane NSCLC-celler, ble H1299 celler transfektert med M3 eller chat-spesifikke sirnas og deres spredning ble observert over tid. For det første, ble western blot-analyse for å identifisere nivåene av disse gener. Som vist på fig. 6A og 6B, M3 og prate proteinnivåer ble sterkt redusert 72 timer etter transfeksjon med målretting siRNAs i forhold til den negative kontrollen siRNA. Ved å bruke SRB analyse ved 96-brønns plate, styrken av veksthemming forårsaket av stanse M3 eller chat ble testet på 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon. Resultatet viste at det var en tidsavhengig reduksjon av cellevekst levedyktighet av M3 eller chat-siRNA i H1299 celler i forhold til den negative kontrollen siRNA (Fig. 6C). Den anti-proliferativ effekt stanse M3 ble visualisert tydeligvis tidlig på 48 timer etter transfeksjon (
P
0,01) og hemming av 55,5% ble oppnådd innen en 96 timers tidsramme (
P
0,001). For chat-siRNA, var dens anti-proliferativ effekt presentert på 72 timer etter transfeksjon (
P
0,001), som var tregere enn M3 siRNA; og hemming av 37,9% ble oppnådd 96 timer etter transfeksjon i forhold til den negative kontrollen siRNA (Fig. 6C,
P
0,001).
nedregulering av M3 og chatte protein var påvises ved western blot 72 timer etter transfeksjon av 200 nM sirnas (A og B). Celler ble inkubert i nærvær av 200 nM siRNA for 48, 72 og 96 timer, etter dette ble cellevekst levedyktighet bestemt ved anvendelse av SRB-analysen og sammenlignet med mock-kontroll.
**
P
0,01,
***
P
0,001, sammenlignet med negativ kontroll siRNA transfekterte celler på samme tidspunkt (C). Etter M3 eller negativ siRNA transfeksjon, ble cellene behandlet med eller uten R2HBJJ (8 uM og 16 uM) i 72 timer og kombinasjonen virkningen av M3 siRNA knockdown og R2HBJJ behandling på celleveksten ble undersøkt ved hjelp av SRB-analysen.
#
P
0,05,
##
P
0,01, sammenlignet med de negative siRNA transfekterte celler behandlet med løsemiddel. (D). Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
For ytterligere å vurdere om den anti-proliferativ effekt av R2HBJJ var M3 reseptoren bestemt, H1299 celler ble behandlet med R2HBJJ etter M3 siRNA transfeksjon. Resultatet viste at i negative siRNA behandlede celler, R2HBJJ viste signifikant hemming av cellevekst, celle levedyktighet var 83,5% (
P
0,05) og 57,4% (
P
0,01) etter R2HBJJ 8 mikrometer og 16 mikrometer behandling. Men etter at cellene ble behandlet med M3 siRNA ble cellelevedyktigheten hemmet til 54,4%; R2HBJJ (8 mikrometer og 16 mikrometer) ikke lenger påvirke cellevekst, noe som antydet at stanse M3 reseptoren fratatt mobil følsomhet for R2HBJJ og fremhevet rollen M3 i effekten av R2HBJJ (Fig. 6D).
R2HBJJ arrestert cellesyklus i G0 /G1 fase
å utforske mulige mekanismer for R2HBJJ-indusere celledød i NSCLC celler, ble observert effekten av R2HBJJ på cellesyklusprogresjon ved hjelp av flowcytometrisk analyse. Resultatene fra H1299-celler viste at prosentandelen av G0 /G1 fase økes fra 40,35% til 76,60%, og den til S-fasen ble redusert fra 46,14% til 15,93%, etter behandling med 20 uM R2HBJJ i 72 timer (fig. 7A). Videre H1299 celler behandlet med en rekke R2HBJJ (2,5 til 20 uM) i 48 timer oppviste også betydelig arrest i G0 /G1 fase, med en prosentvis økning fra 39,60% til 70,01% (fig. 7B). I tillegg ble samme resultat oppnådd i H157-cellelinjen, med en prosentvis økning i G0 /G1 fase fra 55,04% til 65,46% i forhold til konsentrasjonen (Fig. 7C). Resultatene indikerte at R2HBJJ markert undertrykket i cellen mitotisk progresjon i tidsavhengig og konsentrasjonsavhengig oppførsel gjennom stansende celler i G0 /G1 fase og avtagende DNA-syntese.
Cellene ble synkronisert med 1% FBS i 24 timer . Etter dette ble cellene frigjort i fullstendig medium (10% FBS) inneholdende 20 uM R2HBJJ for 24, 48, 72 timer (A, H1299-celler) eller forskjellige konsentrasjoner av R2HBJJ (2,5 til 20 uM) i 48 timer (B, H1299 celler; C, H157-celler). Celler behandlet med oppløsningsmiddel (DMSO) ble anvendt som en kontroll. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved hjelp av strømningscytometrisk analyse. Histogrammene som vises her var representative for tre forsøk.
R2HBJJ nedregulert nivåene av cellesyklusregulerende proteiner og Rb fosforylering
Cellesyklus overgangen fra G1 til S er hovedsakelig aktiveres av to forskjellige kinase kompositter: cyklin D1 /CDK4, 6, og cyklin E, A /CDK2. Rb er det primære substrat for cyklin D-avhengig kinase og spiller en nøkkelrolle i nettverket av cellesyklusregulering. For å undersøke de underliggende molekylære mekanismer for G0 /G1 rest indusert av R2HBJJ, ble den tidsavhengige endring av flere beslektede cellesyklusregulerende molekyler undersøkt etter behandling med 20 uM R2HBJJ på H1299-celler ved hjelp av western blot-analyse. Som vist på fig. 8A, behandling med R2HBJJ indusert dramatisk nedregulering av cyclin D1, CDK4 og CDK6 proteiner tidsavhengig, mens nivåene av cyklin E og CDK2 forble stort sett uforandret i løpet av samme periode. Dessuten ble fosforyleringen av Rb (spesielt ved Ser
807/811) ble redusert tidsavhengig. Reduksjonen av Rb-fosforylert ved posisjonen til Ser
807/811 fant sted så tidlig som 3 timer etter behandling og før tilsynelatende celleviabilitet endring. I motsetning til ekspresjonen av basal Rb viste en betydelig vedvarende økning og deretter hurtig falt til et ikke målbart nivå ved 48 timer etter behandling når celleveksthemming er blitt indusert (data ikke vist), hvilket indikerer en potensiell cellulær tilpasning til reduksjon av fosforylert Rb etter R2HBJJ behandling. Videre vi evaluert konsentrasjonsrespons av Rb-fosforyleringen redusert etter behandling med R2HBJJ i 48 timer (fig. 8B). Resultatet viste at nedgangen av Rb fosforylert ved Ser
807/811 ved R2HBJJ var konsentrasjonsavhengig og skjedde ved den laveste konsentrasjonen testet (1,25 mm). Konsekvent, ble den nedregulering av Cyclin D1, CDK4 og CDK6 proteiner observert i celler behandlet med økende konsentrasjoner av R2HBJJ. Tilsvarende ekspresjon av basal Rb viste en signifikant økning i forhold til konsentrasjonen i begynnelsen, og deretter hurtig redusert til basalnivået. Sammen viser disse resultater antydet at Rb proteinet og kinase kompositt av cyclin D1 /CDK4, 6 var hovedsakelig involvert i den cellulære G0 /G1 rest indusert av R2HBJJ.
H1299-celler ble behandlet med 20 uM R2HBJJ for den indikerte ganger (3-60 h, A) eller med forskjellige konsentrasjoner av R2HBJJ (1,25 til 20 uM) i 48 timer (b). Cellelysatene ble deretter underkastet Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som lastkontrollen.
diskusjon
Mange studier har vist at ACh og andre komponenter av kolinerg signalering, deriblant ChAT, cholinesterase, M og N kolinerge reseptorer, er tilstede i en rekke ikke-neuronale vev, inkludert de fleste vanlige kreftceller som for eksempel NSCLC, SCLC, tykktarm, glial, bryst- og eggstokk-karsinom. I det lokale miljøet av svulster, kan konsentrasjonene av ACh på overflatereseptorer være enda høyere på grunn av høy celletetthet i faste masser, økt sekresjon av ACh nærhet til reseptoren plassering og reduserte nivåer av cholinesterase i NSCLC [26], noe som impliserer at kolinerg signale kan økes ytterligere. Den ikke-neuronal kolinerge system og ACh, som en lokal cellulær vekst signalering, spiller en rolle i utvikling og progresjon av kreft, og representerer en potensiell ny vei for å målrette tumorvekst. Derfor kolinerge antagonister avbryte oppregulert autokrint signale kan gi en rettet oppstrøms tilnærming til å blokkere proliferativ veien.
R2HBJJ, som et derivat av antikolinerg agenten R2-PHC, ble syntetisert ved vårt institutt. I denne studien, vurderte vi selektivitet R2HBJJ for M1-M5 muskarine reseptorer og dens antikolinerg aktivitet. Vi har også bestemt om avbrudd av endogen kolinerge signalering med R2HBJJ har potensial til å hemme NSCLC vekst
in vitro
.
Våre resultater viser at R2HBJJ hadde signifikant høyere affinitet for M3 og M1 reseptorsubtypene enn M2 subtypen som antydet færre M2-reseptor-assosiert kardiovaskulære bivirkninger. Rangeringen av affinitet R2HBJJ for fem forskjellige mAChRs var M3 M1 M4 M5 M2. Resultatet er i overensstemmelse med den som oppnås i dets parentale forbindelse PHC før [27]. I den funksjonelle undersøkelse, R2HBJJ hemmet de sammentrekkende responser hos guinea-gris tracheae til karbakol i en konsentrasjonsavhengig måte. Den inhiberende aktivitet var sterkere enn den til mAChR antagonist, atropin.
Song
et al
rapportert at SCLC syntetisere og utskille acetylcholin, som fungerer som en autokrin vekstfaktor gjennom både nikotin og muskarine cholinergiske mekanismer [16]. Vår studie belyst humane NSCLC cellelinjer, som SCLC, uttrykke både M og N AChRs, så vel som chat, noe som tyder på at en funksjonell fundament av kolinerge autokrint sløyfe er til stede i NSCLC. Derfor er den vekstinhibitoriske aktivitet av R2HBJJ på flere NSCLC-cellelinjer, blant annet H1299, H460 og H157-celler, kan være mediert av både M og N cholinergiske mekanismer. Men da H1299-celler ble behandlet med kjente selektive eller ikke-selektive antagonister på M- og N-reseptorer
in vitro
, har vi funnet at bare M3-reseptorantagonist darifenacin presenterte en signifikant inhibering av cellevekst. Tiden våre forbindelser R2HBJJ og R2-PHC også markert hemmet cellelevedyktigheten til H1299-celler, med en foretrukket virkning enn darifenacin. I studiet av Song
et al
, behandling av SCLC celler med M3-reseptorantagonister av 4-DAMP eller darifenacins hemmet cellevekst både
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre resultater tyder på at M3-reseptorantagonister har inhiberende aktivitet på NSCLC også. Den anti-proliferative effekt av R2HBJJ på NSCLC kan være relatert til dets selektive M3-reseptor antagonistisk aktivitet. Russo P
et al
rapportert at hemming av α7-nAChR med en kraftig høy affinitet antagonist α-CBT indusert antitumoraktivitet i NSCLC og pleural mesothelioma ved å utløse apoptose [18] – [19]. Men i vår etterforskning, ble en annen α7-nAChR antagonist α-bgt brukes til å behandle H1299 celle og effekten på cellen levedyktighet ble ikke observert, noe som antydet at α7-nAChR signale kanskje ikke den primære mediator i H1299 cellevekst.
i denne studien har vi ikke klart å observere den proliferative effekten av eksogent ACh på H1299 celler, noe som kan innebære at endogen ACH har gitt nok stimulerende effekt på celleproliferasjon. Imidlertid er eksogen etterfylle av ACh er nødvendig for å antagonisere konkurransedyktig inhibering av R2HBJJ på H1299-celler. Resultatet understreker at effekten av R2HBJJ på H1299 cellevekst ble oppnådd via innvirkning på endogen ACh signalering. I denne studien ble ChAT siRNA vist seg å hemme cellevekst, noe som ytterligere støttet denne hypotesen. Dessuten er det bemerkelsesverdig at behandling med M3-reseptor siRNA resulterte i en signifikant vekstinhibering på H1299-celler sammenlignet med negativ kontroll siRNA behandlede celler. Styrken på inhibering oppnådd 50% eller mer i løpet av en 96 timers tidsperiode. Når M3 reseptoren ble effektivt slått ned i H1299 celler, celler lossed deres følsomhet for R2HBJJ. Resultatene ytterligere aksentuert rolle M3 i den anti-proliferative effekt av R2HBJJ.
Cell syklus-stans er en viktig mekanisme for å forebygge tumorvekst. Våre resultater fra flowcytometrisk analyse viste at R2HBJJ markert trykt cellen mitotisk progresjon gjennom arrestere celler i G0 /G1 fase. Cellecyklus overgang fra G1 til S styrer DNA-syntese og krever hyperfosforylering av en tumor suppressor, Rb [28]. I syklusen prosessen, den katalytiske aktivitet av cyclin D1 assosiere med CDK4 /6 først blir manifestert ved midten av G1, øker til et maksimum ved den G1 /S overgang og bidrar til G1 utgang. Mens cyclin E og cyklin A assosiere med CDK2 blir aktivert ved G1 /S overgang eller i tidlig S-fase, respektivt. Fosforylering av Rb er i utgangspunktet utløst av aktive Cyclin D1-CDK4 /6 komplekser og senere akselerert av Cyclin E-CDK2. Denne fosforyleringen muliggjør dissosiasjon av transkripsjonsfaktorer, for eksempel E2 promoter-bindende faktor (E2F) og proto-onkogen c-Abl overexpressed eller mutert i et antall av maligne tumorer, som kan transactivate S-fase gener som koder for proteiner som forsterker G1-til-S-fasevender og er nødvendig for DNA-replikasjon [29]. Av cellesyklus proteiner undersøkt i denne studien, er uttrykk for cyclin D1, CDK4 og CDK6 proteiner var nedregulert tidsavhengig, mens nivåene av cyclin E og CDK2 ikke ble påvirket i betydelig grad. Videre fosforyleringen av Rb ved posisjonen til Ser
807/811 ble inhibert med R2HBJJ tidsavhengig, noe som kunne avskaffe interaksjonen mellom c-Abl og Rb og forsinker aktivering av c-Abl og cellesyklusprogresjon [ ,,,0],30]. Sammen våre data antydet at Rb protein og kinase sammensatt av cyclin D1 /CDK4, 6 var hovedsakelig involvert i cellulære G0 /G1 arrest indusert av R2HBJJ. Resultatene har også antydet at R2HBJJ utøvde sin forsinkende effekt på den tidlige fasen av G0 /G1.
Faktisk regulatoriske molekyler som regulerer tidlig cellecyklusprogresjonen som cyclin D1-CDK4 /6-Rb er hyppige mål for genetiske endringer i en usedvanlig høy andel av lungekrefttilfellene [31]. Mange studier har vist at strategier for å målrette proteiner forbundet med begynnelsen av cellesyklusprogresjon og G1 restriksjonspunktet kan være nyttige i anticancerterapi [32] – [33]. Cyclin D1 har også vist seg å være en nedstrøms mål av flere signaltransduksjonsveier som medieres av slike onkogener som Neu, Ras, og β-catenin. En fersk studie støtter løftet om co-targeting Cyclin D1 som en forutsigbar og tilpasse tilnærming for lungekreft forebygging og behandling [34]. Videre ACh som virker gjennom mAChR har vist seg å føre til celle-proliferasjon ved aktivering av MAPK, ERK1 /2 og regulering av cellesyklusutvikling [11], [16]. Våre upubliserte data viste også at tidlig apoptose var involvert i anti-proliferativ effekt av R2HBJJ, men de underliggende mekanismene gjensto å bli ytterligere utforsket.
I konklusjonen, denne studien viser at NSCLC celler uttrykker en autokrint og parakrint kolinerge system som stimulerer veksten av NSCLC-celler. R2HBJJ, en roman muskarin-antagonist, kan blokkere den lokale cholinergisk sløyfen ved å antagonisere overveiende M3-reseptorer og hemmer NSCLC cellevekst. Mekanismen for R2HBJJ-indusert cellesyklus G0 /G1 rest innebærer nedregulering av cyclin-D1 CDK4 /6-Rb. Resultatene tyder på at M3-reseptorantagonister muligens bli en ny potent kjemoterapeutisk regime for NSCLC.
Materialer og metoder
Material
Radiomerket forbindelsen [
3H] N-metylscopolamin ([
3H] NMS), ble human muskarin reseptor (M1, M2, M3, M4 og M5) proteiner og Betaplate Scint av membran hentet fra Perkin Elmer Life and Analytical Sciences. R2-PHC og R2HBJJ (kjemiske strukturer er vist i Fig. 1) ble syntetisert ved vår institutt. De kjemiske strukturer ble bekreftet ved kjernemagnetisk resonansspekteranalyse. Atropin, pirenzepin, mekamylamin, α-bungarotoxin (α-BGT), karbakol, og ACh ble kjøpt fra Sigma. Dihydro-β-erythroidine hydrobromide (DhβE) og AF-DX116 ble kjøpt fra Tocris. Darifenacin ble kjøpt fra Beijing Huafeng forente Technology. Antistoffer brukes for western blotting ble kjøpt fra Cell Signaling for retinoblastom tumor suppressor protein (Rb), fosfor-Rb (Ser
780 og Ser
807/811), Cyclin D1, Cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6. M3-AChR ble hentet fra Santa Cruz. Chat, β-aktin, ble geit anti-kanin og geit anti-mus immunoglobulin merket med pepperrot peroksidase kjøpt fra Beijing Zhongshan Jinqiao bioteknologi.
Radioligand bindingsanalyse
Saturation bindingen ble utført ved hjelp av en rekke
