Abstract
Homeobox D10 (HoxD10) spiller viktige roller i differensiering av embryonale celler og progresjon av brystkreft. Vår tidligere rapport avslørte at insulinlignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP3) ble regulert ved HoxD10 i magekreftceller; Men de funksjonelle roller og underliggende mekanismer for IGFBP3 i magekreft fortsatt uklare. Her fant vi at uttrykket av IGFBP3 ble oppregulert etter ektopisk uttrykk for HoxD10 i mage kreftceller. Chromatin immunoprecipitation analysen viste at HoxD10 bundet til tre potensielle regioner i IGFBP3 promoter. Eksogent HoxD10 forbedret aktivitet av luciferase reporter som inneholder disse bindingsområder i magekreftceller i betydelig grad. Ytterligere data viste at alle disse bindingssteder hadde Hox bindende element «TTAT». Immunhistokjemisk farging Resultatene viste at IGFBP3 ekspresjon ble betydelig nedregulert i 86 mage-adenokarsinomer vev i forhold til deres tilstøtende ikke-cancervev (p 0,001). Dessuten, IGFBP3 ekspresjon var signifikant lavere i gastrisk tumor med lymfeknutemetastase, sammenlignet med det uten lymfeknutemetastaser (p = 0,045). Pasienter med høyt uttrykk nivå av IGFBP3 viste gunstig fem års total overlevelse (p = 0,011). Knockdown av IGFBP3 akselerert magekreft celle migrasjon og invasjon og indusert uttrykk for invasive faktorer, inkludert MMP14, uPA og uPAR. Dermed våre data tyder på at HoxD10 målrettede genet IGFBP3 kan undertrykke magekreft celle invasjon og favoriserer overlevelse av magekreftpasienter
Citation. Xue M, Fang Y, Sun G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, en Transkripsjonell Target av Homeobox D10, er korrelert med Prognose av magekreft. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10,1371 /journal.pone.0081423
Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 21 juni 2013; Akseptert: 13. oktober 2013, Publisert: 27.12.2013
Copyright: © 2013 Xue et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81302070, 81272678, 81071961) (https://www.nsfc.gov.cn), National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) og forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde hyppigste kreft og for tiden er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Nesten halvparten av mage Caner pasienter har allerede avansert til sent stadium med lymfatisk eller fjernmetastaser ved diagnose og miste muligheten for kirurgi [2]. Disse pasientene har en dårlig utfall og fem-års overlevelse for de med fjernmetastaser er mindre enn 5% [3]. Progresjonen av magekreft er ansett for å være en flertrinnsprosess som involverer aktivering av onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener. Vi har tidligere presentert som homeobox D10 (HoxD10) fungerte som en tumor suppressor ved å undertrykke tumorvekst og invasivitet, som ble epigenetiske stilnet i magekreft [4].
HoxD10 genet tilhører homeobox super, som koder for transkripsjonsfaktorer og utøve funksjoner i hovedsak gjennom aktivering eller undertrykkelse av nedstrøms målgener [5]. Amino-terminal arm av Hox homeodomain har flere kjernekonsensus bindende elementer, inkludert TTAT, TAAT og TTAC [6,7]. For eksempel, HoxC8 binder seg til disse elementene i promotorområdene og modulerer den transkripsjonelle aktivitet av pedf, NCAM, Zac1, Opn og Cdh11, som bestemt ved høy i hele kromatin immunoutfellingsstudier analyser og global HoxC8 DNA-bindingssetet analyse [7]. Studier har vist at HoxD10 hemmer angiogenese og cellemotilitet i livmorkreft (EF) [8] og svekker celle invasivitet av mage og brystkreft [4,9]. Men lite er kjent om mekanismene for hvordan HoxD10 utøver sine funksjoner i kreftutvikling og tumorprogresjon. Vi har systematisk vist de potensielle mål for HoxD10 av cDNA microarray og identifisert flere gener, inkludert insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP3) som kan være ansvarlig for den tumor undertrykke effekten av HoxD10 i magekreft [4].
IGFBP3 er en stor IGFBP arter i omløp, innbinding over 75% av sirkulerende insulin vekstfaktor-I (IGF-I) [10]. Det kan hemme celledeling og indusere celle apoptose av flere typer kreft, inkludert prostata og mage kreft [11,12]. Flere studier har bekreftet at IGFBP3 undertrykker invasivitet av livmorkreft (EF) celler [13], metastase i prostata kreft [14], og angiogenese i hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) [15]. Det var generelt ansett at IGFBP3 kunne blokkere bindingen region av IGF-I på sin reseptor IGF-IR, således oppheve virkningen av IGF /IGF-IR akse. Foruten avhengighet av IGF /IGF-IR akse, eksisterer det alternative IGF /IGF-IR uavhengige og nukleære trans måtene [10]. Mange faktorer er avklart å regulere uttrykket av IGFBP3, inkludert retinsyre, tumornekrosefaktor-α, trichostatin A, haletypen homeobox 2 (CDX2) og metylering status for seg selv [10,16]. Våre tidligere studier viste at IGFBP3 ble oppregulert i AGS og MKN28 celler overekspresjon HoxD10 [4]. Vurderer promoter regionen IGFBP3 har flere potensielle bindingssteder for HoxD10, spådd av PROMO, et program for prediksjon av transkripsjonsfaktor bindingssteder [17], HoxD10 kanskje direkte samspill med IGFBP3 i regulering av magekreft celle invasjon. Opplysning av dette nettverket vil gi ytterligere innsikt i rollen som IGFBP3 i magekreft.
I denne studien identifiserte vi at HoxD10 kan direkte binde promotorområdene av IGFBP3 potensielt via TTAT element, og dermed transcriptionally regulerer sitt uttrykk i magekreft. I tillegg er ekspresjonsnivået av IGFBP3 ofte nedregulert i magekreft vev og relatert til den totale overlevelse, noe som tyder på at IGFBP3 spiller en viktig rolle i magekreft progresjon. Funksjonelt, IGFBP3 kunne undertrykke migrering og invasjon av magekreftceller, i det minste delvis, gjennom regulering av de invasive faktorer, blant annet metalloproteinase-14 (MMP14) og urokinase-type plasminogen aktivator (uPA).
materialer og metoder
Cell kultur
Åtte mage kreft cellelinjer (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 og SGC7901) ble hentet fra Riken Genbank (Tsukuba, Japan) og American Type Culture Collection (Manassas, USA). En ikke-maligne mage cellelinje (GES-1) ble hentet fra Beijing Institute for Cancer Research (Beijing, Kina). Celler ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sijiqing, Huzhou, Kina), og inkuberes ved 5% CO
2, 37 ° C og 95% luftfuktighet.
Bygging av IGFBP3 luciferaserapportørplasmid plasmider
Tre ulike fragmenter i promoter regionen IGFBP3, inkludert -2282 til 56 bp (2,3 kb, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 bindingssetet jeg, HBSI) og -1727 ~ -943 bp (HBSII), ble forsterket av PCR hjelp genomisk DNA ekstrahert fra HEK-293T vill celler som malen. HBSI omfatter HBS1 og 2, inneholder HBSII av HBS3, 4 og 5, hvor HBS1-5 er forutsagt ved PROMO (https://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS primersekvenser var som følger: pIGFBP3, 5′-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 «og 5′-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3′; HBSI, 5»-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 «og 5′-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3′; HBSII, 5»-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 «og 5′-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3». PCR-fragmentene ble ligert inn PGM-T vektor (Tiangen, Beijing, Kina), fordøyd med KpnI /Bglll (Promega, Madison, USA) og deretter subklonet inn i KpnI /Bglll nettsteder i pGL3-basisvektoren (Promeg) for å generere pGL3-pIGFBP3-basic luciferase reporter plasmider, og pGL3-promotervektor (Promega) for å generere pGL3-HBSI (II) -promoter luciferaserapportørplasmid plasmider. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Bygging av luciferase reporter plasmider HBSS
Vi syntetiserte oligonukleotider med spådd Hox bindingsseter (HBSS) i promotorområdene av IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) og hver med ett poeng mutant hotellet (A → C), oligonukleotider ble som følger:
HBS3, 5′-CTCTTTTTATTA-3 «og 5′-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3»;
mutant HBS3, 5′-CTCTTTTTCTTA-3 «og 5′-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3»;
HBS4, 5′-CATTTGCTATTA-3 «og 5′-CATGGTAAACGATAATCTAG-3»;
mutant HBS4, 5′-CCTTTGCTCTTA-3 «og 5′-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3»;
HBS5, 5′-CCTTTATTATTA-3 «og 5′-CATGGGAAATAATAATCTAG-3»;
mutant HBS5, 5′-CCTTTCTTCTTA-3 «og 5′-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3».
dobbelt-trådet HBSS ble varmebehandlet og satt inn oppstrøms fra pGL3-promoter vektor for å danne luciferase-rapportør plasmider [18]. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Cell transfeksjon
Gastric cacner celler (BGC823 og SGC7901) ble transfektert med pcDNA3.1-HoxD10 eller pcDNA3.1 tom vektor bruker Fugene HD (Promega) . For å generere stabile cellelinjer HoxD10 overekspresjon, ovenfor transfekterte celler ble selektert med 400 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Tyskland) i ytterligere 14 dager. For siRNA-mediert genet knockdown, ble BGC823 og SGC7901 celler transfektert med negativ kontroll siRNA eller IGFBP3 målrettet siRNA (Qiagen, Hilden, Tyskland), HGC27 celler ble transfektert med negativ kontroll siRNA eller HoxD10 målrettet siRNA (Genepharma, Shanghai, Kina) bruker Lipofectamine RNAiMAX Reagens (Invitrogen).
Luciferase aktivitetsanalyse
1,0 × 10
5 BGC823 og SGC7901 celler ble sådd i 24-brønners plater for 24 timer, deretter transfektert med 0.4μg pcDNA3.1 tom vektor eller pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-basic (promoter) tom vektor eller pGL3-pIGFBP3 (HBS) -Grunnleggende (promoter), og 0.004μg PRL-TK vektor (Promega) som inneholder referanse kontroll Renilla hjelp Fugene HD [18]. Luciferase aktivitet ble analysert av dual-luciferase reporter analysen system etter 48t i henhold til produsentens protokoller (Promega).
Chromatin immunoprecipitation (chip)
I stabil HoxD10 overuttrykt BGC823 og SGC7901 cellelinjer, kromatin ble immunpresipitert med HoxD10 monoklonalt antistoff (kanin, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA) [19] eller normalt kanin-IgG (negativ kontroll) i henhold til den enkle ChIP Enzymatisk chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , USA). Utfelte DNA eller 2% Input prøver med genomisk DNA fra HEK-293T vill celler ble forsterket med Taq DNA Polymerase (Takara, Otsu, Japan) [20,21]. Fire primere omfatter HBSS i de forskjellige områder av IGFBP3 promoteren ble konstruert som følger: A1 (-2251 ~ -2073 bp, for HBS1 og 2,), 5′-CATTCGGCACTGAACAAG-3 «og 5′-AGCCTGGACTGACCACT-3′; A2 (-1765 ~ -1633 bp, for HBS3,), 5»-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 «og 5′-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3′; A3 (-1470 ~ -1364bp, for HBS4,), 5»-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 «og 5′-AGGTGGATAGGTGACTTG-3′; A4 (-1153 ~ -877bp, for HBS5,), 5»-GCCGACAGGAGTTACAG-3 «og 5′-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3».
Revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble isolert med Trizol reagens (Cwbiotech, Beijing, Kina). Revers transkripsjon (RT) -PCR ble bestemt med M-MLV revers transkriptase (Takara) og Taq DNA polymerase. De følgende primere ble anvendt for amplifikasjon:
GAPDH, 5′- GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 «og 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′; HOXD10, 5»-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 «og 5′-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3′; IGFBP3, 5»-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 «og 5′-CTTTGGAAGGGCGACACT-3»;
MMP2, 5′-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 «og 5′-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3»;
MMP7, 5′-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 «og 5′-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3»;
MMP9, 5′-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 «og 5′-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3»;
MMP14, 5′-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 «og 5′-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3»,
tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP1), 5′-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 «og 5»- -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 «;
TIMP2, 5′-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 «og 5′-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3»;
uPA, 5′-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 «og 5′-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3′; uPAR, 5»-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 «og 5′-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3».
Western blotting
Totalt proteiner ble hentet ved hjelp av RIPA lysebuffer (Beyotime, Haimen, Kina). Triton X-100 lyseringsbuffer ble anvendt for å ekstrahere oppløselig E-cadherin og P-catenin, ble SDS-lyseringsbuffer benyttes for å ekstrahere uoppløselig E-cadherin /P-catenin kompleks [22]. Lysater ble løst i SDS-PAGE-gel og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, USA). Blottene ble probet med HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-cadherin (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), ß-catenin ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) eller GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) antistoffer. Blottene ble visualisert ved anvendelse av en kjemiluminescens med Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokyo, Japan). De relative tettheter av proteiner ble kvantifisert med bilde J. programvare og normalisert til GAPDH [20].
sårhelende analysen
BGC823 og SGC7901 celler ble transfektert med IGFBP3 siRNA eller kontrollere negative siRNA i seks-brønns plater og deretter skrapet med en p10 pipettespiss for å skape et gap. Brønnene ble skylt med PBS for å fjerne ford celler og friskt medium (1% FBS for BGC823 og serumfritt for SGC7901) ble tilsatt. Tre randomiserte bilder av ripete områdene ble tatt (× 40 forstørrelse) over 0h, 12h og 24h [23].
Transwell migrasjon og invasjon analyser
Cell migrasjon og invasjon ble vurdert ved modifisert Boyden Transwell kamre (Corning Inc., Corning, USA), belagt med (for invasjon) eller uten (for migrasjon) matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). siRNA transfeksjon og sult celler ble sådd ut i det øvre kammer i kulturmedium inneholdende 1% FBS (BGC823) eller uten FBS (SGC7901), medium inneholdende 15% FBS ble tilsatt til det nedre kammer, ble cellene i det øvre kammer forsiktig fjernet etter inkubering for 16 timer (for migrasjon) eller 36h (for invasjon). Migrerte celler ble farget med 0,5 ug /ml DAPI Farging Solution (Roche, Penzberg, Tyskland). Celletall ble tilfeldig regnet i fem felt (× 400 forstørrelse) [24]. Invaderte celler ble inkubert med celle Stain løsning (Millipore) og fotografert (x 200). Fargestoffet Blandingen ble vasket ved ekstraksjon buffer og overført til en 96-brønn for kolorimetrisk måling ved 560nm på en mikroplateleser (Thermo, Boston, USA) [25,26].
pasienter og prøver
86 kirurgi pasienter av adenokarsinom i ventrikkel ble registrert fra mai 2007 til februar 2008 etter signering av informert samtykke. Denne studien ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for Sir Run Run Shaw Hospital i Zhejiang University. Matchet tumorvev og tilstøtende kreftfrie vev ble oppnådd. Pasientenes clinicopathological data inkludert kjønn, alder, TNM etapper og patologiske karakterer ble hentet fra pasientjournaler. Oppfølging ble utført på en 1-års intervall etter operasjonen, en medisinsk historie ble spilt inn når pasienten kom for påfølgende besøk. Tiden oppfølging cutoff var august 2012, og median oppfølgingstid var 35 måneder (variasjon, 1-63 mnd).
Tissue microarray og immunhistokjemisk farging
Cores måler 1,5 mm i den største dimensjon ble stanset fra ikke-nekrotiske områder matchet tumorvev og tilstøtende kreftfrie vev. Tissue microarray lysbilder som inneholder 4 um tykke microarray delene ble bygget ved hjelp av standard teknikker (i samarbeid med Shanghai Super Company, Ltd., Shanghai, Kina). Glassene ble inkubert med IGFBP3 antistoff (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) over natten ved 4 ° C, og deretter inkubert med Envision-pluss-deteksjonssystem (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, København, Danmark). Seksjonene ble utviklet i 3,3′-diaminobenzidin løsning under mikroskopisk observasjon og motfarget med hematoksylin [27]. Vev av avansert brystkreft ble farget som den positive kontrollen [28]. Andelen av positive celler i hver prøve ble kvantifisert i henhold mikroskop og klassifiseres i fire grupper. 0: 0-5% positive celler; 1: 6% til 50% positive celler; 2: 51% til 75% positive celler og 3: 76-100% positive celler. Intensiteten av IGFBP3 farging ble gradert som følger: ingen farging = 0; svak farging = 1; moderat farging = 2; tett farging = 3. Poengsummen intensiteten pluss andelen av positiv farging ble definert som IGFBP3 flekker poengsum. En score på 0-3 ble ansett som lav uttrykk og 4-9 så høyt uttrykk.
Statistisk analyse
differensial uttrykk for IGFBP3 mellom tumorous vev og ikke-tumorous vev ble bestemt av Mann-Whitney U-test. Chi-kvadrat test ble brukt for å analysere forholdet mellom clinicopathological funksjoner og IGFBP3 flekker score. Sannsynligheten for total overlevelse ble beregnet med Kaplan-Meier metoden og forskjellen mellom kurvene ble evaluert med Log-rank test. En cutoff av p 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
HoxD10 oppregulerer uttrykk for IGFBP3
Genome-wide analyse avdekket at flere gener inkludert IGFBP3 ble regulert. av HoxD10 i mage kreftceller i vår tidligere studie (4). For å avgjøre om HoxD10 kunne transcriptionally regulere uttrykk for IGFBP3 i magekreftceller, observerte vi uttrykket nivået av IGFBP3 etter stabilt innføre HoxD10 gen inn BGC823 og SGC7901 celler, eller forbigående banket ned av HoxD10 i HGC27 celler. RT-PCR og Western blotting resultater konsekvent viste at uttrykket av IGFBP3 var signifikant oppregulert i HoxD10 overuttrykt celler (figur 1A og 1B), mens nedregulert etter å kneble av HoxD10 i HGC27 celler (figur 1C og 1D).
ekspresjon av IGFBP3 ble påvist ved konvensjonell RT-PCR (A, C) og Western blotting (B, D) etter transfektert med tom vektor eller pcDNA3.1 pcDNA3.1-HoxD10 i BGC823 og SGC7901 celler, og negativ kontroll siRNA (Ne -Si) eller to av HoxD10 siRNA (H-Si1 og H-Si2) i HGC27 celler. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Densitometry verdiene er uttrykt som ganger endring sammenlignet med pcDNA3.1 vektor eller negative kontroll siRNA verdiene normalisert til 1. (E) BGC823 og SGC7901 var co-transfektert med pcDNA3.1 tom vektor eller pcDNA3.1-HoxD10, pGL3-basisvektoren eller pGL3- (pIGFBP3) -Grunnleggende og PRL-TK vektor. Relativ ildflue aktivitet ble uttrykt normalisert til Renilla aktivitet i PRL-TK vektor. Alle forsøk ble utført in triplo. ** Indikerer p 0,01.
A 2,3 kb sekvens (-2282 til 56 bp) ved oppstrømsområdet av IGFBP3 ble klonet inn i pGL3-basisvektor, og anvendt for å bedømme luciferase-aktivitet av dual-luciferase reporter-analyser. Resultatene viste at den IGFBP3 promoter aktivitet i BGC823 og SGC7901 celler ble forbedret med 4,2 og 3,8 folder henholdsvis etter ko-transfektert med pcDNA3.1-HoxD10 forhold til pcDNA3.1 vektor transfektanter (p 0,01, figur 1E). Samlet utgjør disse resultatene at det HoxD10 kunne transcriptionally oppregulere uttrykk for IGFBP3 i mage kreftceller.
Identifisering av nye regulatoriske regioner i IGFBP3 arrangøren ansvarlig for HoxD10
Vi neste analysert potensialet HoxD10 bindingsseter i IGFBP3 promoter. Den 2,3 kb oppstrøms sekvens av IGFBP3 genet ble matet inn PROMO (https://alggen.lsi.upc.es/), et program for prediksjon av transkripsjonsfaktor bindingssteder i en enkelt sekvens eller i en gruppe av relaterte sekvenser (17 ), og 5 mulige HoxD10 bindingsseter (HBS1 ~ 5) ble spådd (tabell S1). Som vist i figur 2A, ble disse fem HBSS lokalisert ved -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) og -953 ~ -944bp (HBS5) hhv. I stabil HoxD10 overexpressed BGC823 og SGC7901 celler, bindende regioner i IGFBP3 promoter ble undersøkt av Chip analyser. Vi identifiserte at kromatin fremskyndet av HoxD10 spesifikt antistoff ble forsterket ved hjelp av A2, A3 og A4 primere, som omfatter HBS3, HBS4 og HBS5 henholdsvis, mens ingen forsterkning ble observert med A1 primere omfatter HBS1 og 2 (figur 2B).
(A) Skjematisk fremstilling av IGFBP3 arrangøren med de potensielle bindingsseter for HoxD10 (HBS1-5) og fire fragmenter (A1-A4) som strekker seg over fem HBSS på IGFBP3 promoter regionen ble utformet for PCR-analyse i Chip analyser (A1-A4). (B) HoxD10 overuttrykt BGC823 og SGC7901 celler ble kryssbundet med formaldehyd og lysert. Cellelysater ble underkastet immunoutfelling med enten et kanin-antistoff til HoxD10 eller normal kanin IgG. Genomisk DNA og 2% innspill DNA ble brukt som positiv kontroll.
For å få ytterligere i de regulatoriske segmenter av IGFBP3 arrangøren av HoxD10, klonet vi 2 forskjellige DNA-fragmenter, som omfatter HBSI (HBS1 og 2) og HBSII (HBS3, 4 og 5), henholdsvis i SV40 promoter luciferasepreparater journalister. Resultatene viste at samtidig transfektert med HoxD10, HBSII forbedret SV40 promoter aktivitet med 4,0 ganger sammenlignet med de tomme vektor transfektanter i BGC823 celler (P 0,01, figur 3A). I motsetning til dette viste HBSI ingen signifikant effekt på den SV40 promoter-aktivitet (figur 3A). Lignende resultater ble avslørt i en annen uavhengige SGC7901 cellene, SV40 promoter aktivitetsendringer var 3,3 og 0,9 ganger ved HBSII og HBSI henholdsvis (figur S1A i File S1).
(A) BGC823 celler ble transfektert med pcDNA3.1 tom vektor eller pcDNA3.1-HoxD10, pGL3-promotervektor eller pGL3-HBSI (II) -promoter og PRL-TK vektor. (B) Forskjellige oligonukleotider som inneholder vill eller punkt mutante sekvenser av HBS3, HBS4 og HBS5 ble klonet inn pGL3-HBS-promoter. Relativ ildflue aktivitet ble uttrykt normalisert til Renilla aktivitet i PRL-TK vektor. Alle forsøk ble utført in triplo. ** Indikerer p 0,01.
HBS3, 4 og 5 delte felles forpliktende element «TTAT», mens HBS1 eller HBS2 har ingen av disse elementene. Vi hypotesen om at HoxD10 binder direkte til arrangøren av IGFBP3 på «TTAT» områder. For å bekrefte dette, syntetisert vi 10bp oligonukleotider som inneholder sekvenser av HBS3, HBS4 og HBS5 hhv. Som vist i figur 3B, ble SV40 promoter-aktivitet forsterkes ved 1,8, 2,0 og henholdsvis 2,7 folder når ko-transfektert med plasmid HoxD10 i BGC823 celler, mens punkt mutanter av HBS3, HBS4 og HBS5 viste ingen signifikante endringer. Vi gjengitt lignende resultater i SGC7901 celler (Figur S1B i File S1).
Sammen ovennevnte resultater indikerer at IGFBP3 er et direkte mål for HoxD10 i mage kreftceller. Vi identifiserte tre funksjonelle bindinger sider mellom -1727 ~ -943bp i oppstrøms IGFBP3 genet er ansvarlig for HoxD10. HoxD10 kan direkte binde arrangøren av IGFBP3 potensielt gjennom Hox bindende element «TTAT».
IGFBP3 er nedregulert i magekreft og knyttet til pasientenes prognose
For å bestemme uttrykket mønster av IGFBP3 i magekreft, 86-pair kirurgiske prøver av human magekreft og ifølge tilstøtende noncancerous mage vev ble undersøkt. Intensiteten av IGFBP3 farging ble scoret som 0 (negativ), en (svak), 2 (moderat), eller 3 (tett), som bestemmes uavhengig av to patologer (Figur S2 i File S1). Resultatene viste at ekspresjonsnivået av IGFBP3 i tumorvev var signifikant lavere enn i tilstøtende tumorfrie vev (p 0,001, figur 4A og 4B). Videre ble IGFBP3 uttrykk evalueres med hensyn til clinicopathological kjennetegn ved pasientene. IGFBP3 uttrykk var betydelig lavere i mage tumor med lymfeknutemetastase (p = 0,045). I tillegg er høy IGFBP3 ekspresjon i liten størrelse tumorer (T1 + T2, 8/12) hyppigere observert i forhold til den i stor seg (T3 + T4, 36/74), men med ingen signifikant forskjell (p = 0,062) . Det var heller ingen signifikant sammenheng mellom uttrykk for IGFBP3 og clinicopathological funksjoner, inkludert kjønn, alder og patologisk Karakter (tabell 1).
(A) ble påvist Uttrykket nivåer av IGFBP3 av immunkjemi analyse i 86 par av mage tumor og matchet tilstøtende normalt vev. Representative bilder ble vist i tre sammenkoblede tumor (T) og normal (N) vev. (B) Sammenligningen av flekker score til IGFBP3 mellom mage tumor og ved kreft gratis vev. (C) Overlevelseskurver ble plottet på grunnlag av Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse. Ekspresjonsnivået av IGFBP3 ble anvendt som variate å skille to linjer.
IGFBP3 farging intensitet
Klinisk klassifisering
Totalt antall
Low (nummer)
Høy (nummer)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644 60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Kjønn, alder og clinicopathological egenskaper og immunhistokjemi resultatene av mage tumor vevsprøver.
CSV ned CSV
Vi videre analysert sammenhengen mellom uttrykk for IGFBP3 og total overlevelse av magekreft pasienter. Høyere uttrykk for IGFBP3 var assosiert med lengre overlevelse tid i 5 år oppfølging (p = 0,011, Kaplan-Meier overlevelses Log-rank test) (Figur 4C).
knockdown av IGFBP3 genet fremmer magekreftcelle migrasjon og invasjon
for å evaluere den funksjonelle rollen IGFBP3 i magekreft, vi undersøkte celle migrasjon og invasjon etter knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 ble selektivt knockdowned av RNA-interferens i BGC823 og SGC7901 celler (figur 5A og 5B), som hadde et relativt høyt nivå av endogen IGFBP3 i et panel av mage-cellelinjer (fig S3 i File S1). Resultatene viste at tie ekspresjon av IGFBP3 betydelig forbedret cellemigrering både i Transwell migrasjons analyser (figur 5C og 5D) og ripetest (fig S4 i File S1), når sammenlignet med negativ kontroll siRNA. I tillegg viste knockdowning IGFBP3 en betydelig høyere aktivitet av cellulær invasjon i transwell analyser (figur 5E og 5F).
ekspresjon av IGFBP3 i BGC823 og SGC7901 celler ble detektert ved konvensjonell RT-PCR (A) og Western blotting (B) etter transfektert med negativ kontroll siRNA (Ne-si) eller IGFBP3 siRNA (I3-si) . Tetthetsverdiene er uttrykt som ganger endring sammenlignet med negativ kontroll siRNA-verdier normalisert til 1. (C) Cellemigrering ble vurdert ved modifisert Boyden Transwell kamre analyser. Etter inkubasjon i 16 timer ble cellene som migrerte til bunnen av membranen farges med DAPI. (D) Det gjennomsnittlige antall synlige trekkende celler ble tellet i fem tilfeldige høye strømfelt. Disse eksperimentene ble utført i tre eksemplarer. ** Indikerer p 0,01. (E) BD Matrigel belagte kamre ble brukt for å vurdere celle invasjon. Invaderte celler på bunnen av membranen ble farget med celle fargende oppløsning. (F) invaderte celler ble vasket ved ekstraksjon buffer og registrert på en mikroplateleser (560 nm). ** Indikerer p 0,01.
IGFBP3 modulerer uttrykk for MMP14, uPA og uPAR
For å finne ut av mulige mekanismer for hvordan IGFBP3 regulere invasivitet av magekreftceller, vi undersøkte mRNA nivåer av MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA og dens reseptor uPAR, som alle er invasjonsrelaterte faktorer, spesielt i magekreft. Etter transient transfektert med IGFBP3 siRNA i 72 timer i BGC823 og SGC7901 cellene, mRNA uttrykk nivåer av MMP14, uPA og uPAR økt, mens ingen signifikant endring av MMP2, MMP7, MMP9 eller TIMP1 /TIMP2 ble observert (Figur 6A). E-cadherin, ß-catenin og E-cadherin /ß-catenin kompleks ble hentet ved hjelp av ulike lysatene, deres nivåer hadde ingen meningsfull endring etter stanse IGFBP3 i BGC823 celler (figur S5 i File S1). Disse resultatene indikerte at IGFBP3 hemmer invasjon av magekreftceller gjennom, i det minste delvis, å modulere uttrykk for MMP14, uPA og uPAR (figur 6B).
(A) MMP’er (2,7,9a, 14), TIMPs (1,2), ble uPA og uPAR i BGC823 og SGC7901 celler påvises ved konvensjonell RT-PCR etter transfektert med negativ kontroll siRNA (Ne-si) eller IGFBP3 siRNA (I3-si). (B) Systemisk forståelse av trasé for HoxD10-IGFBP3 regulering av magekreft celle migrasjon og invasjon.
Diskusjoner
Hox super er en gruppe av viktige transkripsjonsfaktorer som kan regulere spredning og differensiering av embronic celler [29,30]. I tillegg er den avvikende ekspresjon av Hox også spiller viktige roller i utviklingen av flere typer kreft [31]. Hox proteiner har en stor nedstrøms regulatoriske nettverk og utøve sine funksjoner i hovedsak gjennom disse målgener [5]. Det er gjennomført Genome-wide analyse ut til skjermen nedstrøms gener HoxD10 under ryggmarg utvikling og i magekreftceller [4,32]. Vi og andre har åpenbart en felles målgen IGFBP3, som har blitt rapportert å tjene som en tumor suppressor [10].
Våre studier gitt første bevis for å vise at HoxD10 binder direkte IGFBP3 arrangøren å aktivere uttrykk for IGFBP3 i mage kreftceller. HoxD10 protein kan bli rekruttert til den spesifikke promoter-regionen i IGFBP3 genet, noe som indikerer at HoxD10 kan direkte binde til IGFBP3 genet. Luciferase aktivitet med naturen, mens ikke mutant, HBS3, HBS4 eller HBS5 ble betydelig forbedret ved overekspresjon av HoxD10, noe som tyder på at HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) og HBS5 (CTTTATTATT) var tre funksjonelle HoxD10 bindingssteder på arrangøren regionen IGFBP3. Som forventet, var ekspresjonsnivået av IGFBP3 mRNA og protein oppregulert ved tvungen ekspresjon av HoxD10 i forskjellige gastrisk cancer-cellelinjer [4]. Studier har vist at Hox-proteiner har noen kjerne konsensus bindende elementer, inkludert TTAT, TAAT, og TTAC [7]. Punktmutasjon med «TTAT» til «TTCT» eller «TCTT» til «TATT» i promoterregionen av IGFBP3 i denne studien indikerer at «TTAT» eller «TATT» er viktige bindingsseter for HoxD10. Hox-proteiner kan direkte regulere transkripsjon prosessen med nedstrøms målgener som monomerer eller homodimerer [33]. Alle forsøk ble utført in triplo.
