Abstract
Utvilsomt eggstokkreft er en irriterende, uhelbredelig sykdom for pasienter med tilbakevendende kreft og terapeutiske alternativer er begrenset. Selv om polycomb gruppe genet,
Bmi-en
som regulerer selvfornyelse av normale stamceller og stamceller har vært innblandet i patogenesen av mange menneskelige kreftformer, men en rolle for Bmi-en i å påvirke kjemoterapi respons har ikke vært adressert før. Her viser vi at stanse Bmi-en reduserer intracellulære GSH nivåer og dermed sensitizes kjemoresistent eggstokkreft celler til kjemoterapeutika som cisplatin. Ved å forverre ROS produksjon i respons til cisplatin, aktiverer Bmi-en stanse DNA skade respons sti, caspases og kløyver PARP fører til induksjon apoptose i eggstokkreft celler. I en
in vivo
orthotopic musemodell for kjemoresistent eggstokkreft, knockdown av Bmi-en ved nanoliposomal levering hemmer tumorvekst betydelig. Mens cisplatin monoterapi var inaktive, kombinasjon av Bmi-en stanse sammen med cisplatin nesten helt avskaffet eggstokktumorvekst. Sammen disse funnene etablere Bmi-en som et viktig nytt mål for terapi i kjemoresistent eggstokkreft
Citation. Wang E, Bhattacharyya S, Szabolcs A, Rodriguez-Aguayo C, Jennings NB, Lopez-Berestein G, et al. (2011) Styrking Kjemoterapi Response med Bmi-en lyddemping i eggstokkreft. PLoS ONE 6 (3): e17918. doi: 10,1371 /journal.pone.0017918
Redaktør: Sujit Basu, Ohio State University, USA
mottatt: 21 januar 2011; Godkjent: 15 februar 2011; Publisert: 21 mars 2011
Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Marsha Rivkin Pilot Award (RB), CA136494, CA135011 (PM) og P50 CA083639, U54 CA151668 (AS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft har høyest dødelighet blant alle gynekologiske kreftformer [1]. Til tross for innledende respons på kirurgisk debulking og front-line platina /taxan kjemoterapi, de fleste svulster etter hvert utvikle en resistent tilbakefall [2], [3]. Tyder på at cisplatin motstand kan være et resultat av en defekt apoptotisk program. I dette tilfellet ville økte nivåer av DNA-skade være nødvendig for å indusere signalet initiering av apoptose [4], [5].
BMI-1
, en polycomb gruppe gen, regulerer den proliferative aktivitet av normale stamceller og forløperceller [6]. Det er også uunnværlig for den selvfornyelse av nevral [7], [8] og hematopoietiske stamceller [9]. BMI-1 blir ofte oppregulert i en rekke kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene og dens korrelasjon med klinisk kvalitet /stadium, lymfeknutemetastase og dårlig prognose er blitt rapportert [10], [11], [12], [13], [14 ], [15], [16], [17], [18], [19].
BMI-1
fører til neoplastisk transformasjon av lymfocytter og samvirker med H-Ras gir opphav til metastatisk brystkreft hos mus [20], [21], [22], alle sterkt tyder på et oncogent rolle i epitelial malignitet. I tillegg, eggstokkreft isolerte stamceller utviser mye høyere BMI-1-nivåer sammenlignet med de differensierte eller paren bulk tumorceller, og har øket resistens overfor cisplatin, og paclitaxel sammenlignet med tumorceller [23]. Også økt uttrykk av Bmi-en var en av de viktigste regulatoriske faktorene en cellulær fenotype fanget av uttrykket av en død-fra-kreft signatur i et bredt spekter av behandlingsresistent klinisk dødelige kreftformer [24]. Til tross for dette vell av informasjon en mulig rolle for Bmi-en i å påvirke kjemoterapi respons ikke er behandlet før. I denne sammenheng vil bestemme mekanismen som Bmi-en stanse sensitizes kreftcellene til cisplatin være viktig for utvikling av nye terapeutiske strategier for å bekjempe kreft i eggstokkene.
De mest aktive kjemoterapi i eggstokkreft er platina analoger, cisplatin og karboplatin. Den antitumor aktivitet av cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum (II) ble oppdaget av Rosenberg og kolleger i 1961 [25]. Cisplatin har vært den mest aktive stoffet for behandling av eggstokkreft for de siste 4 tiår og prognosen for kvinner med eggstokkreft kan defineres ved den tumorrespons overfor cisplatin [26]. Selv om de fleste pasienter med kreft i eggstokkene svare på front-linje platina kombinasjonskjemoterapi de fleste vil utvikle sykdommen som blir resistente overfor cisplatin, og til slutt vil gi etter for sykdommen [26]. dermed metoder for å forebygge eller overvinne motstand mot cisplatin kan ha en stor innvirkning på kampen mot denne sykdommen.
Her viser vi at
Bmi-en
spiller en viktig rolle i sensibilisering av kjemoresistent eggstokkreft celler til cisplatin. Vi viser også at dette sensibilisering er via en ny reaksjonsvei modulert av BMI-1 for fremstilling av reaktive oksygenarter (ROS) induksjon forårsaker inngrep av DNA-skade respons (DDR) vei som fører til apoptose. Vi også etablere Bmi-en som en gyldig terapeutisk mål
in vivo
bruker en lett oversett tilnærming av nanoliposomal levering av siRNA i en orthotopic musemodell for eggstokkreft.
Resultater
knockdown av Bmi-en øker cisplatin følsomhet in vitro
Vi har tidligere vist at reduksjon av BMI-en proteinnivåer i eggstokkreft celler ved hjelp av mikroRNA 15a /16 avtar klonal vekst og spredning [27]. Her ønsket vi å teste om knockdown av Bmi-en påvirkes cisplatin mediert apoptose i eggstokkreft celler. Effektiv knockdown av BMI-1 i A-2780 og CP-70-celler ble bekreftet ved å sammenligne med de omkastede kontroll transfekterte celler etter 48 timer (fig. 1). De siRNA transfekterte celler ble behandlet med cisplatin i 48 timer, og apoptose bestemmes av Annexin /FITC-metoden. Apoptose i kjemosensitiv A-2780 kontroll siRNA transfekterte celler var ~35 og 55% ved behandling med 5 eller 10 uM cisplatin henholdsvis alene. I motsetning til dette, apoptose i kjemoresistent CP-70 var ~17 og 40% ved behandling med 10 eller 20 uM cisplatin alene henholdsvis indikerer motstand til disse cellene overfor cisplatin-indusert apoptose (Fig. 1). Viktigere behandling av BMI-1 dempede celler med cisplatin konsekvent bedre apoptose i begge cellelinjene med ~15-20% (fig. 1). For begge cellelinjene, basalnivået av apoptose bestemmes uten behandling var ~ 10%. Apoptose forsøk med tre andre cellelinjer så som OVCAR-5, OV-202 og OV-167 ga lignende resultater (data ikke vist). Disse data bekreftet at knockdown av Bmi-en kan bevisstgjøre eggstokkreft celler til cisplatin-indusert celledød.
Den øverste panel demonstrerer effektiv knockdown av Bmi-1 av siRNA i eggstokkreft cellelinjer (SC = egge kontroll siRNA ) som bestemt ved Western blot. Det nederste panel viser prosent apoptose som bestemt ved Annexin /FITC-PI farging. Eggstokkreft celler transfektert med egge kontroll eller BMI-1 siRNA ble behandlet med eller uten cisplatin i 48 timer. NAC forhåndsbehandling ble utført i 1 time før tilsetning av cisplatin der det passer.
Nylig er det blitt rapportert at neuroner, thymocytter og benmargceller isolert fra BMI-1 null-mus har økte nivåer ROS enn sine vill type kolleger [28], [29]. Videre har studier rapportert involvering av ROS generasjon i cisplatin-mediert apoptose [30], [31]. Derfor, for å finne ut hvordan stanse av Bmi-en sensitizes resistente ovarian kreft celler til å cisplatin indusert apoptose, undersøkte vi en mulig involvering av ROS. Derfor BMI-1 eller kryptert-kontroll siRNA transfekterte eggstokkreft celler ble forbehandlet med N-acetylcystein (NAC) ved 1 mg /ml i 1 time fulgt av cisplatin behandling i 48 timer. Signifikant inhibering av cisplatin mediert apoptose i både kontroll og BMI-1 knockdown-celler ble observert i nærvær av ROS oppfanger NAC (fig. 1). Disse dataene indikerer at utvidet apoptose observert i cisplatin behandlet Bmi-en forstummet celler skyldes involvering av ROS og førte oss til å bestemme ROS produksjon som neste logiske steg.
knockdown av Bmi-en øker cisplatin -mediert ROS produksjon
neste fastsatte ROS produksjon i egge kontroll eller bMI-1 siRNA transfekterte celler behandlet med eller uten cisplatin ved å måle fluorescens hjelp DCFDA. Cisplatin behandling alene betydelig økt ROS generasjon på 10 um i A-2780 celler og på 10 og 20 um i CP-70 celler. I begge cellelinjene, knockdown av BMI-1 etterfulgt av en hvilken som helst cisplatin behandling økte signifikant ROS generasjon (fig. 2). Disse data underbygge våre tidligere observasjoner på apoptose og tar for gitt ROS som den primære årsaken til økt sensibilisering av eggstokkreft celler til cisplatin. For å bestemme en årsak til forverret ROS-mediert apoptose observerte vi neste bestemmes total cellulær glutation (GSH) nivåer.
eggstokk-kreft-celler transfektert med kryptert kontroll eller BMI-1 siRNA ble behandlet med eller uten cisplatin i 24 h. Deretter ble cellene inkubert med 5 uM karboksy-H2DCFDA i frisk HBSS i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble høstet med trypsin og fluorescens av de merkede celler ble målt ved en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og emisjonsbølgelengde på 530 nm ved hjelp av Fluorolog 3 (Jobin-Yvon Horiba). Forhold av gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) i forhold til ubehandlet egge kontroll er representert.
Bmi-1 regulerer GSH produksjon
Redusert GSH er en kritisk komponent i cellens antioksidantnettverk , som er direkte involvert i spyle ROS og i å opprettholde tiol-proteiner i sin reduserte tilstand [32], [33], [34]. Dermed å finne en årsak til den økte ROS mediert apoptose observert i Bmi-1 forstummet celler, vi neste fastsatte total intracellulære GSH nivåer. Lysater ble fremstilt fra kryptert kontroll eller BMI-1 siRNA transfekterte celler behandlet med eller uten cisplatin. Knockdown av Bmi-en alene betydelig redusert cellulære GSH nivåer (~ 30% i A-2780 og ~40% i CP-70), og dette ble ytterligere redusert når den kombineres med cisplatin behandling (~45% i A-2780 og ~56% i CP-70) (fig. 3). Cisplatin behandling alene hadde imidlertid ingen effekt på GSH-nivåer. Disse data tyder på at i det minste noen av oksidativt stress-medierte effekter observert i BMI-1 knockdown eggstokkreft celler er på grunn av redusert intracellulære GSH-nivåer.
toppanelet representerer de totale cellulære GSH målt (Materialer og metoder) ovarialkreft celler transfektert med egge kontroll eller BMI-1 siRNA behandlet med eller uten cisplatin i 24 timer. Det nederste panel representerer fold forandring i genekspresjon (normalisert med beta-aktin og sammenlignet med egge kontroll), som bestemt ved kvantitativ RT-PCR av eggstokkreft celler transfektert med egge kontroll eller BMI-1 siRNA i 48 timer.
for ytterligere å undersøke årsaken til redusert GSH innhold i Bmi-1 forstummet celler vi neste bestemt om uttrykket nivåer av de viktigste enzymer involvert i GSH biosyntesebanen ble endret. Vi utførte kvantitativ RT-PCR for å bestemme genuttrykk nivå av glutamat-cystein ligase (GCLM) og glutation syntase (GSS), i BMI-en siRNA transfekterte eggstokkreft cellelinjer. Glutamat-cystein ligase (GCLM) er den første hastighetsbegrensende enzym av glutation biosyntesebanen [35]. I det andre trinnet, glutation-syntetase (GSS), omdanner gamma-L-glutamyl-L-cystein til glutation [35]. Mens mRNA ekspresjon av BMI-1 ble redusert som forventet i BMI-1 dempede celler interessant mRNA ekspresjon av GCLM signifikant redusert mens det av GSS økes (fig. 3). Trenden var lik i begge eggstokkreft cellelinjer. Disse resultatene tyder på at endringen av GCLM, er tilstrekkelig til å redusere de totale cellulære GSH-nivåer og etterfølgende ganger økning i GSS mRNA-nivåer sannsynligvis representere en forsvarsmekanisme for cellene som prøver å avlaste oksidativt stress det hastighetsbegrensende enzym.
BMI -1 modulerer DDR pathway
for ytterligere å undersøke mekanismen av ROS mediert forbedret apoptose av cisplatin i Bmi-1 forstummet eggstokkreft celler vi ønsket å teste involvering av DNA skade og reparasjon (DDR) veien. Tidligere studier har rapportert at oksidativt stress kan føre til aktivering av DDR-reaksjonsveien [36]. For å teste dette bestemmes vi fosforylering nivåer av Chk2 og H2AX to viktige biomarkører for DNA-skade og aktivering av DDR-reaksjonsveien [37]. Cisplatin behandling alene indusert fosforylering av Chk2 og H2AX i en konsentrasjonsavhengig måte og knockdown av Bmi-en ytterligere forverret denne effekten (fig. 4A). I bekreftelse, ble økt kjernekraft foci formasjon observert av 53 BP1 immunoflourescence i CP-70 Bmi-en knockdown celler behandlet med cisplatin (Fig. 4B). Disse resultatene tyder på at vedvarende nivåer av ROS generert ved BMI-1 knockdown kombinert med cisplatin behandling er tilstrekkelig til direkte å skade DNA og engasjere den DDR pathway. En stor mengde litteratur som støtter DNA-skade kan føre til apoptose via aktivering av kaspaser [38], [39]. vi neste Derfor fortsatte å bestemme aktivering av caspases i Bmi-en forstummet eggstokkreft celler behandlet med eller uten cisplatin.
(A) eggstokkreft celler transfektert med egge kontroll eller Bmi-1 siRNA ble behandlet med eller uten cisplatin i 48 timer. Western blot ble utført for fosfor chk-2, total chk-2, fosfor-H2AX, total H2AX og beta aktin ved hjelp av respektive antistoffer. (B) Egge kontroll eller Bmi-1 siRNA transfekterte CP-70 celler ble utsatt for konfokalmikroskopi hjelp 53BP1 antistoff (rød) og DAPI (blå nukleær farging) for å demonstrere atom foci formasjon.
Bmi- 1 regulerer effektorer av apoptose
Etablert formidlere av apoptose inkludere caspases [40]. Vi neste fastsatte kløyving av caspase 8 og caspase 9 i kontroll kryptert eller Bmi-en siRNA transfekterte celler behandlet med eller uten cisplatin. Cisplatin behandling alene skyldes spaltning av kaspase 8, men ikke caspase 9. Det er sannsynlig at med høyere konsentrasjoner av cisplatin spaltning av caspase 9 kunne observeres. Viktigere er imidlertid kombinasjonen av BMI-1 knockdown og cisplatin behandling signifikant og doseavhengig øket spaltning av kaspase 8 og caspase 9 i begge cellelinjer (Fig. 5).
eggstokk-kreft-celler transfektert med egge kontroll eller BMI -1 siRNA ble behandlet med eller uten cisplatin i 48 timer. Western blot ble utført for caspase-8, caspase-9 og PARP ved hjelp av respektive antistoffer.
PARP er et av hovedmålene cleavage av aktiverte caspaser og spaltet PARP letter celle demontering, og tjener som en markør av celler som gjennomgår apoptose [40]. BMI-1 knockdown-celler, ble klar spaltning av PARP observert i et cisplatin doseavhengig måte (fig. 5). Alle disse
in vitro
data tyder på at cisplatin behandling av Bmi-1 knockdown celler øker apoptose ved å øke ROS produksjon, forårsaker engasjement av DDR sti og aktivere kaspaser. Vi neste satte å bestemme den terapeutiske effekten av stanse Bmi-en i en orthotopic kjemoresistent musemodell for eggstokkreft.
knockdown av Bmi-en øker cisplatin følsomhet in vivo
Neste terapeutiske potensiale bmi-en ble testet av
in vivo
levering av bmi-en siRNA hjelp DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatidylkolin) nanoliposomes i orthotopic CP-20 mus modell. Denne metoden for levering har blitt grundig kjennetegnet tidligere for varigheten av knockdown og har vist seg å mangle ikke-spesifikke inflammatoriske responser [41], [42]. For å simulere behandling av avansert små-volum sykdom, behandling ble initiert 1 uke etter tumorcelle-injeksjon. Mus ble delt opp i de følgende fire grupper (n = 10 mus pr gruppe): (a) å styre siRNA-DOPC (150 ug /kg ip to ganger ukentlig), (b) kontrollerer siRNA-DOPC + cisplatin (160 ug /mus ip ukentlig), (c) Bmi-en siRNA-DOPC (150 mikrogram /kg ip to ganger ukentlig), og (d) Bmi-en siRNA-DOPC + cisplatin (doser samme som individuelle behandlinger). Alle dyrene ble avlivet etter 4 ukers behandling. Effektiv knockdown av Bmi-en (-85%) ble først bekreftet ved RT-PCR (Fig. 6A). Behandling med BMI-1 siRNA alene resulterte i signifikant (-60%) reduksjon i tumorvekt sammenlignet med kontrollgruppen siRNA-gruppen. Kombinasjonsterapi med BMI-1 siRNA og cisplatin resulterte i enda større (~80%) reduksjon i tumorvekt i forhold til cisplatin eneste behandlede gruppe (Fig. 6B). For ytterligere å evaluere denne effekt, antall tumorknuter dannet i hver gruppe ble bestemt. Igjen kombinasjonsterapi viste størst effekt med ~70% færre tumorknuter i forhold til cisplatin eneste behandlede gruppe (Fig. 6B). Ingen åpenbar toksisitet ble observert i dyrene under behandlingen eksperimenter som vurderes av endringer i atferd, fôring vaner og mobilitet. Gjennomsnittlig kroppsvekt var også lik mellom behandlingsgruppene (data ikke vist).
For å vurdere virkningene av siRNA terapi på tumorvekst, behandling ble igangsatt en uke etter i.p. injeksjon (1,0 × 10
6 CP20) tumorceller. Mus ble delt inn i fire grupper (n = 10 mus per gruppe): (a) å styre siRNA-DOPC (150 ug /kg ip to ganger ukentlig), (b) kontrollerer siRNA-DOPC + cisplatin (160 ug /mus ip ukentlig), (c) BMI-1 siRNA-DOPC (150 ug /kg ip to ganger ukentlig), og (d) BMI-1 siRNA-DOPC + cisplatin (doser samme som individuelle behandlinger). Behandlingen ble videreført inntil 4 uker etter tumorinokulasjon før offer. (A) Total RNA ble isolert fra en del av tumorvev og underkastet RT-PCR ved anvendelse av primere for BMI-1 og beta-aktin. Den komparative C
t metoden ble brukt for å beregne den relative overflod av mRNA sammenlignet med den til beta-aktin uttrykk. Eksperimentet ble utført i triplikat og signifikans bestemt ved anvendelse av to-sidig Student t test, P 0,05 ble betraktet som signifikant. (B) Mus og tumorvekter og (C) antallet tumorknuter i hver gruppe ble sammenlignet ved bruk av Student t-test (for sammenligning av to grupper). En to-tailed P≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
Effekt av Bmi-en knockdown på spredning og apoptose in vivo
For å underbygge vår
in vitro
data vi neste undersøkt effekten av BMI-en knockdown på
in vivo
tumor celleproliferasjon og apoptose ved hjelp Ki67 og TUNEL farging. Kombinasjonsterapi med BMI-1 siRNA og cisplatin viste størst effekt med -50% reduksjon i proliferasjon sammenlignet med kontrollgruppen ubehandlede gruppe (fig. 7). På samme måte ble det observert en tilnærmet 80% økning i apoptose i kombinasjonsterapigruppen sammenlignet med kontrollgruppen behandlede gruppe (fig. 7). Derfor viser vi at stanse av Bmi-en i eggstokkreft celler enten
in vitro
eller
in vivo
øker apoptose i respons til cisplatin.
(A) Immunhistokjemisk farging for Ki67 og (B) TUNEL ble utført for å vurdere celleproliferasjon og apoptose. Original forstørrelse 200X. Kvantifiseringen er vist grafisk på høyre side. Behandlingsarmer ble sammenliknet med Student t test og P≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
Diskusjoner
Utvilsomt eggstokkreft er en irriterende, uhelbredelig sykdom for pasienter med tilbakevendende kreft og behandlingsalternativer er begrenset [1], [43]. Her viser vi Bmi-1 genet Slå som et effektivt alternativ, som i kombinasjon med cisplatin forbedrer terapeutisk effekt ytterligere. Videre har vi avgrense mekanismen for økt følsomhet til å være primært gjennom ROS produksjon. Front kjemoterapi ved kreft i eggstokkene involverer bruken av platina /taksan regime som er kjent for å indusere produksjon ROS. Vi posit at knockdown av Bmi-en vil vise seg effektiv i kombinasjon med dette regimet. I denne sammenheng en fersk rapport har vist Bmi-en for å bli rekruttert tidlig til dobbel tråd pause stedet ved ioniserende stråling skade [44]. Våre resultater underbygge og utvide denne ideen og demonstrere
in vitro Hotell og
in vivo Hotell som Bmi-en stanse synergizes med økt oksidativt stress fører til opphopning av DNA-skade og apoptose.
minst to tidligere publikasjoner demonstrert øket ROS-nivåer i nevroner, thymocytter og benmargceller isolert fra BMI-1-null-mus [28], [29]. Men årsaken til denne ROS produksjonen har blitt varieres i tilskrives p53 avhengig og uavhengig undertrykkelse av anti-oksidanter genekspresjon eller svekket mitokondrielle energetics [28], [29]. Vi viser her at i tillegg til disse banene BMI-1 styrer også cellulære GSH-nivåer ved å regulere transkripsjon av de som er involvert i GSH biosyntesebanen enzymer. Spesielt transkripsjon av GCLM er positivt regulert av transkripsjonsfaktorer slik som NRF-1 og NFkB. I sammenheng med BMI-1 knockdown, blir begge disse transkripsjonsfaktorer nedregulert i nevroner og gliomceller henholdsvis [28], [45]. Derfor er det mulig at BMI-en lyddemping fører til nedregulering av NRF-1 og eller NFkB i eggstokkreft celler, og dermed redusere transkripsjonen av GCLM som resulterer i redusert GSH-syntese. Viktigere her viser vi at Bmi-en ved å regulere ROS og GSH nivåer beskytter eggstokkreft celler fra kjemoterapeutiske fornærmelser.
DNA-skade svar pathway kan aktiveres ved gentoksisk stress som de som er forårsaket av kjemoterapeutika og oksidativ DNA-skade . Faktisk aktivering av DDR kan føre til en pause i cellesyklusprogresjon, begynnende alderdom eller apoptose. I henhold finner vi at den doble fornærmelse av oksidativ skade forårsaket av Bmi-en knockdown og cisplatin behandling, som er kjent for å forårsake dobbelttrådbrudd i DNA sammen med ROS-produksjonen tips terskelen for eggstokkreft celler mot apoptose ved å indusere fosforylering av i ) Chk2 og H2AX, ii) forårsaker kjernefysisk foci dannelsen av 53BP1 og spalting av apoptotiske markører som iii) kaspaser og PARP.
som vi har vist i våre
in vivo
eksperimenter, knockdown av bmi-en kan være nyttig i kliniske settinger på grunn av følgende grunner; a) nedregulering av Bmi-en forsterker cisplatin-indusert apoptose i eggstokkreft celler. b) BMI-1 er nødvendig for selvfornyelse og vedlikehold av stamceller inkludert eggstokkreft stamceller som per definisjon er resistente overfor kjemoterapeutiske [23]. c) Bmi-1 regulerer flere veier, mest fremtredende av disse er induksjon av telomerase fører til immortalization av melke epitelceller [46]. d) nedregulering av Bmi-1 fører til de-undertrykkelse av ink4a, som koder for tumor suppressors p16Ink og p19Arf som regulerer alderdom og apoptose [47]. Aktivering av disse banene har blitt påberopt som en viktig tumor suppressor barrieren, fordi disse banene fungere som potente hemmere av proliferasjon eller formering av skadede celler. e) I tillegg posit vi at cisplatin og BMI-1 virker på tilsvarende reaksjonsveier som påvirker mitokondriefunksjon og /eller gjennom økt ROS generasjon forårsake DNA-skade som fører til effektiv induksjon av apoptose. Økte nivåer av DNA-skade da forsterke signalet initiere apoptose. Dermed Bmi-en er et viktig nytt mål for terapi ikke bare i kjemoresistent eggstokkreft, men også for andre kreftformer preget av overekspresjon av Bmi-en.
Materialer og metoder
Reagenser
Bmi-1 antistoff var fra Zymed, CA, USA. Bmi-en og egge kontroll siRNA var fra Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Fosfor-H2AX, Phospho-chk-2, 53 BP1 spaltes caspase-8, caspase-9 og PARP antistoffer var fra Cell Signa Technologies Inc., MA. Annexin /FITC-PI apoptose kit var fra Biovision Inc.
Cell Culture
A-2780 og CP-70 celler ble dyrket i RPMI med 10% FBS og 1% antibiotika (penicillin /streptomycin ) i henhold til leverandørens anbefaling. CP-20 cellelinjer ble dyrket i henhold til våre tidligere publiserte prosedyrer [48].
siRNA transfeksjon
eggstokkene celler A2780 eller CP-70 ble dyrket i sine respektive medium for en dag før transfeksjon. Bruke oligofectamine cellene ble transfektert med 25 nM egge kontroll eller Bmi-en siRNA. Etter 48 timer ble cellene behandlet for vestlige blot eller apoptose analyser [49].
Western Blot
Høstet eggstokkreft celler, både behandlet og ubehandlet, ble vasket i PBS og lysert i iskald radioimmunopresipitasjon (RIPA) buffer med ferskt tilsatt 0,01% protease inhibitor cocktail (Sigma) og inkubert på is i 30 min. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering ved 13 000 rpm i 10 min ved 4 ° C og supernatanten (30-50 ug protein) ble kjørt på en SDS-PAGE [49].
ROS assay
<
