Abstract
Bakgrunn
histondeacetylase hemmere (HDACis) er lovende kreftmedisiner ; Men de molekylære mekanismene som fører til HDACi-indusert celledød er ikke godt forstått og ingen klar resistensmekanismen er klarlagt for å forklare begrenset effekt av HDACis i kliniske studier.
Metoder og funn
Her viser vi at protein nivåer av sjekkpunkt kinase 1 (Chk1), som har en viktig rolle i G
2 cellesyklus sjekkpunkt regulering, ble kraftig redusert på protein og transkripsjonsnivået i lungekreftceller behandlet med pan-og selektiv HDACis LBH589, scriptaid, valproinsyre, apicidin, og MS-275. I HDACi behandlede celler Chk1 funksjonen ble svekket som bestemmes av redusert hemmende fosforylering av cdc25c og dens nedstrøms mål cdc2 og økt uttrykk av cdc25A og fosforylert histon H3, en markør for mitotisk oppføring. I tidskurs eksperimenter, skjedde Chk1 downregulation etter HDACi behandling, før apoptose. Ektopisk uttrykk for Chk1 vant HDACi-indusert celledød, og forbehandling av celler med cdc2 inhibitor purvalanol En blokkert inntreden i mitose og forhindret celledød ved HDACis. Endelig farmakologisk hemming av Chk1 viste sterk synergistisk effekt med LBH589 i lungekreftceller.
Konklusjoner
Resultatene definerer en sti gjennom hvilke Chk1 hemming kan megle HDACi-indusert mitotisk oppføring og celledød og tyder på at Chk1 kan være et tidlig farmakodynamisk markør for å vurdere HDACi effekt i kliniske prøver
Citation. Brazelle W, Kreahling JM, Gemmer J, Ma Y, Cress WD, Haura E et al. (2010) histondeacetylase hemmere downregulate Checkpoint Kinase en Expression å indusere celledød i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 5 (12): e14335. doi: 10,1371 /journal.pone.0014335
Redaktør: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Tyskland
mottatt: 25 juni 2010; Godkjent: 26 november 2010; Publisert: 14.12.2010
Copyright: © 2010 Brazelle et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert delvis av Moffitt Cancer Center SPORE tilskuddet i lungekreft. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
histondeacetylase inhibitorer (HDACis) utgjør en lovende ny klasse av forbindelser for behandling av kreft [1]. Noen HDACis viser bred aktivitet mot flere HDAC klasser (scriptaid, LBH589), mens andre er klasse eller isotype selektiv (MS-275) [1], [2].
De nøyaktige mekanismene som HDACis utøve sin cytotoksiske effektene er ukjent; derimot, er antitumor effekten av disse stoffene antas å resultere fra hyperacetylation av histoner, demetylering av genomisk DNA, og aktivering av gener som hemmer proliferasjon og indusere apoptose [1]. I tillegg til de epigenetiske effekter, har HDACis også vist seg å ha betydelige post-translasjonelle effekter på ikke-histonproteinene, inkludert transkripsjonsfaktorer p53, varmesjokkprotein 90 (HSP90), og α-tubulin [3]. Foruten direkte anti-tumorigen effekter, kan undertrykkelse av angiogenese ved HDACis også ha en innvirkning på tumorvekstinhibitering [4].
En viktig regulatorisk trinn for G
2 /M cellesyklus overgang i eukaryoter er aktivering av cdc2-syklin B-komplekset [5]. Den riktige regulering av cdc2 krever en aktiverings fosforylering på treonin–161 og hemmende phosphorylations på treonin-14 og tyrosin-15 (Tyr15) [6]. Den hemmende fosforylering på Tyr15 opprettholder cdc2-cyclin B-kompleks i en inaktiv tilstand hvis det er ufullstendig replikert DNA eller skadet DNA i cellen [7], [8]. Cdc2 aktivering ved fjerning av dets inhibitoriske fosforylering av cdc25 fosfatase tillater celler å gå inn i mitotiske fase av cellesyklusen [9]. Chk1 er en kritisk komponent i DNA replikasjon, intra-S-fasen, G
2 /M fase, og mitotiske spindel-monteringssjekkpunkter [10]. Som svar på en rekke genotoksiske stressfaktorer, blir Chk1 aktivert av oppstrøms kinaser så som ATM og ATR, som fører til økt proteosomal nedbrytning av fosfatase cdc25A og hemming av cdc25C gjennom serin-216 (Ser216) fosforylering, kollektivt å forårsake inaktivering av cdc2 og følgelig G
2 /M arrest [10] -. [14]
Videre kombinerer HDACis med regulatorer av G2 sjekkpunkt kunne forbedre effektiviteten og bidrar til å overvinne motstand. Faktisk har direkte farmakologisk hemming eller siRNA knockdown av Chk1 vist seg å føre til sjekkpunkt opphevelse, cytokinetic regresjon, og multinucleation, samt kromosom missegregation og kromosom ustabilitet [15]. Derfor Chk1 inhibitorer, som effektivt oppheve S og G
2 sjekkpunkter, blir undersøkt i kliniske forsøk, enten alene eller i kombinasjon med cytotoksiske midler [16] – [18], og kan effektivt kombineres med HDACi å forbedre cytotoksiske virkninger .
Her viser vi at HDACi behandling nedregulerer Chk1 protein uttrykk, som i sin tur fører til ukontrollert cdc2 aktivering, mitotisk oppføring, og celledød i humane lungekreftceller. Resultatene av denne studien viser at Chk1 nedregulering og oppheving av G
to sjekkpunktet er viktige regulerende trinn i sensitivitet og resistens overfor den cytotoksiske effekt av HDACi behandling i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler. Våre data tyder på at Chk1 kan være et tidlig farmakodynamisk markør for å forutse og vurdere effekten av HDACis og Chk1 hemmere kan forsterke cytotoksiske effekten av HDACis i kliniske studier.
Resultater
Behandling av NSCLC celler med HDACis fører G
2 /M cellesyklus arrest og celledød
Tidligere studier har vist at en pan-HDACi LBH589 (IC
50 varierer mellom ca 9 og 54 nmol /L) som forårsaker vekst arrest og celledød i NSCLC-celler [19]. For å analysere de molekylære mekanismer som HDACis regulere cellesyklusprogresjon og celledød, asynkront voksende A549 (EGFR villtype, K-Ras mutant, og p53 villtype) og PC9 (EGFR mutant, K-ras vill-type, og p53-mutant) [20] – [22]-celler ble behandlet med LBH589 (40 nM) i 24 timer og oppsamlet for flowcytometrisk analyse. Figur 1 viser at i PC9 og A549 celler LBH589 behandling produsert en merkbar økning i cellene i G
2 /M fase kan tyde på en G
2 /M blokade og en betydelig reduksjon i S-fase celler. Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere rapporter som HDACis føre til G
2 /M arrest og apoptotisk celledød i NSCLC celler [19].
En
, The asynkront voksende celler ble inkubert i medium med 5% FCS i 24 timer i fravær (kontroll, C) eller nærvær (L) av LBH589. Prosentandelen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse.
B
, Histogram fremstilling av cellesyklusdata bestemt ved strømningscytometrisk analyse.
Som vist i figur 2A, mikroskopisk undersøkelse av celler behandlet med LBH589 produsert en rekke forskjellige nukleære morfologi, fra binucleation til multinucleation. Til sammen viser disse data at LBH589 behandling forårsaker celledød assosiert med unormal mitose og sviktet cytokinese, noe som tyder på mitotisk katastrofe, en form for celledød som oppstår i løpet av mitose, og er tidligere blitt beskrevet i celler behandlet med den HDACi trichostatin A [ ,,,0],23].
A549-celler ble behandlet med bærer (kontroll) eller 40 nM LBH589 i 24 timer.
En
, pilene viser bi- eller multinucleated celler med nedsatt cytokinese i LBH589 behandlet NSCLC celler.
B
ble cellene fiksert og farget med DAPI eller spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (cPARP) antistoff (× 100 eller × 400 forstørrelse).
C
, Western blot analyse viser at HDAC hemming av LBH589 fører histon H3 fosforylering (H3-P10), histon H4 acetylering (acetylglucosamin-H4), og PARP cleavage (cPARP) i A549 celler behandlet med LBH589 for 24 timer. β-actin ble brukt som lasting kontroll.
Siden cellene i G
2 og M-fase kunne ikke bli diskriminert på grunnlag av deres forskjeller i DNA-innhold av flowcytometrisk analyse, vi testet enten celler arrestert i G
2 /M etter HDACi behandling skriv mitotiske fasen. For dette formål vi først utført immunfluorescens farging ved hjelp av antistoff mot spaltede poly (ADP-ribose) polymerase (cPARP) og viste at LBH589 behandling fører til apoptotisk celledød i 78% av binucleated mitotiske celler (figur 2B). Videre, i Western blot-analyse ble det undersøkt hvorvidt HDAC hemning forbedrer histon H3-fosforylering ved serin-10, som finner sted ved begynnelsen av mitose. Figur 2C illustrerer at LBH589 behandling forårsaket histon H3 fosforylering ledsages av økt histone acetylering og PARP cleavage, noe som indikerer at HDACi behandling fører NSCLC celler til å gå inn mitose og gjennomgår celledød. For å avgjøre om cellevekst og levedyktighet endringer observert etter LBH589 behandling er en generalisert effekt av HDAC hemming, vi også brukt en annen pan-HDACi, scriptaid (1 mm), som produserte biokjemiske endringer utvisket fra de som er presentert ovenfor bruker LBH589 (figur 3).
En
, A549, PC9, H1299, H292, H358, H441 og HCC827 cellene ble dyrket i nærvær av kjøretøy (C), eller LBH589 (LBH) 40 nM i 24 timer og uttrykk nivåer av cPARP, fosforylering av CDC2 (pCDC2
Y15), CHK1, og acetylert histon H4 (acetyl-H4) ble bestemt ved Western blot og kvantifisert ved hjelp AlphaEase programvare. p-aktin ble brukt som lasting kontroll.
B
, PC9 og A549-celler ble dyrket i nærvær av bærer (C), eller LBH589 (qh) 40 nM, eller scriptaid (S) 1 uM i 24 timer og uttrykk nivåer av cPARP, tyrosin-15 fosforylering av CDC2 (pCDC2
Y15), serin-216 fosforylering av CDC25C (pCDC25c
S216), CDC25A (T-CDC25A), CDC25C (T-CDC25C) og CDC2 (T-CDC2), acetylert histon H4 ( acetyl-H4), og cyklin B1 ble bestemt ved Western blot-analyse. p-aktin ble brukt som lasting kontroll.
C
, narkotika-mediert endringer i uttrykket av CHK1, CHK2, AKT, og c-RAF ble bestemt ved Western blot analyse. p-aktin ble brukt som lasting kontroll.
D
, PC9 eller A549 celler ble behandlet med eller uten 40 nM LBH589 og analysert for annexin positive celler ved hjelp av BD Annexin V-FITC /7-AAD flowcytometrisystemer kit.
E
, A549-celler ble behandlet med MS-275 (MS), (500 nM), valproinsyre (VA) (1 mM), eller apicidin (API) (400 nM) i 24 timer. Expression nivåer av cPARP, CHK1, pCDC2
Y15, og β-actin ble bestemt ved Western blot analyse. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger.
HDAC-inhiberende resulterer i aktivering av cdc25 og cdc2 proteiner som er nødvendige for mitotisk adgang
Aktivering av cdc2 proteinkinasen av cdc25-proteinet fosfataser er en sentral regulerende skritt for G
2 /M overgang i eukaryoter [9]. Den defosforylering av cdc25C på Ser216 øker sin aktivitet i løpet av M-fase-overgang, som fører til aktivering av cdc2-kinase [10]. For å undersøke hvorvidt HDACi-indusert mitotisk oppføring og celledød blir mediert av aktivering av cdc25 /cdc2 vei, PC9, A549, H1299, H292, H358, H441 og HCC827 celler ble behandlet med eller uten LBH589, og Western blot-analyse ble utført. Figur 3A viser HDACi behandlingen resulterte i økte nivåer av PARP-spaltning, er en reduksjon i den hemmende fosforylering på cdc2 og 45-94% reduksjon (basert på kvantitativ Western blot-analyse) i total Chk1 på tvers av 7 forskjellige NSCLC-cellelinjer, med A549s viser mest signifikant reduksjon i Chk1 protein. Disse endringene er alle forbundet med en økning i histone acetylering. Videre undersøkelser av A549 og PC9 celler behandlet med pan HDACis (Figur 3B), LBH589 og scriptaid, viste aktivering av cdc25C og cdc2, som vurderes av en nedgang i sin hemmende fosforylering på Ser216 og Tyr15, henholdsvis, som ble ledsaget av økt histon H4 acetylering. Ingen reduksjon ble observert i uttrykket nivåer av total cdc25C og cdc2 proteiner (Figur 3B). Disse resultatene indikerer at HDACi-indusert mitotisk oppføring er mediert ved øket cdc25 /cdc2 aktivitet. Videre HDACi behandling også økt uttrykk nivå av cdc25A, som er rettet av Chk1 for rask nedbrytning (figur 3B). Disse data viser at, i HDACi-behandlede celler, ble den biologiske funksjon av Chk1 hemmet.
I tillegg fosforylering ved Tyr15 stilling, en annen stor mekanisme som regulerer cdc2 aktivitet og progresjon inn i mitotiske fase av cellesyklusen er dets komplekse ferd med cyclin B, er en nødvendig kofaktor for cdc2-kinase-aktivitet. Dermed neste fastsatte vi om HDACi behandlingen påvirker cyclin B uttrykket nivåer. Som vist i figur 3B, NSCLC-celler behandlet med LBH589 eller scriptaid vises høyere totale nivåer av cyklin B1 uttrykk. Tatt sammen med redusert Tyr15 fosforylering av cdc2, innebærer dette funnet en høy cdc2-cyclin B aktivitet i HDACi-behandlede celler, noe som gir ytterligere støtte som celler behandlet med HDACis er i stand til å gå inn mitose.
Hemming av HDAC aktivitet korrelerer med redusert Chk1 uttrykk hos NSCLC celler
rekkefølgen og troskap av cellesyklusen er knyttet til integriteten til Chk1 og cdc25 fosfatase veier. Vedlikehold av Chk1 /cdc25 veien er viktig for celler til å utvikle seg normalt gjennom en uaffisert celledeling syklus og for cellene å arrestere i respons til sjekkpunkt aktivering [10].
For å finne ut hvilken rolle Chk1 i HDACi-indusert aktivering av cdc25C og cdc2, analyserte vi endringer i nivåene av Chk1 protein i celler behandlet med HDACis. Immunoblot-analyse viste at behandling med LBH589 eller scriptaid fører til en betydelig nedgang i ekspresjon av Chk1 protein (figur 3C). Denne hemming synes å være spesifikk, siden ingen endring ble observert i ekspresjonen av Chk2 protein, en annen regulator av DNA-skade sjekkpunkt signalveien [10], [11].
HDACis, inkludert LBH589, har blitt rapportert å funksjonelt å inaktivere HSP90-proteinet gjennom acetylering, noe som fører til uttømming av klient proteiner som AKT og c-RAF [22]. Interessant nok har Chk1 protein også blitt rapportert å være en HSP90-klient [24], [25], som tyder på at inaktivering av HSP90 ved HDACis kan være ansvarlig for degradering av Chk1 observert i våre eksperimenter. For å teste denne muligheten, analyserte vi enten Chk1 downregulation sammenfaller med redusert uttrykk for AKT og c-RAF i ekstrakter fremstilt fra celler behandlet med LBH589 eller scriptaid. Som illustrert i figur 3C, ble det ikke observert endringer i uttrykket nivåer av AKT eller c-RAF proteiner under forhold der LBH589 og scriptaid forårsaket Chk1 downregulation.
For ytterligere å demonstrere den cytotoksiske effekten av HDACi behandling på NSCLC celler vi målte apoptotisk celledød ved hjelp Annexin V deteksjon. Som vist i figur 3D, PC9 og A549-celler viste en målt økning i mengden av annexin-positive celler som indikerer at behandling med HDACi resulterer i signifikant økning i celler som gjennomgår apoptose.
å bestemme hvorvidt selektiv HDACis også føre til hemming Chk1 , A549 og PC9 celler ble behandlet med MS-275 som selektivt hemmer HDAC1, og i mindre grad HDAC3. Som illustrert i figur 3E, MS-275 (0,5 mm) fremstilt endringer i ekspresjonen av Chk1, fosforylert cdc2 (Tyr15), og cPARP lignende til resultatene observert med LBH589 og scriptaid. To andre klasse I HDACis valproinsyre (1 mM) og apicidin (400 nM) identiske resultater (figur 3E) også produsert. Disse dataene viser at HDACi-mediert Chk1 downregulation er ikke narkomane og klasse I HDACs er sannsynlige formidlere av den HDACi effekt på Chk1 downregulation hos NSCLC celler.
Chk1 opphevelse foran igangsetting av apoptose ved LBH589
Chk1 har blitt rapportert å være gjenstand for caspase-mediert nedbrytning i celler som gjennomgår apoptotisk celledød [26]. Følgelig vi analysert i tidsforløpseksperimenter om nedregulering av Chk1 protein observert i HDACi-behandlede celler er årsaken eller konsekvensen av apoptotisk celledød. Som vist i figur 4A, behandling av A549-celler med LBH589 førte til en nedgang i Chk1 protein 70% innen 1 time etter behandling, basert på kvantifisering av Western blot, som ble ledsaget av nedsatt fosfo-cdc25C (Ser216) og fosfo-cdc2 ( Tyr15) nivåer forenlig med funksjonell inaktivering av Chk1 aktivitet. Av betydning disse endringene skjedde før påviselig caspaseaktivering, som dokumentert av PARP cleavage som først ble observert 12 timer med behandling. En tilsvarende tidsforløpet profil ble observert i PC9 celler behandlet med LBH589 eller scriptaid (data ikke vist).
A549-celler var ubehandlet eller behandlet med LBH589 (40 nM) til forskjellige tidspunkter. Cellelysater ble utarbeidet, og protein uttrykk nivåer av cPARP, CHK1, Tyr15 fosforylering av pCDC2 (pCDC2
Y15), Ser216 fosforylering av CDC25C (pCDC25
S216), acetyl-H4, og cyclin B1 ble bestemt.
B
, Kvantitativ Chk1 mRNA uttrykk analyse. Totalt RNA ble fremstilt fra A549-celler etter 24 timers behandling med 40 nM LBH589 eller kjøretøy. mRNA uttrykk nivåer ble kvantifisert ved hjelp av Real-time PCR-analyse. Alle resultater ble normalisert til GAPDH mRNA nivåer, og gjennomsnitt og standardavvik verdier fra fire uavhengige forsøk er vist.
C
, ektopisk uttrykk for Chk1 reverserer HDACi-indusert apoptose, men ikke histone acetylering. A549 celler ble transient transfektert med en tom vektor (kontroll) eller GFP- eller FLAG-merket (GFP-CHK1 eller FLAG-CHK1) Chk1 uttrykk plasmid. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble cellene dyrket uten (kontroll, C) eller med LBH589 (L) (40 nM) i ytterligere 24 timer før høsting for Western blot-analyse. Behandlingsinduserte endringer i cPARP, acetyl-H4, fosfor-CDC2
Y15 og ectopically uttrykte GFP-CHK1 eller flagg-CHK1 proteiner ble bestemt ved Western blot analyse. p-aktin uttrykk ble brukt som lasting kontroll. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger, og et representativt eksperiment er vist. Pilene viser plasseringen av GFP-CHK1 og flagg CHK1 proteiner.
D
, i primær NSCLC pasientprøver, korrelerer Chk1 protein downregulation med økt cPARP
ex vivo
. Tumorprøver ble oppsamlet med en 23-gauge nål fra pasient-avledet tumorer, og cellene ble behandlet i duplikat med bærer (kontroll) eller LBH589 (40 nM) i 18 timer. Etter behandling, ble adherente og ikke-adherente celler samlet, celleekstrakter ble fremstilt, og ekspresjonsnivåene av cPARP, Chk1, og acetyl-H3 ble analysert ved hjelp av Western blot. p-aktin uttrykk ble brukt som lasting kontroll. SCC: plateepitelkarsinom; AC:.. Adenokarsinom
Sammen er disse resultatene støtte en modell der hemming av Chk1 uttrykk ved HDACis fører til celledød gjennom ukontrollert aktivering av mitosestimulerende fremme kinase cdc2 hos NSCLC celler
HDACi behandling fører til transkripsjonsnedregulering av Chk1
for å avgjøre om HDACi behandling regulerer Chk1 uttrykk på transkripsjonsnivået hos NSCLC celler, vi utførte real-time PCR. Som illustrert i figur 4B, kvantitativ RNA-analyse viste mer enn 50% reduksjon i Chk1 mRNA-nivåer i A549-celler 24 timer etter LBH589 (40 nM) behandling. Dette funnet viser at HDACi behandling fører til transcriptional undertrykkelse av Chk1 i NSCLC celler.
Ektopisk uttrykk for Chk1 seirer LBH589-indusert apoptose
For å finne ut betydningen av Chk1 downregulation i HDACi-indusert apoptose celle død, ønsket vi å finne ut om ektopisk uttrykk for Chk1 kan overvinne celledød utløst av LBH589. Derfor, A549-celler ble transient transfektert med et plasmid som koder for Chk1 et GFP-merket Chk1 fusjonsprotein. Som vist på figur 4C, forbigående ekspresjon av ektopisk Chk1 protein trykkes LBH589-indusert apoptose, som detektert av PARP-protein spaltning. I tillegg, i celler som uttrykker ektopisk Chk1, klarte ikke LBH589 behandling for å aktivere cdc2, som vurdert av Tyr15 defosforylering (figur 4C), mens ble det ikke observert endringer i HDACi-indusert histone acetylering. Lignende data ble oppnådd med et flagg-merket Chk1 uttrykk plasmid hos NSCLC celler (Figur 4C). Disse resultatene indikerer at Chk1 downregulation spiller en avgjørende rolle i HDACi-mediert celledød.
Chk1 downregulation korrelerer med apoptotisk celledød i grunnskolen NSCLC celler behandlet med LBH589
ex vivo
for å verifisere nedregulering av Chk1 i klinisk relevante tumorprøver, tumorceller hentet fra NSCLC pasient svulster ble behandlet ex vivo med LBH589. Totale proteiner ble pakket ut, og narkotika-mediert endringer i uttrykket av Chk1, histon acetylering, og PARP cleavage ble analysert ved Western blot. Som illustrert i figur 4D, ex vivo-behandling av celler med LBH589 (40 nM) forårsaket øket histon H4 acetylering i alle tumorprøver, mens LBH589 behandlingen økte PARP-spaltning i bare to av fem prøver, som tett korrelerer med Chk1 nedregulering. Disse resultatene støtter funnene presentert ovenfor med NSCLC cellelinjer og foreslå at redusert Chk1 og fosfor-cdc2 (Tyr15) nivåer kan være sensitive farmakodynamiske markører for HDACi effekt på pasienttumorprøver for å forutsi og vurdere pasientens respons på HDACi behandling i kliniske studier.
HDACi-mediert celledød krever mitotiske oppføring
dataene presentert ovenfor støtte en modell der svikt i Chk1-mediert sjekkpunkt aktivering spiller en avgjørende rolle i HDACi-mediert celledød. Således hypoteser vi at blokade av mitotisk inngang ville redusere følsomheten av kreftceller til de cytotoksiske effektene av HDACi behandling. For å teste denne hypotese, ble A549-celler forbehandlet med en potent inhibitor cdc2, purvalanol A [27], for å blokkere adgang til mitose. Flowcytometrisk analyse viser at 40 nM LBH589 i 24 timer forårsaket en betydelig økning av celler i G
2 /M og en omtrent 20 gangers økning av den sub-G
1 topp (hypodiploid celler) etter 24 timers behandling, i samsvar med øket celledød. Økningen i sub-G
en populasjon etter LBH589 behandling ble imidlertid betydelig redusert ved forbehandling av celler med purvalanol A (figur 5), noe som indikerer at mitotisk blokkering som forårsaker resistens mot de cytotoksiske effekter av LBH589. For å bekrefte denne observasjonen, utførte vi Western blot analyse med ekstrakter fremstilt fra A549 celler eksponert for LBH589 med eller uten purvalanol En forbehandling. Figur 5 illustrerer at purvalanol En forbehandling hemmet LBH589-indusert apoptotisk celledød, målt ved cPARP, noe som gir ytterligere støtte som HDACi-indusert celledød i stor grad krever adgang til mitose.
Celler behandlet med LBH589 40 nM med eller uten Pur A (10 uM) forbehandling ble analysert ved strømningscytometri for cellesyklusfordeling, eller ved Western blot for å bestemme medikament-medierte endringer i cPARP. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
HDAC og Chk1 hemmere viser en synergistisk effekt hos NSCLC celler
Våre resultater viste at HDACi behandlingsmål Chk1 å indusere upassende mitotisk oppføring og derved utøver sin cytotoksiske effekter på tumorceller. Den redusert følsomhet av celler til HDACi behandling observert i A549 celler ectopically uttrykker Chk1 (figur 4C) antyder at aktivering av Chk1 og dens nedstrøms signalveien, som styrer G
2 sjekkpunkt, kan føre til resistens mot HDACi terapi. Således er det sannsynlig at Chk1 hemmere kan potensere cytotoksiske virkninger av HDACis i tumorceller som er resistente mot HDACis. For å teste denne muligheten, ble A549-celler behandlet med LBH589 og en Chk1 inhibitor (UCN-01) i 24 timer. Figur 6A viser at, i lave konsentrasjoner, kan ingen LBH589 (4 nM) og heller ikke UCN-01 (250 nM) alene føre til PARP-spaltning i A549-celler, mens kombinasjonen av disse to stoffene drastisk øket PARP protein spalting, noe som tyder på en potensiell synergi. For å underbygge den synergistiske samspillet mellom HDAC og Chk1 hemmere, neste utførte vi median dose effekt analyse. For dette formål ble A549-celler eksponert for økende konsentrasjoner av LBH589, UCN-01, eller en kombinasjon av disse stoffene i et fast forhold. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved bruk av CT-Blue-analyse, og effekten ble analysert ved hjelp av median effekt analyse. Som vist i figurene 6B og 6C, eksponering av cellene til kombinasjonen av LBH589 og Chk1 inhibitorer som utøves en sterk synergistisk effekt. Ved hjelp av disse samme metoder, ble en synergistisk interaksjon også sett mellom LBH589 og en ny Chk1 inhibitoren AZD7762 [28] i NSCLC-celler som resulterte i en CI-verdi på 0,76 indikerer en moderat synergistisk effekt (data ikke vist).
A
, A549-celler ble behandlet med LBH589 40 nM og /eller en UCN-01 (250 nM) i 24 timer ble celleekstrakter fremstilt, og Western blot-analyse ble utført med PARP (t: totalt c: spaltet). Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger, og et representativt eksperiment er vist.
B
, A549-celler ble behandlet med LBH589 og UCN-01, enten alene eller i kombinasjon ved et konstant forhold (01:40) i 72 timer. Medikamentkonsentrasjoner er avmerket på den horisontale aksen og plottet mot cellelevedyktigheten til kontrollbrønner, ble vilkårlig satt til 100% levedyktighet for hvert eksperiment. Feilfelt representerer ± SD av 4 replikere brønner.
C
, kombinerte effekten av LBH589 og Chk1 inhibitor UCN-01 ble kvantifisert med Chou og Talalay kombinasjon indeks (CI) metode (40). CI anvendes for medikamentkombinasjon analyser ble bestemt ved isobologram ligning (se tekst). Rangering symboler (+/-) viser en gjennomsnittlig beregnet Chou og Talalay kombinasjon indeks (CI) område (+++, sterk synergi).
Dataene presentert ovenfor tyder på at narkotika hemme aktiviteten av proteiner som negativt regulere funksjonen til cdc2-cyclin B-kompleks kan forsterke G
2 sjekkpunkt opphevelse og cytotoksiske effekter av HDACis i tumorceller.
Diskusjoner
Tidligere studier har vist at HDACi-indusert celledød er forbundet med avvikende mitose og oppbrytning av cellesykluskontrollpunktene [29] – [34]. Imidlertid er de molekylære mekanismer som HDACi behandling fører til mitotiske celledød ikke godt forstått. Her, demonstrerte vi at HDACi behandling av humane NSCLC-celler fører til nedregulering av total Chk1 proteinnivåer. Vi viste at denne nedregulering er biologisk relevant ved å demonstrere en samtidig reduksjon i nivåene av den inhiberende fosforylering av nøkkel cellesyklusregulerende proteiner cdc25c og cdc2. Den reduserte nivåer av total Chk1 protein innledes induksjon av apoptose og histone acetylering, viser at Chk1 downregulation er en tidlig hendelse i HDACi virkningsmekanisme og at det spiller en sentral rolle i narkotika-mediert celledød.
Chk1 uttrykk har vist seg å fluktuere i løpet av cellesyklusen [35]. Men siden Chk1 er hovedsakelig uttrykt på S til M-fasen av cellesyklusen ved både RNA- og proteinnivåene [35], er det usannsynlig at HDACi-mediert inhibering av Chk1 er en konsekvens av vekstarrest i G
2 /M fase. RT-PCT-eksperimenter viste at transkripsjonen inhibering av Chk1 spiller en viktig rolle i HDACi-medierte regulering av Chk1 protein. Den mekanisme ved hvilken HDACis regulerer transkripsjonen ekspresjon av Chk1 er ukjent og er ikke klarlagt.
Behandling av tumorceller med panne HDACis er blitt rapportert å forårsake acetylering av HSP90 gjennom hemming av HDAC6 og uttømming av flere HSP90 klient proteiner, inkludert AKT og c-RAF [22], [36], [37]. Våre resultater viste at under de forholdene der LBH589 indusert Chk1 downregulation ble ingen hemming observert i uttrykket nivåer av AKT og c-RAF. Videre er selektive HDAC-inhibitorer valproinsyre, apicidin og MS-275 uten kjente hemmende effekt på HDAC6 var i stand til å hemme ekspresjon Chk1. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at hemming av Chk1 uttrykk i HDACi-behandlede celler er sannsynlig ikke formidles av inaktivering av HSP90 protein, men er snarere grunn av undertrykkelse av CHK1 uttrykk.
En av de store utfordringene i utviklingen av HDACis er definisjonen av klinisk relevante endepunkter å vurdere legemidlets effekt i pasientsvulster på et tidlig stadium av behandlingen for å forutsi klinisk utfall. I denne studien, viste vi at nedregulering av totale Chk1 protein nivåer korrelerer mye sterkere med induksjon av cytotoksisk effekt snarere enn med histon hyperacetylation i begge cellelinjer og i grunnskolen NSCLC celler hentet fra pasient svulster ex vivo. Sammen utgjør disse funnene tyder på at nedregulering av Chk1 og Tyr15 fosforylering av cdc2 nivåer kan være sensitive og klinisk relevante farmakodynamiske markører for effekten av HDACis.
Til tross for sin lovende som en ny kreftbehandling, i kliniske studier, effektiviteten av HDACis har vært begrenset, og ingen klar resistensmekanismen er klarlagt [1]. Våre nåværende resultater gir en mulig innsikt i mekanismen for HDACi handling og motstand. Vi viste at ektopisk ekspresjon av Chk1 og forebygging av mitotiske oppføring av en cdc2 inhibitor purvalanol En redusert LBH589-indusert celledød. Disse funnene tyder på at nivået av ekspresjon Chk1 eller aktiveringsstatusen av enzymer som regulerer M-fase inngang, slik som cdc25 og cdc2-cyclin B-komplekset, kan spille en viktig rolle i å bestemme sensitiviteten eller motstanden av tumorceller til HDACis. Dataene som presenteres her foreslå en modell der mitotisk oppføring er et nødvendig steg for HDACi-mediert celledød. I tillegg vil cellulære mekanismer som blokkerer Chk1 downregulation og /eller bypass Chk1 og direkte opptrer på G
2 sjekkpunkt kontroll for å hindre at celler fra å komme inn mitotiske fasen føre til motstand mot HDACis. For eksempel har Chk1 blitt vist å være sterkt uttrykt i NSCLC-tumorer [38], som kan resistens overfor HDACi-indusert mitotisk oppføring og celledød. Derfor, i svulster med økt Chk1 aktivitet, rasjonelle kombinasjoner av HDACis med legemidler som samtidig hemmer Chk1 og nedstrøms signalveier som styrer G
2 /M cellesyklus sjekkpunkt kan forsterke den cytotoksiske effekten av HDACis.
HDACis er blitt vist å virke synergistisk sammen med DNA-skadende midler [1]. Imidlertid, de molekylære mekanismene for denne synergi er ikke godt blitt forstått.
