Abstract
Formål
Nye kliniske studier viste at sekvensiell kombinasjon av epidermal vekstfaktor-reseptor tyrosin kinase hemmere (EGFR-TKI) og kjemoterapi kan forlenge PFS og /eller OS av avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) hos pasienter med EGFR mutasjon. Målet med denne studien var å vurdere den optimale kombinasjonen sekvens og å utforske dens mulig mekanisme.
Metoder
PC-9 celler og A549 celler, lunge adenokarcinomceller med mutert og bred-type EGFR henholdsvis ble behandlet med docetaxel /gefitinib alene eller i forskjellige kombinasjons tidsplaner. EGFR og K-ras-genet status ble bestemt av qPCR-HRM teknikk. Celleproliferasjon ble påvist ved MTT-analyse. Ekspresjon og fosforylering av EGFR, ERK, Akt og IGF-1R ble påvist ved western blot. Cellesyklus distribusjon ble observert av flowcytometri
Resultater
Bare sekvensiell administrasjon av docetaxel fulgt av gefitinib (D → G) indusert betydelig synergieffekt i begge cellelinjer. (Kombinasjon Index 0,9). I motsatt rekkefølge (G → D) resulterte i en antagonistisk interaksjon i begge cellelinjene (CI 1,1), mens den samtidig administrering (D + G) viste additiv (0,9 CI 1,1) -synergistic effekt i PC-9 celler og antagonistiske-additiv effekt i A549 celler. Mekanisme studier viste at docetaxel-indusert fosforylering av EGFR og ERK ble undertrykt ved senere brukt gefitinib, men ikke ved samtidig eksponering av gefitinib. Den gefitinib-trykt fosforylering av EGFR og ERK ble reversert verken ved samtidig eller ved etterfølgende behandling med docetaxel. D + G forsterket deres hemming på fosforylering av IGF-1R i PC-9 celler.
Konklusjoner
cytostatika etterfulgt av EGFR-TKI kan være den optimale kombinasjonen for antiproliferative effekter i EGFR -mutant NSCLC celler, og fosforylering av EGFR og ERK kan bidra til denne effekten
Citation. Chen B, Zheng J, Zeng Y, Li B, Xie B, Zheng J et al. (2014) sekvensavhengig Antlproliferative Effekter av Gefitinib og Docetaxel på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) Celler og mulig mekanisme. PLoS ONE 9 (12): e114074. doi: 10,1371 /journal.pone.0114074
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 25 juni 2014; Godkjent: 03.11.2014; Publisert: 04.12.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (https://www.nsfc.gov (nr 81172225, 81101821 og 81000819.). cn /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Det er velkjent at for behandling av avansert NSCLC, er epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosinkinase-inhibitor (EGFR-TKI) og kjemoterapi anbefalt som førstelinjeterapi for pasienter med aktiv EGFR mutasjon og villtype EGFR, respektivt. Denne anbefalingen er basert på resultater fra en fase III randomisert studie IPASS hvor pasienter med EGFR mutasjoner som fikk gefitinib hadde økt progresjonsfri overlevelse (PFS 24,9% vs. 6,7%), responsrate (RR 71,2% vs. 47,3%) og livskvalitet sammenlignet med de som mottar kjemoterapi [1]. Men bruk av platina-basert kjemoterapi og EGFR-TKI har nådd en terapeutisk platå. Selv om ingen nye revisjonen vises i siste retningslinje, noen fase III kliniske studier inkludert FASTACT-2 [2] og informere [3] har tatt et steg videre, og viste at kjemoterapi kombinert med EGFR-TKI i konkrete tidsplaner kunne bedre prognosen, spesielt hos pasienter med EGFR mutasjoner. Følgelig, det antas at ytterligere forbedringer kan komme fra resultatene av nye mål, at man bryter EGFR-TKI toleranse og kombinasjonen av EGFR-TKI med kjemoterapi siden mekanismene for deres anti-tumor aktivitet er forskjellige.
for kombinasjonsbehandling, ble i utgangspunktet tre tidsplaner omtalt i siste kliniske forsøk: 1. samtidig administrasjon; 2. kjemoterapi etterfulgt av EGFR-TKI; 3. EGFR-TKI etterfulgt av kjemoterapi. INTACT-2, hyllest og talent studier viste at responsrate og total overlevelse (OS) favorisert samtidige kombinasjonen bare i EGFR-mutant pasienter, men ikke i vill-type eller uselekterte pasienter [4] – [6]. WJTOG0203 og informere studiene viste at sekvensiell administrasjon av kjemoterapi etterfulgt av EGFR-TKI virket gunstig for uselektert befolkning (med betydelig forbedret OS og PFS) [7], [3]. En annen fase III studie FASTACT-to nylig rapportert at Pilgrim kjemoterapi og erlotinib var en annen levedyktig førstelinjealternativ for pasienter med ukjent EGFR status. Det ble vist at PFS og OS ble betydelig forlenget med kjemoterapi pluss erlotinib vs kjemoterapi pluss placebo (PFS: 7,6 m vs 6,0 m, P 0,0001, OS: 18,3 m vs. 15,2 m, P = 0,042). Fordelen var enda størst for EGFR-mutant pasienter [2]. I motsetning Kanda et al viste i en fase II studie at gefitinib fulgt av kjemoterapi fått en bedre PFS i EGFR-mutant pasienter sammenlignet med tidligere rapporter ved hjelp av gefitinib alene som førstelinjebehandling [8]. Men nå ingen klinisk studie har sammenlignet de tre planene med hverandre og fortalte hvilken som var optimal. I denne forbindelse, den første målet med denne studien er å finne ut den optimale planen fra tre forskjellige kombinasjonsstrategier av docetaxel og gefitinib.
På den annen side, den cellulære mekanisme av sekvensavhengig effekt av gefitinib i kombinasjon med kjemoterapi fortsatt et åpent spørsmål. Noen tidligere studier indikerte at den synergistiske virkning indusert ved sekvensiell administrering EGFR-TKI følgende cytotoksiske midler som kan bli korrelert med EGFR fosforylering, mens en antagonistisk effekt av EGFR-TKI etterfulgt av kjemoterapi ble relatert til regulering av cellesyklusfordelingen [9], [ ,,,0],10]. Videre har nylige undersøkelser rapportert at insulin-lignende vekstfaktor-reseptor-1 (IGF-1R) påvirket cellen følsomhet for kjemoterapi, så vel som EGFR-TKI gjennom regulering av signalveien som PI3K /AKT og MARK /ERK [11], [12]. Basere på disse funnene, er vårt andre mål å sondere inn i cellulære mekanismen av sekvensavhengige effekter av docetaxel og gefitinib på lungekreft celler gjennom vurdering av mulige endringer i de ovennevnte signalveier og i cellesyklus distribusjon.
Materialer og metoder
Material
Gefitinib (Astra Zeneca, UK) og docetaxel (Sanofi Aventis, Frankrike) ble utarbeidet i dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma Aldrich, USA) og lagret ved – 20 ° C. Stoffet ble fortynnet i friskt medium før forsøket, og den endelige DMSO konsentrasjonen oversteg aldri 0,1%.
Cell Culture
Menneskelig lunge adenokarsinom celle A549 og PC-9 [13] var vennlig gitt ved institutt for biokjemi og cellebiologi (Shanghai, Kina) og National Cancer Center Hospital of Japan (Tokyo, Japan), henholdsvis. Studien ble godkjent av etisk komité og gjennomgang styret i sykehuset vårt. Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% bovint serum (Gibco, Grand Island, NY, USA) i en fuktig atmosfære (Forma Scientific, Marietta, OH, USA) inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C .
Identifikasjon av EGFR og K-ras-genet status
DNA ble ekstrahert fra A549 og PC-9 celler ved hjelp av QIAmp vev kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Eksoner 18, 19, 20 og 21 EGFR-genet, så vel som eksonene 2 og 3 av K-ras-genet ble påvist ved hjelp av kvantitativ PCR med høy oppløsning og som smelter (qPCR-HRM) teknikk.
MTT målings
A549 og PC-9-celler ble sådd ut i 96-brønners plater (10
4 celler per brønn) og ble delt i 6 grupper og behandlet som følger: 192 Kontrollgruppe (C): celler ble inkubert med PBS for 72 timer; 193 Docetaxel gruppe (D): Cellene ble behandlet med docetaxel i 72 timer; 194 Gefitinib gruppe (G): Cellene ble behandlet med gefitinib i 72 timer; Docetaxel → Gefitinib gruppe (D → G): celler ble inkubert med docetaxel i 24 timer fulgt av gefitinib i 48 timer; Gefitinib → Docetaxel gruppe (G → D): celler ble inkubert med gefitinib i 48 timer fulgt av docetaxel i 24 timer; Samtidig gruppe (D + G): cellene ble inkubert samtidig med docetaxel og gefitinib i 72 timer. Celleformering ble bestemt ved MTT-analyse. Den optiske tetthet (OD) ved 490 nm ble bestemt ved anvendelse av en 96-brønns multiscanner auto-leser (Dynatech MR 5000). Hver test ble utført in triplo. Hemming rente% = 100% – (OD
test-OD
blank) /(OD
kontroll-OD
blank) × 100%. Hver Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Beregning av Kombinasjon Index (CI)
De antiproliferative virkningene av den kombinerte behandlingen ble evaluert av Kombinasjon Index (CI). Celler ble behandlet med tre forskjellige sekvenser som er nevnt ovenfor: D → G; G → D; D + G. Stoffet doser ble slått sammen ved hjelp av konstant forhold av IC50 verdier beregnet fra MTT analyse. Således vi brukte 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 og 4 ganger med IC50-doser av docetaxel og gefitinib. Resultatene av sekvensielle behandlinger ble analysert i henhold til metoden ifølge Chou [14]. CI verdi ble beregnet ved hjelp CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, USA), med CI 1.1, CI = 0,9-1,1 og CI 0,9 indikerer antagonistisk, additive og synergistiske effekter, henholdsvis. Hver Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Western blot
A549 og PC-9 celler ble lysert i buffer som inneholder proteinaseinhibitorer. Den totale protein av celler ble oppnådd ved bruk av kjernefysiske Extract Kit (Active Motiv Corp., USA). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL, USA). Prøver inneholdende 100 ug totalt protein ble underkastet elektroforese på 10% SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran ved elektroblotting. Blottene ble analysert ved hjelp av følgende antistoffer: anti-EGFR (1:1000, Santa Cruz, CA), anti-fosforylert-EGFR (1:1000), anti-ERK1 /2 (1:600), anti-fosforylert-ERK1 /2 (1:600), anti-AKT (1:1000), anti-fosforylert-AKT (1:1000), anti-IGF-1R (1:600), anti-phosphorilated-IGF-1R (1:600 ) og anti-β-aktin-antistoff (1:800) (alle de ovennevnte antistoff fra Cell Signaling Technology, USA), etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksydase (HRP) konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff (Santa Cruz, CA, USA). Blottene ble visualisert ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens kit (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Cell syklus analyse
Nylaget celler ble overført til nedfrysing rør. Hver gruppe besto av 3 rør. Etter behandling ble cellene vasket to ganger med PBS og deretter fiksert med 70% alkohol ved 4 ° C over natten. Etter sentrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter, ble celler inkubert med propidiumjodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ° C i 30 min i mørket, før den blir utsatt for et strømningscytometer (FACScan, Becton Dickinson , Mountain View, California). Cellesyklus ble analysert ved hjelp av Multicycle-DNA Cell Cycle Analysert programvare. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
ble uttrykt Statistisk analyse
Forskjellene mellom midler ble analysert med ANOVA og data som gjennomsnitt ±
SD
. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (Chicago, IL). Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant når
P
. 0,05
Resultater
EGFR og K-ras-genet status på A549 og PC-9 cellelinjer
qPCR-HRM teknikk viste at A549 cellene næret en mutasjon i K-ras eksoner 2 og ingen mutasjon i EGFR-genet. PC-9 celler næret en mutasjon i EGFR eksoner 19 og ingen mutasjon i K-ras, som var i samsvar med tidligere studier [13].
Effekter av ulike eksponerings tidsplaner av gefitinib og docetaxel på celleproliferasjon
MTT-analyse viste at docetaxel (10
-4 M~10
-10 M) eller gefitinib (10
-4 M~10
-8 M for A549 celler; 10
-4 M~10
-10 M for PC-9 celler) alene vesentlig hemmet proliferasjonen av A549 og PC-9-celler på en doseavhengig måte (
P
0,05). IC
50 av docetaxel og gefitinib var 2,05 × 10
-7 mol /l og 1,22 × 10
-5 mol /L respe ctively for A549 celler (Fig. 1a), og var 2,41 × 10
-8 mol /l og 5,65 x 10
-8 mol /l henholdsvis for PC-9-celler (fig. 1B). Spesielt den hemmende effekten av gefitinib på PC-9 celler var nesten 10
3-folder sterkere enn på A549 celler (
P
0,05).
Celler ble behandlet med gradient konsentrasjoner (10
-4 M~10
-10 M) av gefitinib eller docetaxel i 72 timer. Celleformering ble bestemt ved MTT-analyse. (A) A549-celler; (B) PC-9 celler. *
P
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen.
Barer
: ± SD, n = 3.
Vi vurderte deretter antiproliferative effekter av ulike eksponerings tidsplaner av gefitinib og docetaxel på både EGFR-TKI-resistente (A549) og EGFR -TKI-sensitive (PC-9) cellelinjer. Som vist i figur 2, bare sekvensiell administrasjon av docetaksel, etterfulgt av gefitinib (D → G) induserte en tydelig synergistisk virkning (CI 0,9) i begge cellelinjene (hemmende effekter på IC
50 var 60,00 ± 4,90% for A549 og 62,15 ± 3,84% for PC-9 celler). Tvert imot, G → D sekvens resulterte i en antagonistisk interaksjon (CI 1,1) i begge cellelinjer. Samtidig administrasjon av docetaxel og gefitinib (D + G) viste antagonistiske og additiv (0,9 CI 1,1) virkninger i A549 celler som legemiddelkonsentrasjonen økt; . Mens i PC-9 celler, viste D + G additiv effekt med lav dose kombinasjon og synergieffekter i høy dose kombinasjon
Celler ble behandlet med tre forskjellige sekvenser av gefitinib og docetaxel (D → G, G → D ; D + G). Den medikamentdoser ble samlet ved hjelp av konstant forhold mellom IC50-verdier (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 og 4 ganger med IC50). (A, B) Inhiberings-graden ble bestemt ved MTT-assay. *
P
0,05, D → G versus G → D; #
P
0,05 D → G versus D + G. D → G-sekvensen produserte de mest potent inhiberende effekt. (C, D) Kombinasjonen indeks (CI) ble beregnet ved bruk av CompuSyn programvare. Bare D → G sekvens viste synergistisk effekt. (D-G) docetaxel, etterfulgt av gefitinib; (G-D) gefitinib fulgt av docetaxel; (D + G) docetaxel og gefitinib administreres samtidig.
Barer
: ± SD, n = 3.
Effekter av ulike eksponerings tidsplaner av gefitinib og docetaxel på cellesignalveier
Vi videre autosøk inn i mulig mekanisme av den sekvensavhengige effekt av gefitinib og docetaxel. Figur 3 viser at for begge cellelinjer, docetaxel alene forbedret fosforylering av EGFR og ERK, mens gefitinib alene trykt fosforylering av disse to proteiner. For D → G tidsplan, ble docetaxel forbedret fosforylering av EGFR og ERK betydelig undertrykt av senere brukt gefitinib, og denne omvendte effekten var mye sterkere i EGFR-mutant PC-9 celler. Tvert imot, i forhold til G + D og G → D tidsplaner, ble gefitinib-trykt fosforylering av EGFR og ERK reverseres ved verken samtidig eller påfølgende behandling med docetaxel.
uttrykk og fosforylering av noen representative molekyler korrelerte cellesignalveier inkludert EGFR, ERK, Akt og IGF-1R ble oppdaget av western blot. (A) A549-celler; (B) PC-9 celler. (C) kontrollgruppe; (D) docetaxel alene; (G) gefitinib alene; (D-G) docetaxel, etterfulgt av gefitinib; (G-D) gefitinib fulgt av docetaxel; (D + G) docetaxel og gefitinib gitt samtidig.
Både D → G og D + G tidsplaner betydelig hemmet fosforylering av IGF-1R i PC-9 celler, mens i A549 celler, slik hemming effekten ble knapt registrert. Tvert imot, G → D plan økt fosforylering av IGF-1 R i begge cellelinjer. Dessuten, ingen av de tre planene viste påvisbar effekt på uttrykk og fosforylering av AKT.
Effekter av ulike tidsplaner av gefitinib og docetaxel på cellesyklus distritution
Figur 4 viser at for PC-9 celler, gefitinib alene indusert betydelig G
0 /G
1 fase arrest sammenligne med kontrollgruppen (86,94 ± 2,33% vs 57,32 ± 3,79%,
P
0,05); mens docetaxel alene indusert betydelig G
2 /M fase arrest (45,67 ± 3,90% vs 15,54 ± 2,57%,
P
0,05). D → G også betydelig arrestert cellesyklus i G
2 /M fase (56.31 ± 1.86% vs. 15,54 ± 2,57%,
P
0,05). Men G → D viste bare en trend med økt G
0 /G
1 fase (74,39 ± 2,78% vs 57,32 ± 3,79%,
P
0,05).
effekten av ulike forvaltningsplaner av gefitinib og docetaxel på cellesyklusfordeling ble oppdaget av flowcytometri. (C) kontrollgruppe; (D) docetaxel alene; (G) gefitinib alene; (D-G) docetaxel, etterfulgt av gefitinib; (G-D) gefitinib fulgt av docetaxel; (D + G) docetaxel og gefitinib administreres samtidig. *
P
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen. n = 3.
For A549 celler, gefitinib alene hadde ingen bemerkelsesverdig effekt på cellesyklus distribusjon, mens docetaxel alene indusert betydelig G
2 /M fase arrest sammenligne med kontrollgruppen (49.58 ± 2.70 % vs. 6,87 ± 1,35%,
P
0,05). D → G også betydelig arrestert cellesyklus i G
2 /M fase (60,74 ± 3,57% vs 6,87 ± 1,35%,
P
0,05). Men G → D viste bare en trend med økt G
0 /G
1 fase (78,42 ± 2,52% vs 72,13 ± 3,89%,
P
0,05).
diskusjon
Denne studien undersøkte sekvensavhengige antiproliferative effekter av gefitinib og docetaxel i tre forskjellige kombinasjonsplaner i både PC-9 celler (EGFR mutant, K-ras WT) og A549-celler (EGFR WT, K-ras mutant). Når gefitinib og docetaxel ble brukt alene i de to cellelinjene, den hemmende effekten av gefitinib på PC-9 celler var betydelig sterkere enn det på A549-celler, som var i overensstemmelse med tidligere rapporter [1]. Men IC50 av gefitinib var bare halvparten i PC-9, sammenlignet med det i A549; mens i klinisk arbeid, er gefitinib langt mer effektivt for pasienter med EGFR mutasjon enn docetaxel. Vi antok dette kan være fordi i
i
vitro
studie, testing midlene er påført direkte på målceller, men i
i
vivo
studie midlene er vanligvis gitt gjennom sirkulasjonssystemet, noe som kan påvirke fordelingen og konsentrasjonen av forskjellige midler.
Våre resultater viste også at docetaxel, etterfulgt av gefitinib (D → G) var signifikant overlegen i forhold til andre modi i forhold til anti-tumorvirkninger, ikke bare i EGFR mutant og K-ras WT PC-9-celler, men også i EGFR WT og K-ras mutant A549-celler. Dette var i samsvar med flere prekliniske studier som har registrert et panel av forskjellige lungecancercellelinjer behandlet med kjemoterapi /EGFR-TKI og rapportert at sekvensen av kjemoterapi → EGFR-TKI hadde fordel i forhold til andre modaliteter [8], [9], [ ,,,0],15]. Noen fase III kliniske studier inkludert WJTOG0203, informere og FASTACT-2 også validert at sekvensiell administrasjon av kjemoterapi etterfulgt av EGFR-TKI bemerkelsesverdig forbedret resultatet [4] – [6]. Derfor våre funn produsert sterk preklinisk støtte for surmounting terapeutisk platået EGFR-TKI og kjemoterapi, og kan være spesielt viktig for bekjempelse mot ildfast NSCLC. Det er nødvendig å være oppmerksom på at i denne studien, ble D → G synergisme også observert i EGFR vill-type cellelinjer. Selv om lignende resultater ble også rapportert av enkelte prekliniske og kliniske forsøk [8], [16], [17], mange flere data indikerte at pasienter med villtype EGFR ikke kunne dra nytte av EGFR-TKI behandling [4] – [6] . Det antas at det var fordi i vår studie IC50 doser gefitnib for hver cellelinje ble brukt, noe som medførte en tusen folder av gefitinib ble brukt for A549 celler sammenlignet med PC-9 celler. Tydeligvis slike ekstremt høye doser kan ikke kopieres direkte i klinisk arbeid, men relativt høy dose av EGFR-TKI har allerede blitt prøvd for NSCLC pasienter med hjernemetastaser og positive resultater ble rapportert [18], [19]. Det bør være spesielt gunstig for pasienter med villtype EGFR om lignende modi ble prøvd og lykkes med en slik undergruppe.
I forhold til samtidig administrering av docetaxel og gefitinib, virket vår resultat slags komplisert, med additiv (0,9 CI 1,1) -synergistic effekt observert i PC-9 celler og antagonistisk-additiv effekt i A549 celler. Dette indikerte at D + G var mer effektiv i EGFR mutante celler enn i villtype-celler. Slike data tilsvarte andre prekliniske rapporter som viste at EGFR-genet status kan være en prediktor for aktiviteten av samtidige kombinasjon [9]. Selv tidlig fase III-studier klarte ikke å vise nytte av samtidig kombinasjon av kjemoterapi + EGFR-TKI enn kjemoterapi alene uselekterte pasienter, en subgruppeanalyse av TRIBUTE viste at erlotinib samtidig kombinert med kjemoterapi tillagt en bemerkelsesverdig høyere responsrate hos pasienter med mutant EGFR enn pasienter med vill-type EGFR (53% vs. 18%,
P
0,01) [20]. Derfor antatt vi at for samtidig kombinasjon, kan EGFR mutasjon spår en terapeutisk effekt. Tilsvarende er det også nødvendig å bemerkes at dosene av gefitinib anvendt i A549-celler var mye mer høyere enn i PC-9-celler, som kan ha blyholdig til D + G-indusert additiv effekt som observeres i A549-celler.
Vi videre analysert i mekanismen bak synergien indusert av D → G planen. Det har blitt demonstrert at EGFR-TKI kompetitivt bundet med EGFR og blokkert flere nedstrøms signalveier inkludert PI3K /Akt og MARK /Erk, resulterte i inhibering av tumorcellevekst, tumormetastase og vaskularisering [21], [22]. En tidsplan studie fra Jiang et al. viste at synergismen av D → G plan kan være forbundet med MAPK fosforylering ratio [15]. Våre data viste at fosforylering av EGFR og ERK (pEGFR og perk) ble forbedret med docetaxel og ble undertrykt av gefitinib. Når gefitinib ble brukt etter docetaxel (D → G), docetaxel-økt pEGFR og ekstra fordel var undertrykt av senere brukt gefitinib. Men denne reversering ble ikke detektert i to andre planer. Dette var i tråd med Giovannettis [8] og Van Schaeybroeck menn [23] studier som rapporterte at bare de cellene viste økt pEGFR kunne ha nytte av sekvensielt brukt EGFR-TKI. Derfor ble det foreslått at kjemoterapi-indusert oppregulering av pEGFR og ekstra fordel forsterket sensitiviteten til lungekreftceller for senere brukes EGFR-TKI, og til slutt ført til forbedrede resultater.
Western blot viste også at gefitinib-indusert undertrykkelse av pEGFR og perk ble ikke reversert ved samtidig eksponering av docetaxel, er det derfor antatt at gefitinib ikke klarte å forsterke den hemmende effekten av samtidig brukt docetaxel på grunn av den lave pEGFR og ekstra fordel i A549 celler. Konsekvent, Van Schaeybroeck et al. [24] har vist at i kolorektal kreft celler, nedregulering av pEGFR førte til den antagonistiske interaksjonen mellom EGFR-TKI og cytotoksiske midler. Tvert imot ble det synergistiske aktiviteten av samtidig administrering observert i EGFR mutante celler PC-9. Men ifølge våre resultater er nevnt ovenfor, EGFR og ERK-fosforylering kanskje ikke det mulig mekanisme. Det var flere bevis som viser at IGF-1R uttrykk ble korrelert med celle følsomhet for kjemoterapi og EGFR-TKI [25], [26]. Forstyrrelser av IGF-1R ekspresjon eller administrering av IGF-1 R-inhibitor forbedret resultat av cytotoksiske midler og EGFR-TKI, som kan være forbundet med undertrykkelse av PI3K /Akt sti [27], [28]. I den foreliggende undersøkelse, D + G vesentlig hemmet fosforyleringen av IGF-1R i PC-9-celler, mens i A549-celler, ble inhibering slik effekt knapt påvises. Vi har derfor antatt at den sterke inhibering av IGF-1 R fosforylering kan bidra til synergismen oppnådd i PC-9-celler. Ytterligere bekreftelse er garantert av oppregulering og nedregulering av pIGF-1R i PC-9 celler.
G → D planen viste antagonistisk effekt på både A549 og PC-9 celler. Men reguleringen av pEGFR og perk unnlot å gi en plausibel forklaring på gefitinib-indusert nedregulering av pEGFR og perk ikke ble reversert ved senere eksponering for docetaxel. I samsvar med andre reseachers «tidligere studier [29], flowcytometri analyse viste at gefitinib redusert celler i S og G
2 /M-fasen. En slik reduksjon av celler i proliferativ fase kan dempe celle følsomhet for senere brukt docetaxel som selektivt rettet mot G
2 /M fase celler, og resultere i antagonistiske effekter.
Konklusjon
samlet våre data antydet at blant kombinasjons modaliteter tilgjengelig i klinisk arbeid, er den mest effektive tilnærmingen var sekvensen av å bruke cytostatika etterfulgt av EGFR-TKI. Fosforylering av EGFR og ERK kan ha bidratt til denne synergi. Men siden bare to cellelinjer ble inkludert i denne studien, utvidelse til et panel av NSCLC cellelinjer med ulik EGFR status samt
i
vivo
studier på dyremodeller er garantert videre vurdere planen avhengig effekt. Det er også verdt å sammenligne de tre kombinasjons tidsplaner i kliniske studier for å identifisere mulige «optimal» behandling modalitet for pasienter med avansert NSCLC.
