Abstract
Bakgrunn
For tiden tilgjengelige metoder for diagnose og iscenesettelse av prostatakreft mangler sensitivitet til å skille mellom pasienter med indolent prostatakreft og de som krever radikal behandling. Endringer i viktige adherens (AJ) og stram junction (TJ) komponenter har blitt hyllet som potensielle biomarkører for prostatakreft progresjon, men mesteparten av forskningen har blitt utført på enkeltmolekyler.
Mål
for å belyse et panel av biomarkører som kan hjelpe skille sovende prostatakreft fra aggressive metastatisk sykdom.
Metoder
Vi har analysert uttrykket av 7 kjente AJ og TJ komponenter i cellelinjer som stammer fra normal prostata epitelvev (PNT2), non-invasiv (CAHPV-10) og invasiv prostatakreft (LNCaP, DU145, PC-3) ved hjelp av genuttrykk, western blotting og immunfluorescens teknikker.
Resultater
claudin 7, α -catenin og β-catenin protein uttrykk var ikke signifikant forskjellig mellom CAHPV-10 celler og PNT2 celler. Men i PC-3 celler, protein nivåer for claudin 7, α -catenin signifikant nedregulert (-1,5 fold, p = 0,001) eller henholdsvis umulig å oppdage. Immunofluoresence viste β-catenin lokalisering i PC-3 celler til å være cytoplasma i motsetning til membranseptum
Konklusjon
Disse resultatene tyder på avvik claudin 7, α -. Og β-catenin uttrykk og /eller lokalisering mønstre kan være mulige markører for å skille lokalisert prostatakreft fra aggressive metastatisk sykdom når det brukes sammen
Citation. Morgan C, Jenkins SA, Kynaston HG, Doak SH (2013) The Role of adhesjonsmolekyler som Biomarkører for aggressive prostate Cancer Phenotype. PLoS ONE 8 (12): e81666. doi: 10,1371 /journal.pone.0081666
Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, Frankrike
mottatt: 28 juni 2013; Godkjent: 17 oktober 2013; Publisert: 16.12.2013
Copyright: © 2013 Morgan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prostata Handling (tilskudd referansenummer G2009 /27) og The St Davids Medical Foundation, College of Medicine, Swansea University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (CAP) er den vanligste kreftformen hos menn i Storbritannia. Hvert år nesten 35.000 tilfeller av CAP er diagnostisert, og det står for om lag 12% av alle mannlige dødsfall fra kreft i Storbritannia [1]. Tidlig diagnose av organ begrenset Cap er viktig siden radikal prostatektomi eller strålebehandling tilbyr den eneste sjansen for fullstendig helbredelse og behandling av avansert sykdom er palliativ og in-effektive (på lang sikt). I tillegg er tidlig organ-begrenset cap ikke alltid livstruende, og kan følge og lat kurs som ikke krever behandling. Det er generelt akseptert at tilgjengelige metoder for diagnose og iscenesettelse av Cap (prostata spesifikt antigen nivåer, Gleason score og klinisk og patologisk klasse) mangler sensitivitet til å skille mellom pasienter med indolent, orgel-begrenset cap, de som krever radikal behandling og dem med risiko for tilbakefall etter behandling radikal. Klart det er et behov for å identifisere molekylære markører for Cap progresjon, invasjon og metastase å forutsi diagnose og veilede terapi.
For en kreft til metastasise, celler må først bryte vekk fra den primære svulsten. I epitelvev, blir cellene koblet til hverandre ved hjelp av membran strukturer kalt tett veikryss (TJ), adherens knutepunkter (AJ) og desmosomer [2]. Sammen har de opprett arkitektur av epitel. AJ proteiner omfatter cadherin og catenin familier. E-cadherin er hovedsakelig til stede i epitel, og representerer det prototypiske medlemmer av den familie cadherin. Det cytoplasmatiske domene av E-cadherin binder seg til cytosoliske proteiner som kalles catenins (α, β og P120) [3]. β-catenin binder direkte til E-cadherin mens α-catenin binder indirekte via sin interaksjon med β-catenin [4]. Sammen med desmosomer de er primært ansvarlig for adhesjon mellom tilstøtende celler [5] og som danner stabile celle-celle-kontakter. TJ skille de apikale og basolaterale regioner av plasmamembranen og regulere passasjen av ioner, vann og makromolekyler over hele epitelet [6]. TJS består av membranbundne proteiner (Claudins, occludin, tricellulin) og deres adapter og stillaser proteiner (junctional adhesjonsmolekyl, ZO-1 ZO-2 ZO-3 cingulin, MUPP1) [7].
Inntil nylig har TJs bare blitt oppfattet som cellulære sel [8]. Nå, derimot, tap av TJ proteiner blir anerkjent for sin tilknytning til en rekke kreftformer. Deregulering av TJ-proteiner er forbundet med tap av epitelcelle-polaritet og dedifferentiation som er et kjent arrangement i tidlig stadium karsinogenese [7]. I dårlig differensiert bryst [9], [10], skjoldbruskkjertel [11], endometrial [12] og gastrointestinal [13] cancer ekspresjon av stramme koblings proteiner har blitt vist å bli redusert, mens i brystkreftpasienter «tap av funksjonelle TJ proteiner er også blitt forbundet med en dårligere prognose [14], [15]. Siden TJ proteiner er definert som det punktet hvor membraner av to celler delta sammen de utfører en viktig funksjon ved å holde cellene sammen, og er en viktig barriere som kreftceller må overvinne for å spre [16].
Mens bevis fortsetter å vokse om uttrykket av TJ og AJ komponenter i kreft de fleste studiene er rettet mot å undersøke enkeltmolekyler. Kreft er heterogene av natur og derfor er det umulig å diagnostisere kreft eller forutsi sykdomsutviklingen ved hjelp av et enkelt biomarkør.
Vi benyttet fem kommersielt tilgjengelige prostatacellelinjer avledet fra normal prostata epitel, ikke-invasiv prostatakreft og metastatisk kreft for å analysere ekspresjon av 7 velkjente AJ og TJ komponenter, identifisert som avvikende uttrykt i prostata cancer vevsprøver [17], [18], [19], [20], [21], i det første trinnet av potensielt belyse et panel av biomarkører som kan skille lat kreft fra aggressive metastatisk sykdom når de brukes sammen.
Materialer og metoder
Cell kultur
prostata epitelceller (PNT2) og prostata kreft celler avledet fra metastatisk kreft til lymfeknutene (LNCaP) og ben (PC-3) ble oppnådd fra European Collection of Cell Cultures. Prostata kreftceller avledet fra ikke-invasiv prostatakreft (CAHPV-10) og kreft metastatisk til hjernen (DU145) ble kjøpt fra American Type Culture Collection. PNT2, LNCaP, DU145 og PC-3 ble rutinemessig dyrket i RPMI 1640, 2 mM L-Glutamin Glutamin og 10% (v /v) føtalt kalveserum (Invitrogen, Paisley UK). CAHPV-10-celler ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor og 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt (Invitrogen, Paisley UK).
Celler ble dyrket i en fuktig atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C. Cellene ble sub-dyrket ved hjelp av 0,25% trypsin /EDTA (Sigma-Aldrich, Dorset, UK).
Antistoffer
Primære antistoffer for mus ZO-1 og kanin Occludin, claudin-en og claudin -7 ble kjøpt fra Invitrogen (Paisley, UK). Kanin, α-catenin, β-catenin, E-cadherin og kanin β-aktin ble kjøpt fra New England Biolabs (Hertfordshire, UK). Pepperrot peroxidise konjugerte sekundære anti-mus /anti-kanin-antistoffer ble også kjøpt fra New England Biolabs (Hertfordshire, UK).
For immunofluoresence, flere primære antistoffer for α-catenin, β-catenin ble oppnådd fra Abcam ( Cambridge, UK). Anti-mus (Qdot655) og anti-kanin (Qdot525) sekundære antistoffer ble oppnådd fra Invitrogen (Paisley UK).
genekspresjonsanalyser
Total cellulær RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy utvinning kit ( Qiagen, Crawley, UK) og gjenværende DNA ble fjernet ved behandling med DNA-free ™ (Ambion, Cambridgeshire, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert fra en mikrogram RNA ved hjelp av tilfeldige primere og High Capacity cDNA syntese revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Real-time PCR reaksjoner ble utført i iCycler iQ termosykler (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) med SYBR Grønn deteksjonsmetodikk. Primersett (Tabell 1.) ble utformet for å være exon-exon strekker seg for å minimalisere muligheten for at et eventuelt forurensende genomisk DNA ville bli forsterket. De primersett brukte ble også testet for å sikre at de alle viste like forsterkning effektivitet. Alle reaksjoner ble utført i triplikat med 2 ul cDNA, 12,5 ul iQ SYBR grønn Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) og 0,2 uM forover og revers primere, i et sluttreaksjonsvolum på 25 pl. β-aktin og HPRT ble anvendt som referanse gener. PCR-amplifikasjon betingelsene var 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sek. Brett uttrykk ble normalisert mot normale prostata epitelceller PNT2 celler.
Western blotting
Totalt protein ble hentet ved hjelp av RIPA buffer (Sigma Aldrich, Dorset, UK). Tretti mikrogram protein ble kjørt på enten 7,5% eller 12% tris-glycin-PAGE-geler (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) avhengig av størrelsen av proteinet av interesse. Proteiner ble overført på nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk i lom /TBS for å inhibere ikke-spesifikk binding (alle Sigma Aldrich, Dorset, UK) og inkubert over natten ved 4 ° C ved anvendelse av primære antistoffer mot, Occludin (1:83), ZO- 1 (1:250), claudin-1 (1:125), claudin-7 (1:125) α-catenin (1:1000), β-catenin (1:1000) og E-cadherin (1:500) . β-aktin (1:1000) ble anvendt som en kontroll for protein lasting. Membranene ble vasket fri for primært antistoff og inkubert med pepperrotperoksydase konjugert sekundært anti-muse /anti-kanin-antistoffer (1:1000) i 1 time ved romtemperatur. Proteinene ble visualisert ved hjelp av Immun-Star WesternC chemiluminescene deteksjon kit (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) og relative uttrykk ble kvantifisert ved hjelp densitometry og nummer én program (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK). Western blot ble utført i duplikat.
immunfluorescens
Etter mRNA og protein analyse, claudin 7 α-catenin og β-catenin syntes å ha lignende uttrykk nivåer til normale prostataceller som ble endret i cellene avledet fra en aggressiv metastatisk svulst. Derfor immunofluoresence ble bare utført på disse molekylene for å fastslå om endringer i proteinekspresjon ble etterfulgt av avvikende lokalisering. Celler ble sådd ut ved 1 x 10
5 celler /ml bort på sterile objektglass som inneholdes i sterile quadriperm vevskulturplater (Invitrogen, Paisley UK). Celler ble stående over natten for å følge de lysbildene og dyrket til konfluens i 5 dager. Når celler ble sammenflytende medium ble fjernet, ble objektglass vasket to ganger med steril fosfatbufret saltløsning (PBS) (Invitrogen, Paisley UK) og fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA) (Sigma Aldrich, Dorset, UK) i 15 minutter ved romtemperatur. PFA ble fjernet ved å vaske objektglassene i PBS /100 mM glycin (Sigma Aldrich, Dorset, UK) 5 min tre ganger. Celler ble permeablised i 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 minutter og vasket i PBS tre ganger. Å slukke de reaktive gruppene følgende PFA fiksering ble objektglass inkubert i natriumborhydrid (Fisher Scientific, Leicestershire, UK) ved en konsentrasjon på 1 mg /ml i 10 minutter. Dette ble utført tre ganger, etterfulgt av en 5 minutters PBS-vask før blokkering av lysbildene i 10% bovint serumalbumin (BSA) /PBS i 30 minutter. Blokkering av oppløsning ble fjernet ved å utføre 3 x 2 minutters vaskinger i PBS. Glassene ble inkubert med anti-claudin 7 (1,100 i 1% BSA /PBS), α-catenin og β-catenin (1:50 1% BSA /PBS). Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C. Primært antistoff ble fjernet ved tre vaskinger x 5 min, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer (1:100 i 6% BSA /PBS) i 1 time ved romtemperatur. Sekundære antistoffer ble fjernet ved 3 x 5 min i PBS før Glassene ble vasket i vann (2 min) 70%, 85% og 95% etanol (2 min hver). Objektglassene ble analysert ved bruk av en AxioCam fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss Ltd, Hertfordshire, UK).
Negative kontroller (for å utelukke autofluorescens) ble utført ved å erstatte det primære antistoff i 1% BSA /PBS.
Statistisk analyse
analyse gjennomført bruk av parametrisk ANOVA test. Dunnetts post hoc-analyse ble utført for å sammenligne kreftceller med normale epiteliale PNT2 kontrollceller og Tukey post hoc-analyse ble utført for flere gruppesammenligninger. En
p
-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant
. MERK: Kun forskjeller i genuttrykk og proteinnivåer som tilfredsstiller både p-verdi og en biologisk fold-endring av 1,5 ville bli ansett som en vesentlig endring.
Resultater
Gene Expression Analysis
kvantitativ real-time PCR (Fig. 1) viste occludin mRNA nivåene var signifikant forskjellig mellom alle grupper (
p
0,001). En betydelig reduksjon i occludin mRNA nivåer ble observert i CAHPV-10 (-19,08 fold,
p
= 0,001), DU145 (-3,2 fold,
p
= 0,003) og PC-3 ( -4,3 fold,
p
= 0,003) prostatakreftceller sammenlignet med normale prostata epitelceller (PNT2). Det var ingen signifikant forskjell i occludin mRNA-ekspresjon mellom kreftceller uavhengig av invasive kapasitet. Men mRNA nivåene var signifikant opp regulert (2,2 ganger,
p
= 0,001) i LNCaP kreftceller sammenlignet med prostata epitelceller (PNT2).
Expression nivåer har blitt normalisert til normal prostata cellelinje PNT2 hvis ekspresjon nivå er satt til 1. * angir signifikant forskjell (P 0,05) sammenlignet med PNT2
Med hensyn til ZO-1, var det ingen signifikant forskjell i transkripsjonen. nivåer mellom normale prostata epitelceller og noen av prostata kreft celler.
claudin en genekspresjon ble betydelig ned regulert i alle kreftceller sammenlignet med PNT2. I CAHPV-10 og LNCaP prostata kreft celler, ble claudin en nedregulert -10 ganger (
p
= 0,001), henholdsvis og -100 ganger (0,001
p
= 0,001) og PC-3 viste en -3,8 fold (
p
= 0,001). Redusert uttrykk nivå
claudin 7 genuttrykk nivåer var lik mellom PNT2 og CAHPV-10 (uttrykk verdi 1,1). I kontrast, claudin 7 transkripsjon var betydelig opp regulert i LNCaP, (4,63 fold,
p
= 0,001), men ned regulert i DU145, (-5,3 fold,
p
= 0,004 ) og PC-3, (-24,8 fold,
p
= 0,01) sammenlignet med PNT2. Det var også en betydelig nedregulering i uttrykk nivåer når claudin 7 mRNA nivåer ble sammenlignet mellom CAHPV-10 og (DU145, (
p
= 0,02) og PC-3 (
p
= .. 0.001)
Transkripsjon nivåer for α- catenin var ikke signifikant forskjellig mellom PNT2, CAHPV-10, (-1,1 fold) eller LNCaP, (- 1 fold) En betydelig nedregulering ble observert ved -2,2 fold i DU145 og -33 ganger i PC-3 celler, (begge p = 0,0001). Når mRNA nivåer for CAHPV-10 ble sammenlignet med DU145 og PC-3, ble en betydelig nedregulering i uttrykket oppdaget (både DU145 og PC-3
p
= . 0.001)
β-catenin genekspresjon var signifikant nedregulert i CAHPV-10 celler, (-3 ganger,
p
= 0,015) sammenlignet med PNT2 mens en betydelig oppregulering ble observert i LNCaP, (3,8 fold,
p
= 0,001), DU145, (2,2 fold,
p
= 0,001 ) og PC-3, (2,1 fold,
p
= 0,001). Det var også en signifikant oppregulering i uttrykk nivåer når mRNA nivåer for CAHPV-10 ble sammenlignet med DU145 (
p
= 0.006) og PC-3 (
p
= 0,001).
E-cadherin genuttrykk nivåer ble betydelig redusert i CAHPV-10 (-2,3 fold,
p
= 0,004), DU145 (-5,6 fold,
p
= 0,001) og PC-3 (-7,25 fold,
p
= 0,001) sammenlignet med PNT2. Det var ingen signifikant forskjell i E-cadherin genuttrykk nivåer mellom de ikke-invasive og invasive prostata kreft celler. I kontrast til LNCaP cellene igjen viser en signifikant oppregulering av E-cadherin i forhold til PNT2 (1,6 ganger,
p
= 0,037).
Protein Expression Analysis
Western blot og Tetthetsmåling ble utført (fig. 2) for å fastslå hvorvidt mRNA-ekspresjonsnivåene var sammenlignbare på proteinnivå (tabell 2). Protein nivåer for occludin ble nedregulert i prostatakreftceller CAHPV-10 (-2,8 fold), DU145 (-1,6 ganger) og PC-3 (-9,3 fold), men oppregulert i LNCaP (2,4 ganger) i forhold til PNT2. Men på grunn av den høye variasjon mellom replikater (data ikke vist), var det ingen signifikant forskjell mellom noen av prostataceller.
β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Western blots ble utført i duplikat og bånd er representative for resultatene som oppnås.
Protein nivåer for ZO-1 viste ingen signifikant annerledes over noen av cellelinjene (CAHPV-10 1,1 fold, LNCaP 3,6 ganger, DU145, 2,5 ganger og PC-3 -1,1 fold).
i forhold til PNT2, claudin 1 ble redusert i alle prostatakreftceller. CAHPV-10 ble nedregulert -2,1 fold, DU145 -2,3 fold og PC-3 -1,8 fold. LNCaP var den eneste cellelinjen for å vise en betydelig nedregulering i forhold til PNT2 (-9,3 fold,
p
= 0,04).
claudin 7 proteinnivåer viste ingen forskjell mellom CAHPV-10 ( 1,2 ganger) og PNT2 men nivåene var signifikant nedregulert i LNCaP (-1,1 fold), DU145 (-1,1 ganger) og PC-3 (-1,5 fold). Alle hadde en
p
= verdi på 0,01. Men LNCaP og DU145 oppfyller ikke den biologiske fold-endring og derfor disse endringene ble ikke tatt hensyn til. I tillegg, når claudin 7 proteinnivåer for CAHPV-10 ble sammenlignet med PC-3, en betydelig nedregulering er også dokumentert (
p
= 0,01)
Med hensyn til. a- catenin protein nivåer, var det ingen signifikant forskjell mellom CAHPV-10 og PNT2, mens for LNCaP (4,4 ganger,
p
= 0,03), DU145 (-2 ganger
p
= 0,04 ) α-catenin nivåene var signifikant nedregulert ved forskjellige grader i forhold til PNT2. For PC-tre en betydelig nedregulering i α – ble observert catenin protein nivåer, slik at et protein bandet var umulig å oppdage, og en densitometry verdi kunne ikke hentes. I tillegg CAHPV-10 protein nivåer var også signifikant forskjellig LNCaP (
p
= 0,03) og DU145 (
p
= 0,04).
Det var ingen signifikant forskjell i β-catenin protein nivåer mellom CAHPV-10 (1,1), LNCaP (2 ganger), DU145 (1,4 ganger) eller PC-3 (1,5 ganger) og PNT2, og dermed selv om PC-tre utstilt den biologiske ganger endring, resultatet ble ignorert
For E-cadherin protein nivåer en betydelig nedregulering var tydelig i CAHPV-10 (-1,7 fold,
p
= 0,01). og DU145 (-1,5 fold,
p
= 0,01). Igjen, en betydelig nedregulering i PC-3, slik at et protein bandet var umulig å oppdage, og en densitometry verdi kunne ikke hentes. I LNCaP celler E-cadherin var opp regulert på proteinnivå (2,7 ganger
p
= 0,01).
immunfluorescens
For å kunne fastslå om AJ og TJ proteiner var til stede ved deres riktige sub-cellulær beliggenhet (cellemembraner), immunfluorescens ble benyttet.
Immunofluorescence (fig. 3) for claudin 7 viste sterk farging i cellemembranen for PNT2, CAHPV-10 og LNCaP. For både DU145 og PC-3 ble fluorescerende farging redusert. Farging ble markert redusert i både DU145 og PC-3-celler med farging tydelig både ved cellemembranen og i cytoplasma. Farging for α- catenin viste sterk spesifikk farging på cellemembranen for PNT2, CAHPV-10 og LNCaP celler, mens for DU145 og PC-tre signalintensitet ble kraftig redusert og ikke spesifikke. Med hensyn til p-catenin fluorescens farging, PNT2, CAHPV-10 og DU145 oppviste spesifikk farging på cellemembranen. β-catenin intensitet i LNCaP og PC-3 celler var sterk på cellemembranen og på nettstedene til celle-celle kontakt, men i PC-tre flekker var også tydelig i cytoplasma.
For LNCaP celler, protein lokalisering opptrer ved cellemembranen og fargeintensitet ligner på PNT2 (med unntak av β-catenin, noe som synes å ha en høyere uttrykk). I DU145-celler, er uttrykk for alle proteiner redusert og lokalisering er diffus og cytoplasmisk. For PC-3 celler, claudin 7 og α- catenin blir fluorescens kraftig redusert og /eller cytoplasma i fordelingen, mens β-catenin fluorescens er sterkere, men også i cytoplasma i sin lokalisering.
Diskusjoner
det første trinnet i metastatisk kaskade er tap av celle-celle adhesjon for at cellene til å bryte vekk fra den primære svulsten. Dermed har AJs vært et stort fokus på kreftstudier og nå TJ komponenter blir også anerkjent for sitt engasjement. Endringer i viktige AJ og TJ komponenter som α-catenin, E-cadherin, β-catenin og claudin en har blitt hyllet som potensielle biomarkører for prostatakreft progresjon [18], [22], [23], [24] men flertallet av forskning er blitt utført på individuelle molekyler. Kreft er heterogene av natur, og derfor er det et behov for et panel av biomarkører, i motsetning til enkle molekyler, for å bidra til å bestemme kreft progresjon og i tilfelle av prostatakreft, kreft skille sovende fra aggressive metastatisk sykdom. Som et resultat, er målet med denne studien var å evaluere uttrykk for flere kjente TJ og AJ komponenter, kollektivt, som et viktig første skritt i å identifisere et panel av antatte biomarkører som kan hjelpe skille sovende prostatakreft fra aggressive metastatisk sykdom. Syv antatte biomarkører ble valgt på grunn av sin avvikende ekspresjon, som er dokumentert i den vitenskapelige litteratur og undersøkt i tidligere pasient sentrert studier [17], [18], [20], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. De 7 AJ og TJ proteiner valgt var E-cadherin, α- og β- catenin, ZO-1, occludin, claudin en og claudin 7 og deres uttrykk ble undersøkt ved hjelp av en
in vitro
modell av prostatakreft progresjon . Ut av 7, vi fremhevet tre (claudin 7, α- og β- catenin) som mRNA, protein nivåer og /eller lokalisering er like i celler avledet fra både normal og orgel-begrenset prostatakreft, men deres nivå og /eller lokalisering alle alter i celler avledet fra aggressive metastatiske svulster. Claudin 7 mRNA og proteinnivåer i ikke-invasive prostatakreftceller (CAHPV-10) var lik de som finnes i prostata epitelceller. I tillegg både mRNA og proteinnivåer signifikant nedregulert i den mest aggressive metastatisk cellelinje PC-3 i forhold til CAHPV-10. Disse resultater understøttes av Sheehan et al, som viste en reduksjon i claudin 7 ekspresjon korrelerte med prostatatumorer høy grad av [19]. Derfor kan claudin 7 protein nivåer være en refleksjon av aggressivitet av disse prostata kreft celler og kan bare endres i den mest aggressive formen av sykdommen. I tillegg er ytterligere analyse ved immunofluorescens viste at claudin 7 lokalisering i PC-3-celler ble cytoplasmiske så vel som membranbundet. Avvikende lokalisering av claudin 7 til cytoplasma har vist seg å forekomme i brystkreftceller [28] og spiserørs karsinomer [2]. Dette re-distribusjon av Claudins har blitt tilskrevet flere mekanisme inkludert protein nedregulering som resulterer i cytoplasma intern [2]. Basert på disse resultatene kan det være en hypotese at claudin 7 kan være en mulig kandidat for å skille lat kreft fra de mest aggressive metastatisk former, som krever validering i pasientprøver.
I kombinasjon med claudin 7, a -catenin nivåer i ikke-invasive prostatakreftceller var tilsvarende nivåer i prostata epitelceller, men som claudin 7, ble signifikant redusert i de mest aggressive metastatiske celler. En signifikant sammenheng mellom redusert α-catenin uttrykk og høy Gleason score har blitt rapportert i prostatakreft [24]. På samme måte har α-catenin blitt rapportert å være tilstede i prostata tumorer med en lav Gleason grad [17]. Det har derfor vært foreslått, at tap av α-catenin fører til tap av e-cadherin funksjon som fører til en dårligere prognose [18], mens repletion av α-catenin i α-catenin null prostatakreftceller har blitt rapportert å øke adherens krysset dannelse og redusert transkripsjonen aktivitet av β-catenin, cyclin D1 nivåer og celleproliferasjon [26].
for β-catenin mRNA protein nivåer og immunfluorescens fargeintensitet av CAHPV-10 celler var lik normal prostata epitelceller og interessant, immunfluorescens avslørte β-catenin i PC-3 celler til å være både membran og cytoplasma. β-catenin lokaliseres til cytoplasma som et resultat av adherens knutepunkt kompleks sammenbrudd og deretter translocates til kjernen hvor den utøver den transkripsjonelle virkning [29]. Denne avvikende lokalisering til cytoplasma har vist seg å bidra til thyroid carciongenesis [30] og knyttet til en dårlig prognose i brystkreftpasienter [31]. Våre resultater tyder på at det kan være aktuelt å se på cytoplasmatisk lokalisering av β-catenin, i motsetning til kvantitativt å vurdere det mRNA eller proteinnivåer, som en antatt biomarkør av aggressiv sykdom.
Det skal bemerkes at mRNA og protein ekspresjonsnivåene i LNCaP-cellelinjen sjelden fulgt den samme trend som DU145 og PC-3. Denne forskjell i ekspresjonsnivåene kunne forklares ved den metastatisk potensial og differensiering status av cellelinjen. LNCaP er dokumentert å ha begrenset metastatisk potensial og er fortsatt godt differensiert når introdusert i musemodeller [32]. Det kan således postulert at etter metastaser til lymfeknutene, har denne cellelinjen vende tilbake til en mer epitelial form som et resultat av kolonisering [33] og vekst. I tillegg var det også noen avvik mellom mRNA og proteinnivåer for claudin 7 og occludin i LNCaP og β-catenin i CAHPV -10 og DU145 og α-catenin i CAHPV-10 og LNCaP. Ettersom mRNA blir translatert til protein kan det antas at det skal være en sammenheng mellom mRNA og proteinnivåer. Men studier som har undersøkt en sammenheng mellom mRNA og protein uttrykk nivåer rapportert minimal eller begrensede sammenhenger [34]. Mengden av protein påvises, kan sannsynligvis bli påvirket av oversettings og post-transkripsjonelle modifikasjoner som gir en sekundær grad av ekspresjon kontroll som kan ta hensyn til disse forskjellene.
Konklusjon
På grunn av den heterogene natur av cancer , analyse av enkle molekyler gir begrenset informasjon, og det er umulig å diagnostisere kreft eller forutsi sykdomsutviklingen ved hjelp av et enkelt biomarkør. De 7 biomarkører analysert her, har blitt rapportert å være abnormt uttrykt i prostata kreft vevsprøver men hovedsakelig på individuell basis. Imidlertid vår
in vitro
undersøkelsen har vist at ut fra disse 7 bare tre (claudin 7, α-catenin og β-catenin) kollektivt kan brukes for å skille prostatakreft fra celler som representerer aggressiv metastatisk sykdom. Vi tror at dette
in vitro
identifisering av endringer i flere viktige gener i kombinasjon fremhever viktigheten av å utnytte flere molekylære markører og er et viktig første skritt i å identifisere et panel av antatte biomarkører som kan hjelpe skille sovende prostatakreft fra aggressiv metastatisk sykdom. En stor pasient IHC studien er nå nødvendig å validere disse resultatene.
