Abstract
Bakgrunn
Pasienter generelt dø av kreft etter svikt i eksisterende behandlinger for å fjerne restsykdom. En undergruppe av tumorceller, betegnet kreft stamceller (CSC), synes unikt i stand til å understøtte veksten av fenotypisk og histologisk ulike tumorer. Det har vært foreslått, derfor, at unnlatelse av å effektivt behandle kreft kan delvis skyldes fortrinnsrett motstand av disse CSC til kjemoterapeutiske midler. En undergruppe av menneskelige kolorektal kreftceller med en ESA
+ CD44
+ fenotype er unikt ansvarlig for tumordannelse og har kapasitet til å generere heterogene svulster i et xenograft innstilling (
dvs.
CoCSC). Vi antok at dersom ikke-tumorigene celler er mer utsatt for kjemoterapeutika, deretter rest svulster kan forventes å inneholde en høyere frekvens av CoCSC.
Metoder og funn
xenogene svulster initiert med CoCSC var lov til å komme ~400 mm
3, og da musene ble randomisert og kjemoterapeutiske regimer som innebærer cyklofosfamid eller Irinotecan ble igangsatt. Data fra enkelte svulst fenotypeanalyser og serie transplantasjoner utført i begrenset fortynning viser at rest svulster er beriket for celler med CoCSC fenotype og har økt tumorigent celle frekvens. Videre vises den iboende evne av gjenværende CoCSC å generere tumorer bevart. Aldehyd dehydrogenase en genekspresjon og enzymatisk aktivitet er forhøyet i CoCSC og bruke en
in vitro
kultur system som opprettholder CoCSC som demonstrert av serietransplantasjoner og lentiviral merking av enkelt celle-avledet kloner, vi viser videre at ALDH1 enzymatisk aktivitet er en viktig formidler av motstand mot cyklofosfamid. en klassisk kjemoterapeutisk middel
Konklusjoner
CoCSC er anriket i colontumorer følgende kjemoterapi og forbli i stand til raskt å regenerere svulster som de stammer. Ved å fokusere på biologi CoCSC, kan store resistensmekanismer til bestemte kjemoterapeutika tilskrives spesifikke gener, og dermed tyder veier for å bedre kreftbehandling
Citation. Dylla SJ, Beviglia L, Park IK, Chartier C, Raval J, Ngan L, et al. (2008) Colorectal Cancer stamceller er beriket i xenogene Svulster etter kjemoterapi. PLoS ONE 3 (6): e2428. doi: 10,1371 /journal.pone.0002428
Redaktør: D. Gary Gilliland, Brigham and Women Hospital, USA
mottatt: 29 november 2007; Godkjent: 08.05.2008; Publisert: 18 juni 2008
Copyright: © 2008 Dylla et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. MFC er grunnlegger og medlem av betalte Advisory board of OncoMed Pharmaceuticals Inc., og har en eierposisjon i selskapet. Alle andre forfattere er ansatt i OncoMed Pharmaceuticals Inc., et bioteknologiselskap med fokus på terapeutisk målretting av kreft stamceller som har søkt om patenter relatert til denne studien. Midler til disse studiene ble innhentet via privat finansiering; Men disse partiene hadde ingen rolle i beslutningen om å utføre, analysere eller publisere resultatene
Konkurrerende interesser. MFC er grunnlegger og medlem av betalte Advisory Board of OncoMed Pharmaceuticals Inc., og har en egenkapital stilling i selskapet. Alle andre forfattere er ansatt i OncoMed Pharmaceuticals Inc., et bioteknologiselskap som har søkt om patenter relatert til denne studien.
Innledning
Tilstedeværelsen av ulike cellepopulasjoner i normal og neoplastisk vev har lenge blitt anerkjent. Mens normalt vev struktur og funksjon er tilrettelagt av ulike celletyper, generert under utvikling og kontinuerlig erstattes for å opprettholde homeostase, er kreft generelt preget av uorganisert overproliferation. Fordi genetisk materiale blir spredd over lengre tid på grunn av selvfornyelse egenskapene til stamceller, har sammensatte mutasjoner som kreves for tumorigenesis blitt antatt å oppstå i disse sjeldne celler og ikke deres mer tallrike avkom, som har en begrenset levetid gang forpliktet til differensiering. Som vanlig vev-resident stamceller som støtter mobil hierarki bestående av et bestemt vev over levetiden til en person, er kreft stamceller (CSC) er definert av deres evne til å fornye seg selv på ubestemt tid, og samtidig opprettholde sin evne til å generere både tumorigent (TG ) og ikke-tumorigent (NTG) celler [1]. I motsetning til i normal utvikling, men kan neoplastisk progenitor-cellepopulasjoner få selvfornyelse evner, for derved også å oppfylle definisjonen av et CSC [2], [3]. Til syvende og sist, demonstrasjon av selvfornyelse og differensiering evner som definerer en stamcelle, både normal og neoplastiske, kan bekreftes ved serietransplantasjonsstudier som muliggjør diskriminering av celler som innehar selvfornyelse evne kontra de i stand til mange, selv om begrenset, ikke selv -renewing celledel [4].
CSC paradigmet hviler på fundamentet som svulsten heterogenitet kan genereres av en enkelt CSC. Fordi tradisjonelle cellelinjer og transplantater ikke rekapitulere de cellulære og morfologiske heterogenitet observert i xenografter som oppstår implantasjon av kreftceller tatt direkte fra pasienter og ikke passert
in vitro
, avhenger CSC biologi på sistnevnte form for xenografter. Selv om relevansen av disse, og alt har xenografter til pasientsvulster blitt avhørt [5] – [7], er transplantasjon av humane celler i mus den eneste modellen system som ikke utsetter menneskeceller til en aphysiological
ex vivo
miljø består av vev kultur plast og kulturmedium og som kan rekapitulere den cellulære heterogenitet av et primærtumor
in vivo
. Et annet tema for uenighet ved stiftelsen av CSC hypotese er forslaget om at fullstendig heterogenitet av en svulst kan skyldes en enkelt celle [8], [9]. Ser man bort fra stromal, endotel, og hematopoietiske elementer rekruttert og inkorporert inn i tumoren, er det blitt foreslått at TG og NTG populasjoner oppstår fra forskjellige celler og ikke fra en enkelt CSC [9]. Hvis CSC kan faktisk generere den cellulære heterogenitet observert i pasient svulster, og muse xenografter består av celler strengt passert
in vivo
beste opprettholde karakteristikkene av svulster hos pasienter, da fokus for arbeidet i kreft biologi feltet skal være holdent på disse cellene og deres microenvironmental nisje.
Kjemoterapeutiske strategier som retter seg raskt dele celler har i hovedsak blitt brukt til å behandle svulster i epitel opprinnelse. Mens ofte effektive ved debulking tumormasse, har disse midler stort sett ikke klarte å utrydde sykdom [10]. En grunn ofte tilskrives denne feilen er at undergrupper av celler få motstand mot terapi gjennom genetisk mutasjon og naturlig utvalg. Selv om denne formodning kan holde sann, særlig i en innstilling av langvarig behandling, en grunnsetning i «kreft stamcelle hypotesen» tar for gitt at cellene som er ansvarlige for tumorresidiv kan i seg selv være mer resistente overfor tumor debulking midler ved hvilket som helst av en rekke mekanismer ; dermed forklarer ildfast tumorvekst følge disse behandlingene [11]. Til støtte for denne hypotesen, kan motstand mot stråling resultat av forhøyet ekspresjon av DNA-skade responsgener, slik tilfellet er for CD133
+ glioblastom stamceller [12]. Analogt med hematopoetiske stamceller, er fast tumor CSC blitt foreslått å fremvise ekspresjon i høyt nivå av multitransportør familie gener, slik som ABCG2 og ABCB5, sannsynligvis som resulterer i mer effektiv utstrømning av kjemoterapeutiske medikamenter [13] – [15]. CSC kan også gå inn i cellesyklus sjeldnere, slik at de kan motstå toksisitet av legemidler som er rettet mot svært proliferative celler. Bevis for chemoresistance av stammelignende celler i epitel-cellelinjer og xenogene tumor-avledede celler som er blitt presentert [16] – [19]; Men har disse studiene enten benyttes cellelinjer tilpasset vev kultur og /eller vurderer ikke endret tumor-initiering celle frekvens
in vivo
etter kjemoterapi. Per definisjon er tumor initiere celler oppregnet i ettertid, frekvenser derfor endret CSC post-terapi er best demonstrert av serietransplantasjon.
Cyklofosfamid (CPA) og Irinotecan er agenter som er rettet mot prolifererende celler og blir ofte kjemoterapi i ved behandling av faste tumorer. Gjennom ulike mekanismer, både virke til å inhibere DNA-replikasjon som resulterer i demping eller inhibering av celledeling og som resulterer i apoptose. Motstand mot CPA har blitt foreslått å skyldes høy cytoplasma aldehyd dehydrogenase (ALDH) enzymaktivitet: særlig det av ALDH1 og ALDH3 [20], [21], som oksiderer og inaktivere det bioaktive metabolsk biprodukt av CPA, aldophosphamide /4-hydroxycyclophosphamide ( 4-HC) [22], [23]. ALDH1, spesielt, kan spille en viktig rolle i CPA motstand, som det er
K
m
for CPA er ~52 mikrometer, mens den for andre ALDH familiemedlemmer med CPA katabolsk aktivitet, ALDH3 (
ALDH3A1
) og SSDH (
ALDH5A1
), er 10 ganger lavere (
K
m
520 mm) [24]. Selv om mange vev er relativt robuste i kjølvannet av CPA behandling [25], har bare blodkreft og nevrale stamceller vist seg å inneholde høye ALDH aktivitet i rekonstituere transplantasjonsstudier etter isolering av disse cellepopulasjoner [26] – [28]. Fordi kolorektal kreft sannsynlig oppstår fra kolon stamceller eller stamceller, er det fristende å hypoteser om at lignende mekanismer kan gjøre CoCSC motstandsdyktig mot CPA.
Cancer stamcellepopulasjoner er nå prospektivt identifisert fra ulike svulster i epitel opprinnelse, inkludert bryst, colon og prostata [19], [29] – [33]. I alle kolorektal tumorer vi har undersøkt hittil, kan svulster være vellykket transplantert ved hjelp av små tall (
f.eks
1000) av celler fenotypisk positive for både epitel-spesifikt antigen (
dvs.
ESA eller EpCAM) og CD44 [30]. I noen svulster, isolering av celler som var positive for CD166, i tillegg til ESA og CD44, beriker ytterligere for kolorektal kreft stamceller (CoCSC), noe som muliggjør effektiv tumorigenesis med så få som 200 ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler [30]. Ikke bare gjør dette fenotype identifisere CoCSC i xenografttumorer, men tumorigenesis kan initieres fra primærtumorprøver med et lite antall ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler. Den reproduserbar identifikasjon av CoCSC bruker ESA og CD44 letter ikke bare effektstudier terapeutiske tvers av alle pasient avledet xenografter studert til dags dato, men også forenkler disseksjon av de molekylære stier involvert i tumordannelse og motstand mot terapi.
Her demonstrerer vi at menneskelig ESA
+ CD44
+ CoCSC generere adenokarsinomer som ligner foreldre svulster i både sin fenotype og histologi ved serie transplantasjon i en xenograft innstilling og er beriket i tumorer følgende klassiske kjemoterapeutiske regimer ment å krympe svulster. Vi ytterligere demonstrere både
in vitro Hotell og
in vivo Hotell som motstand mot CPA er mediert, i hvert fall delvis, av ALDH1 enzymaktivitet og at resistens mot andre kjemoterapeutika (
f.eks
Irinotecan) er ikke sannsynlig tilskrives denne mekanismen. Så langt vi kjenner til, er dette den første funksjonelle demonstrasjonen som en menneskelig epitelial CSC befolkning, som definert av serie transplantasjon, er beriket i rest solide tumorer etter kjemoterapi. Vi viser videre at tumor heterogenitet i form av et kompleks adenokarsinom sammensatt av TG og NTG populasjoner kan genereres av en enkel celle. Til slutt, de eksperimentelle metodene som brukes her gi en plattform for å vurdere effekten av nye midler rettet mot solide tumor stamceller.
Resultater
CoCSC er anriket i rest svulster etter CPA administrasjon
Tidlig passasje menneskelig xenografttumorer generert fra celler aldri utvidet
in vitro
synes å likne de i pasienter og dermed kan fungere som en utmerket modell ved å studere kreft. Vi har nylig vist at en undergruppe av menneskelige kolorektal kreftceller med en ESA
+ CD44
+ fenotype er unikt ansvarlig for å generere heterogene adenokarsinomer i en xenograft innstilling (figur 1A B) [30]. Humant ESA
+ CD44
+ -celler fra xenogene kolorektale tumorer kan videre deles på grunnlag av CD166 ekspresjon, noe som resulterer i anrikning for tumorigene (TG) celler blant den CD166
+ -populasjonen. I motsetning til dette, alle gjenværende kreftceller av human opprinnelse synes ute av stand til å initiere tumorvekst og er referert til som ikke-tumorgene (NTG). Etter å ha identifisert kolorektal kreft stamceller (CoCSC) er i stand til å fyre opp xenogene tumorvekst, forsøkte vi å ta en dvelende spørsmål i feltet om hvorvidt CSC er fortrinnsvis motstandsdyktig mot cellegifter.
A
) fenotypisk profilen til UM-C4 kolorektal tumorer for ESA, CD44 og CD166, etter utelukkelse av Mlın
– celler.
B
) Formalin fast, parafin innebygd kreft seksjoner fra CPA eller kjøretøy-behandlede kontroll mus farget med Hematoxylin Eosin (H UM-C6) og ved oppnådd ~400 mm
3, mus ble randomisert til enten bil eller 38 mg /kg CPA, to ganger ukentlig. Innen 15 dager etter randomisering og administrasjon, tumorvekst var merkbart tilbakestående i CPA-behandlede dyr (Tall 1C og figur S1 A). Etter euthanization, ble svulster fjernet for histologisk og fenotypeanalyser. Selv om andelen av voksende kreftceller (
dvs.
Ki-67
+) ikke vises endret, var det merkbart mer celledød (dvs. tunel
+ celler, figur 1B) og ESA
+ CD44
+ celler var hyppigere i svulster fra CPA-behandlede mus (figur 1D). Utviklingen mot hyppigere ESA
+ CD44
+ celler i CPA-behandlede svulster vanligvis holdt sant uavhengig av tumorvolum og ble mer uttalt ved høyere CPA doser (
f.eks
38 mg /kg versus 25 mg /kg; data ikke vist). Anriking av ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler var enda mer slående og særlig tydelig når CD166 uttrykk ble analysert på rest menneskelig ESA
+ CD44
+ celler (figur 1E, S1B 2,2 ganger hyppigere i CPA-behandlede svulster enn hos mus administrert kjøretøy (
P
= 0,0016; Tabell 1 figur 2A) . Viktigere, den cellulære fenotype av disse serielt transplanterte sekundære tumorer var identiske med de parentumorceller som brukes for å initiere undersøkelsen (figur 2B), som viser at mellomliggende behandling og serie transplantasjon av celler i begrensende fortynning ikke forandre enten det karsinogent potensial av CoCSC heller deres evne til å generere heterogene svulster som hovedsakelig inneholder ikke-tumorigent (
dvs.
CD44
-). celler
A) Begrense utvanning analyse av fraksjonerte UM-C4 tumorceller ble brukt til å beregne TG celle frekvens ved hjelp av
Poisson
fordelingsstatistikk (± 95% konfidensintervall; *
P
= 0,0016).
B
) Prosent av menneskelig ESA
+ CD44
+ og ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler i sekundære svulster som oppstår fra rest tumorigene celler transplantert serielt i å begrense fortynning følgende kjøretøy eller CPA behandlingsregimer.
Fordi TG celler var hyppigere og svulstcellepopulasjoner fra CPA-behandlede dyr ble beriket for fenotyper assosiert med CoCSC, vi neste isolert CoCSC fenotype celler fra UM-C4 svulster i kjøretøy- versus CPA-behandlede mus og spurte om disse cellene iboende skilte seg i deres evne til å generere sekundære svulster. Serie transplantasjon av 50 ESA
+ CD44
+ eller ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler fra svulster i CPA versus behandlede kontroll mus resulterte i videregående svulster med omtrent lik frekvens (tabell 1), som da sees i sammenheng med tidligere observasjoner tyder på at CoCSC er hyppigere i svulster utsatt for CPA kjemoterapeutiske regimer og er upåvirket i sin evne til drivstoff tumorvekst.
CoCSC har høyt uttrykk for
ALDH1A1
i søker etter flere CoCSC markører, vi brukte tidligere et verktøy som kan identifisere blodkreft og nevrale stamcellepopulasjoner: ALDH enzymaktivitet [30]. Bruke Aldefluor ™ reagens, som gjennomgår en endring i fluorescens etter enzymatisk spalting av ALDH enzymer, og ALDH1-spesifikk hemmer diethylaminobenzaldehyde (DEAB) [34], en stor undergruppe av ESA
+ CD44
+ celler fra både UM-C4 og UM-C6-tumorlinjer ble bestemt til å ha høy ALDH-aktivitet (figur 3A) [30]. Lignende observasjoner ble også gjort i andre pasient avledet xenograft kolorektal kreft linjer (Figur S2). Videre, når ESA
+ CD44
+ celler ble delt basert på ALDH aktivitet og isoleres ved FACS, ALDH
+ celler var tumorigent i alle tilfeller undersøkt [30]. Av notatet, er tumorigenitet strengt gitt av ESA
+ CD44
+ ALDH
+ celler i UM-C4 kolorektal svulst linjen (figur 3B). Selv om svulster kan oppstå fra ESA
+ CD44
+ ALDH
– celler tatt fra UM-C6, OMP-C5 og OMP-C8 tumorlinjer [30], en ALDH
+ undergruppe av TG ESA
+ CD44
+ celler eksisterer i alle xenogene kolorektale tumorlinjer undersøkt hittil (n = 6). I motsetning til en undergruppe av CD44
-. Celler med høy ALDH aktivitet finnes også i alle tumorlinjer, men disse cellene ikke klarer å generere svulster ved transplantasjon
A
) Fenotypisk profil menneskelige ESA
+ UM-C4 kreftceller for ALDH1 enzymatisk aktivitet. Gates avgrense tumor subpopulasjoner isolert ved FACS for tumorigenitet studier, hvor
B
) vekstkinetikk CD44
+ ALDH
+ (røde sirkler), CD44
+ ALDH
– (oransje bokser) og CD44
-ALDH
+ (grønne trekanter) populasjoner er plottet. Målinger gjenspeiler bare mus med følbar svulster. Data som representerer n = 3 uavhengige eksperimenter.
C
) Taqman QRT-PCR data som viser relative uttrykk for
ALDH1A1 product: (
1A1
),
ALDH3A1 product: (
3A1
)
og ALDH5A1 product: (
5A1
) i tumorigent (TG, svart) versus ikke-tumorigent (NTG, hvit) celler (n≥2) fra 2 pasient avledet xenogene kolorektale tumorlinjer (UM C4-amp; UM-C6). Data gjenspeiler Mean ± SEM, er normalisert versus
GUSB Hotell og vises i forhold til UM-C4 NTG uttrykk for hvert gen.
En undergruppe av ALDH enzymer kan oksidere, og dermed inaktivere, den cytotoksiske CPA metabolitten 4-HC /aldophosphamide [23], [35]. Tilstedeværelsen av cytoplasmatiske ALDH1 og ALDH3, spesielt, har vært assosiert med CPA motstand i kreftcellelinjen A549 lunge [20], [21]. ALDH1 (kodet av
ALDH1A1
) er større enn 10 ganger mer effektiv ved catabolizing 4-HC /aldophosphamide enn sine nærstående familiemedlemmer ALDH3 og SSDH: kodet av
ALDH3A1 Hotell og
ALDH5A1
gener, henholdsvis [24]. I Taqman ™ QRT-PCR analyse av UM-C4 og UM-C6 svulster,
ALDH1A1
uttrykkes vanligvis på et høyere nivå enn
ALDH3A1 Hotell og
ALDH5A1
.
ALDH1A1
genuttrykk er 2,8 ganger høyere i CoCSC enn i NTG celler, og til tross for svak økning av
ALDH3A1
uttrykk i CoCSC versus NTG populasjoner (Figur 3C), er dens budskap knapt detekterbart i enten svulst linje. I tillegg, mens
ALDH5A1
er litt forhøyet i TG versus NTG celler fra UM-C4 tumorer (~1.5-fold), er dens uttrykk lik blant disse populasjonene fra UM-C6 tumorer (Figur 3C). Fortrinns uttrykk for
ALDH1A1
i TG-celler som støtter observert enzymatiske aktivitetsmålinger mellom humane ESA
+ CD44
+ undergruppe, karakterisert ved at de fleste av disse cellene har høye DEAB-sensitive, ALDH1 aktivitet. Når vurderes i forbindelse med 10 ganger høyere ferdighet av ALDH1 versus ALDH3 og SSDH ved inaktive CPA mellom [24], kan man tolke disse resultatene som tyder på at CoCSC motstand mot CPA kan hovedsakelig mediert av ALDH1 enzymatisk aktivitet.
ALDH1A1
,
MYC
, og
MYB
er anriket i rest TG celler legge CPA terapi
Siden
ALDH1A1
genet uttrykket er forhøyet i TG versus NTG celler, er ALDH1 enzymatisk aktivitet uforholdsmessig høy i celler med CoCSC fenotype, og denne aktiviteten kan formidle motstand mot CPA, neste spurte vi om hyppigheten av ESA
+ CD44
+ ALDH
+ celler ble forhøyet i UM-C4, UM-C6 og OMP-C8 svulster fra mus som fikk CPA kontra de blir administrert kjøretøy. Som den observerte fenotypiske økning i CD166
+ celler (figur 1E, S1B S1C), den ALDH
+ undergruppe av ESA
+ CD44
+ celler var gjennomgående høyere i CPA versus kjøretøy- behandlede kontroll mus (67,6 ± 6,3% versus 56,8 ± 6,8%, henholdsvis; n = 5,
P
0,012 i paret
t
-test). (Figur 4A)
A
) Forholdet mellom ALDH
+ kreftceller blant menneske ESA
+ CD44
+ befolkningen i svulster fra kjøretøy-behandlet kontroll eller CPA-behandlede mus. Data gjenspeiler den sammenkoblede Mean av 5 uavhengige eksperimenter med 3 forskjellige xenogene kolorektal kreft linjer (UM-C4, UM-C6 OMP-C8) og n≥5 mus per eksperiment.
B
) Taqman QRT-PCR data for de betegnet gener ved hjelp av TG og NTG populasjoner isolert fra (V) kjøretøy- eller CPA-behandlede UM-C4 svulster. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n≥2).
C
) immunfluorescens eller immunoperoksidasefarging frosne eller formalinfiksert, parafininnebygd svulster for ALDH1 eller c-myc, henholdsvis fra kjøretøy- og CPA-behandlede mus. Svart bar = 100 mikrometer
En rekke genprodukter har vært ansett avgjørende for normal tykktarm utvikling og er mye uttrykt i tykktarmssvulster [36] -. [39]. Etter isolering av TG versus NTG populasjoner fra både kjøretøy- og CPA-behandlede UM-C4 svulster med 99% renhet, uttrykk av mange gener med foreslåtte bånd til tykktarmskreft ble bestemt av Taqman ™ QRT-PCR. De forskjellig uttrykt i TG versus NTG celler inkluderte ikke bare
ALDH1A1
, som beskrevet ovenfor (figur 3C), men også c-Myb (
MYB
) og c-Myc (
MYC
, figur 4B). I kontrast, gener assosiert med differensiering og en mesenchymale fenotype [40], [41], som vimentin (
VIM
), ble mer høyt uttrykt i NTG celler.
I samsvar med forhøyet frekvens av gjenværende tumorceller som uttrykker høye nivåer av tumorgenisitet-assosierte markører, så som CD166, relative uttrykk for CoCSC-assosiert versus NTG-assosierte transkripter, for eksempel
ALDH1A1
og
VIM
hhv ble ytterligere uensartede i CPA-versus bærer-behandlede kontroll-UM-C4-tumorer (figur 4B). I samsvar med hypotesen om at ALDH1 kan ha en rolle som formidler motstand mot CPA,
ALDH1A1
genekspresjon ble ytterligere forhøyet i rest celler med CoCSC fenotype, men
ALDH3A1 Hotell og
ALDH5A1
var ikke (Tall 4B S3). I tillegg gener som tidligere er identifisert som sterkt uttrykt i det epiteliale stilk /stamcellerommet i bunnen av kolon krypter og i neoplastiske vev (
f.eks MYB
n = 7 til UM-C4 og 1:52 ± 5; n = 3 for UM-C6). Kolonier ble dyrket i 14 dager uten aging før reimplantasjon i mus. Ikke bare gjorde cellene opprettholde ESA, CD44 og CD166 uttrykk under
in vitro
kultur (6A B), men evnen til å generere heterogene svulster som ligner foreldre svulster ble konservert i tillegg (figur 6C). For å validere at tumor initiere celler i svulster som stammer fra enkelt
in vitro
kolonier både lignet foreldre svulster og ble avledet fra en enkelt celle, UM-C4 celler ble transduced med et lentivirus bærer GFP-Luciferase, svulster ble generert og enkeltkolonier hentet fra ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler ble transplantert i mus. Ved høsting av disse tumorer avledet fra en enkelt koloni ble enten cellene med CoCSC fenotype eller alle andre tumorceller med forskjellige fenotyper isolert ved hjelp av FACS, og tumorigenisitet og klonalitet studier ble utført.
