Abstract
Sporadisk tidlig debut kolorektal kreft (EOCRC) som har per definisjon ingen identifisert arvelig predisposisjon er et økende problem som fortsatt dårlig forstått. Molekylær analyse kan forbedre identifisering av forskjellige sub-typer av kolorektal kreft (CRC) med terapeutiske implikasjoner og dermed kan bidra til å etablere det sporadisk EOCRC er en selvstendig enhet. Fra 954 pasienter resected for CRC ved vår institusjon, ble 98 pasienter valgt. Pasienter i alderen 45-60 år ble ekskludert for å definere «unge» og «gamle» grupper. Tretti-ni tilfeller av sporadisk EOCRC (patients≤45 år med mikro stabile tumorer) ble sammenlignet med både mikro stabile svulster fra eldre pasienter (36 tilfeller, pasienter 60 år) og til grupper av pasienter med mikro ustabilitet. Hver gruppe ble testet for
TP53
,
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
mutasjoner og tilstedeværelsen av en methylator fenotype. Genekspresjonsprofiler ble også anvendt for sti-analyse. Sammenlignet med mikro stabil CRC fra gamle pasienter, ble sporadisk EOCRC preget av distal plassering, hyppige synkrone metastaser og sjeldne synkron adenomer, men ikke har spesifikke morfologiske egenskaper. En familiær CRC var mer vanlig i sporadiske EOCRC pasienter til tross for mangel på identifiserte arvelige forhold (p = 0,013). Genetiske studier viste også fravær av
BRAF
mutasjoner (p = 0,022) og methylator fenotype (p = 0,005) i sporadisk EOCRC forhold til eldre pasienter. Genekspresjonsanalyser innblandet viktige veier som Wnt /beta catenin, MAP kinase, vekstfaktor signalering (EGFR, HGF, PDGF) og TNFR1 sti i sporadisk EOCRC. Wnt /beta catenin signaliserer aktiveringen ble bekreftet av avvikende atom beta catenin farging (p = 0,01). Denne studien antyder sterkt at sporadisk EOCRC er et tydelig klinisk-molekylær enhet presentere som en distal og aggressiv sykdom forbundet med kromosom ustabilitet. Videre har flere signalveier inkludert TNFR1 vei blitt identifisert som potensielle biomarkører for både diagnostisering og behandling av denne sykdommen
Citation. Kirzin S, Marisa L, Guimbaud R, De Reynies A, Legrain M, Laurent -Puig P, et al. (2014) Sporadiske Tidlig Onset tykktarmskreft er en spesifikk undertype av kreft: en morfologisk, Molecular og genetikk Study. PLoS ONE 9 (8): e103159. doi: 10,1371 /journal.pone.0103159
Redaktør: Peh Yean Cheah, Singapore General Hospital, Singapore
mottatt: 18 mars 2014; Godkjent: 26 juni 2014; Publisert: 01.08.2014
Copyright: © 2014 Kirzin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Data er tilgjengelig på NCBI, GEO depot sjonsnummer:. GSE39084
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Ligue Regionale Contre le Cancer, Comité du Gers og programmet Carte d’Identité des Tumeurs fra Ligue Nationale Contre le Cancer. Forfatterne takker Institut National Contre le Cancer for sin støtte til klinisk og laboratoriegenetiker. Forfatterne takker Cancéropôle Grand Sud-Ouest for å gi kliniske merknader. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er mest sett hos eldre voksne med en median alder ved diagnose på 70 år [1]. Men ifølge amerikanske registre forekomst av CRC i unge voksne er økende hele tiden, med en hastighet på 1,5% per år mellom 1992 og 2005 hos voksne i alderen 20-49 [2]. Tidlig debut CRC (EOCRC) er en aggressiv sykdom med dårlig differensiering og har en klassisk beliggenhet i venstre kolon. Enkeltpersoner kan være disponert for EOCRC gjennom arvelighet og inflammatoriske tarmsykdommer. De mest veldefinerte arvelige former av CRC er Lynch syndrom og familiær adenomatøs polypose (FAP) som står for 2-4% og mindre enn 1% av total CRC tilfeller, henholdsvis [3]. Den relative bidraget av inflammatoriske tarmsykdommer og FAP til EOCRC er beskjeden siden begge forhold kan lett bli identifisert ved deres kliniske funksjoner og administreres av screening og forebyggende behandling i henhold til etablerte retningslinjer. I motsetning til dette, ikke Lynch syndrom ikke vise en spesifikk fenotype og fører ofte til karsinom, som utgjør en tredjedel av EOCRC tilfellene [4]. De fleste tilfeller av EOCRC er sporadiske tilfeller som mangler genetiske markører som indikerer predisponering
CRC er en heterogen sykdom som er klassisk delt inn i tre undertyper [5], i henhold til de molekylære mekanismene som driver dens transformasjon:. ( i) ustabilitet Kromosomalt (CIN), den dominerende mekanisme, som er kjennetegnet ved mikro stabile svulster (MSS), tap av heterozygositet og store kromosomale endringer i tumor-suppressor-gener og onkogener [9]; (Ii) En epigenetisk endring kjent som CpG øya methylator fenotypen (CIMP) som fører transkripsjonen stanse ved metylering av CpG-rike regioner i promotoren av tumor-suppressor-gener. CIMP er ansvarlig for det store flertallet av sporadiske MSI svulster gjennom stanse av arrangøren av MMR-genet
hMLH1 product: [7], [8]; (Iii) mikro ustabilitet (MSI), som er kjennetegnet av Lynch syndrom og er preget av opphopning av rammeskift mutasjoner i mikrosekvenser på grunn av mangel på mismatch reparasjon (MMR) gener [6]. Imidlertid er denne tiden brukes molekylær klassifisering av CRC basert på bare noen få felles DNA-markører.
Foreløpig de molekylære markører for sporadisk EOCRC ikke blitt grundig undersøkt og deres individuelle bidrag til kreftutvikling er ikke karakterisert. Genome uttrykk profil (GEP) analyse kan forbedre molekylær klassifisering av CRC og bidra til å identifisere kliniske enheter og biomarkører som kan forutsi respons på behandling. Vi har nylig brukt denne typen tilnærming til å identifisere seks molekylære subtyper av CRC som oppstår gjennom forskjellige biologiske pathways [10].
Hensikten med denne studien var å undersøke sporadisk EOCRC ved hjelp av en integrert tilnærming som kombinerer uttømmende clinico -pathological data med genetiske analyser for å fastslå den spesifikke kliniske funksjoner og molekylære profiler av denne enheten. For denne studien vi først identifisert en homogen gruppe sporadisk EOCRC som ble definert ved å ha en kreftdiagnose på under 45 år, har ingen identifisert arvelig predisposisjon for CRC og har en MSS profil. Vi neste forhold spesifikke genetiske, epigenetiske og genuttrykk data fra denne gruppen med det fra andre godt definerte grupper av CRC.
Materialer og metoder
Denne studien var designet for å undersøke sporadiske EOCRC tilfeller ( MSS svulster fra unge pasienter) og sammenligne dem til motpart MSS svulster fra eldre pasienter. Vi inkluderte også CRC med MSI (både fra unge og gamle pasienter) siden de utgjør en godt karakterisert modell av CRC onkogenese.
Pasient og prøve utvalg
Mellom april 1999 og desember 2005 954 pasienter ble behandlet og fulgt opp for CRC ved vår institusjon. Pasienter under 45 år (fra heretter referert til som «unge» pasienter) og over 60 ( «gamle») ble vurdert for sammenligning. Eksklusjonskriterier var: utilgjengelig frosset vev; diagnostisering av FAP eller IBD; preoperativ kjemoterapi /strålebehandling; Prøvene inneholdende mindre enn 50% tumorceller; og ukjent MMR status. På grunn av en høy andel av scenen IV MSS svulster fra unge pasienter, ble MSS svulster fra unge og gamle pasienter matches etter tumorstadium. Etter utvalgs, 98 pasienter var tilgjengelige for studien, som vist i figur 1. Fire grupper av pasienter ble definert: MSS-Y (MSS-tumor 45 år), 39 tilfeller; MSI-Y (MSI svulst 45 år), 9 tilfeller; MSS-O (MSS svulst 60 år), 36 tilfeller; og MSI-O-gruppe (MSI tumor 60 år)., 14 tilfeller
Consort diagram som viser utvalget av pasienter i en enkelt institusjon, på grunnlag av tilgjengelige frosne vev og etter påføring eksklusjonskriterier. Fire grupper ble definert ved å ta hensyn alder og MMR status. Studien er designet for å tillate sammenligning av MSS tidlig debut CRC med andre godt definerte grupper av CRC. FAP: Familiær adenomatøs polypose. IBD: inflammatorisk tarmsykdom. MMR status: Mismatch Repair status. MSS: mikro stabil. MSI. Mikro ustabil
etiske komité Godkjenning
Alle pasientene ble prospektivt registrert i en sentral sikret database erklært til kommisjonen Nationale Informatique et Liberté (1.365.952). Bruken av de innsamlede svulster ble godkjent av Toulouse Hospital kortet (CRB-Cancer Toulouse, DC-2008-463, AC-2008-820, CPP2). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag.
Studerte parametere
Sytti-ni variabler av interesse ble hentet fra databasen og analysert. Disse inkluderte kliniske data (familiær stamtavle, kreft språk, klinisk presentasjon ved diagnose, behandlingsmetoder, overlevelse) og tumor egenskaper (komplett patologiske data, tilstedeværelse av synkron adenom i resected prøven, MMR status, tilstedeværelse av genetiske og epigenetiske forandringer). Klinisk oppfølging av pasientene ble utført i henhold til publiserte nasjonale retningslinjer [11]. Overlevelseskurver ble etablert fra datoen for diagnose i henhold til Kaplan-Meier beregninger. Detaljer om variabler undersøkt er gitt i tabell S1.
MMR status og familiær stamtavle
MMR status ble bestemt ved diagnose (forrige studien) ved å vurdere mikro ustabilitet status ved hjelp av en Pentaplex PCR og etter ved hjelp av immunhistokjemi (IHC) for å teste for uttrykket av MLH1, MSH2 og MSH6, som tidligere beskrevet [12]. Mismatch reparasjon mangler (dMMR svulster) ble definert av MSI og /eller tap av uttrykk for en av MMR proteiner, mens dyktige MMR (pMMR) svulster samsvarer MSI-lav eller MSS svulster som uttrykker de MMR proteiner.
stamtavle av alle unge pasienter ble vurdert av en enkeltstående klinisk genetiker (RG). Genetisk testing for de 2 store MMR gener
hMLH1 Hotell og
hMSH2
ble utført i tilfelle av MSI svulster eller når personlig eller familie kreft historie var til stede hos unge pasienter. Diagnosen Lynch syndrom ble formelt bekreftet av identifisering av en skadelig germline mutasjon i en MMR-genet. Tilfeller av MSI svulster viser et fravær av MSH2 eller MSH6 farging med IHC ble ansett som sannsynlig Lynch syndrom.
mutasjonsanalyse
Genotyping av viktige mutasjoner oppstår i tykk- og endetarmskreft (
KRAS
,
BRAF
,
TP53 Hotell og
PI3KCA
) ble utført etter DNA-ekstraksjon fra fryst vev. De syv mest vanlige mutasjoner i kodon 12 og 13 i
em KRAS
, og kodonet V600E mutasjon i
BRAF
ble vurdert ved allelisk hybridisering ved anvendelse av TaqMan prober, slik som tidligere beskrevet [13]. Direkte sekvensering av
TP53
eksoner 5 til 9 og
PI3KCA
eksoner 9 og 20 ble utført parallelt med Sanger teknikk (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA).
Methylator fenotype vurdering
CIMP profiler ble bestemt ved hjelp av et panel bestående av fem markører som beskrevet av Weisenberger
et al
:
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
. Etter DNA bisulfite behandling, ble to multipleks metylering spesifikke PCR utføres. Fragment-analyse ble utført ved kapillær elektroforese på en automatisk sekvensdanner (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA). Methylator fenotype-positive tilfeller (CIMP +) hadde 3 eller flere denaturert arrangører mens CIMP-negative hadde mindre enn 2 denaturert arrangører, definert i henhold til fastsatte kriterier [14].
RNA ekstraksjon og microarray analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California) og sjekket for renhet, integritet og kvantitet. Prøvene ble så forsterket, merket og hybridisert på Affymetrix Human Genome U133 plus2 Genechip, etter produsentens en syklus target merking protokollen (Affymetrix, Santa Clara, CA). Sjetongene ble skannet med Affymetrix Genechip Scanner 3000 og rå intensitet ble hentet fra etterfølgende bilder ved hjelp GCOS 1.4 programvare (Affymetrix). Data ble normalisert ved hjelp av Robust Multiarray av gjennomsnitt (RMA) -metoden, implementert i R pakken AFFY [15]. Dataene er tilgjengelig på NCBI Gene Expression Omnibus repository (sjonsnummer: GSE39084).
Unsupervised analyse
Klasse funnet ble utført ved konsensus clustering av uttrykk profiler, som tidligere beskrevet [16]. Probe-sett ble først filtrert for å holde dem som er uttrykt (det vil si med en normalisert styrkeverdi over 15) i minst 10% av prøvene med en varians er vesentlig høyere enn den midlere varians av alle sondesett (p 0,01). Deretter ble 7 lister erholdt som omfattet 1% til 50% av de variantsondesett (basert på den robuste variasjonskoeffisient). For hver sonde satt listen, ble prøvene samlet ved hjelp av en-Pearson korrelasjon for avstanden metrisk og Ward båndet, noe som gir 7 dendrogrammer. Skillevegger i k klynger (k 2-8) ble avledet fra hver dendrogram og en konsensus partisjon ble beregnet for hver verdi av k, som gir 7 konsensus partisjoner.
Veiledet analyse
Foreninger mellom klinisk og molekylære merknader og utvalgsgrupper ble testet for statistisk signifikans ved hjelp av Chi-squared test eller Fisher eksakt test der dette er hensiktsmessig. Gener forskjellig uttrykt mellom svulster fra unge og gamle MSS pasienter ble valgt basert på Limma moderert t-test p-verdier justert for multippel testing av Benjamini Hochberg metode ( 0,05) [17]. Pathways fra Biocarta databasen ble testet for anriking av deregulerte gener ved å kombinere følgende metoder: Globaltest (R pakke globaltest), SAM-GS, og Tuckey [18], [19]. P-verdiene for hver metode ble omgjort til rekkene og gjennomsnittlig rang ble beregnet å bestille veier.
Beta catenin signalveien aktivering
Immunohistokjemi ble utført på formol fiksert og parafininnstøpte blokker fra 98 pasienter i studien med musen monoklonalt antistoff beta catenin (Clone 14, BD Biosciences, fortynning 1/200, Ventana XT Autostainer (Tucson, Arizona, USA). Alle lysbilder ble gjennomgått av to patologer blindet til grupper av pasienter ( JS og SK). Aktivering av P-catenin signalveien ble definert ved sterk nukleær farging i over 50% av tumorceller, med eller uten diffus cytoplasmatisk farge og med et tap av cellemembranfarging [20].
resultater
klinisk-patologisk karakteristikk av sporadiske EOCRC
Den sporadiske EOCRC gruppen besto av 39 pasienter, fordelt som følger: 17 var 40-45 år gammel, 13 var 35-40 år, fem var 30-35 år, 2 var 25-30 år og to var under 25 år. en slik fordeling i alder er i tråd med data publisert i det amerikanske registeret [1]. I sammenligning med svulster fra MSS gamle pasienter, sporadiske EOCRC (MSS unge pasienter) vises særpreg. Endetarms svulster var mer tallrike i sporadisk EOCRC (41% versus 8,3%, p = 7,4
e-04) med mindre hyppige adenomer sett på resected prøver (8% mot 33%, p = 0,013). Spesielt, 15 (38%) sporadiske EOCRC pasientene hadde en familiehistorie (første- eller annengrads slektning) av CRC mot 3 (9%) i gruppen av MSS gamle pasienter (p = 0,013). En stamtavle analyse av disse 15 pasientene viste at tre av dem hadde et klart autosomal dominant overføring arv mønster med flere familiemedlemmer berørt. To av de tre var fra samme familie, men ingen kimlinje-mutasjoner har blitt identifisert hittil. De resterende 12 pasienter hadde en ubestemt modus for overføring med bare ett medlem av ascendant familie å ha CRC, vanligvis i høy alder ( 60 år). I samsvar med franske anbefalinger,
MUTYH
mutasjonsanalyse ble utført for bare en pasient som presenteres med 8 adenom, men denne analysen var negativ [21]. En personlig historie med CRC ble kun observert i gamle pasienter (inkludert både MSS og MSI tumorer). Alle svulster fra MSI unge pasienter oppsto i sammenheng med Lynch syndrom, og 3 pasienter (21,5%) fra MSI gamle gruppen var også Lynch pasienter. Når du vurderer hele studiepopulasjonen, ble de andre signifikante forskjeller ble observert mellom grupper knyttet til MMR-mangel, nemlig hyppigere proksimale plassering (p = 2,0
e-05), dårlig celledifferensiering (p = 0,033) og hyppige mucinous komponent ( p = 0,012). De viktigste kjennetegn ved studerte befolkningen er rapportert i tabell 1.
Sporadisk EOCRC er en aggressiv sykdom ofte presenterer med metastaser ved diagnose. Plasseringen av metastatiske tumorer var hovedsakelig i lever og lunger, som observert for CRC. En spesifikk overlevelse profil ble observert for hver gruppe av pasienter, med total overlevelse bedre for MSI enn MSS pasienter. Til tross for en høy belastning av metastaser (med 23,1% mot 5,6% å ha flere metastaser på diagnose), sporadiske EOCRC pasientene hadde en bedre 5-års overlevelse enn MSS gamle pasienter, selv om dette ikke var signifikant (69% mot 42%, p = 0,09). De fem års total overlevelsesrate var omtrent den samme for MSI pasienter, selv om MSI unge pasienter opplevde hyppigere tidlig tilbakefall (figur 2).
Hver gruppe hadde en bestemt total overlevelse profil selv om ingen var signifikant forskjellig fra hverandre (p = 0,15). MSS: mikro stabil. MSI: mikro ustabil
Genetiske og epigenetiske kjennetegn ved sporadiske EOCRC
mutasjons profiler av
KRAS
,
BRAF Hotell og
TP53.
og CIMP status ble etablert for alle pasienter (tabell 2).
PI3KCA
genotyping ble utført for 74 svulster. Den mutasjons profilen til sporadiske EOCRC svulster var lik som MSS svulster fra gamle pasienter for
KRAS
,
TP53 Hotell og
PIK3CA
gener, men var helt klart annerledes for
BRAF
mutasjoner og CIMP profiler. Sporadiske EOCRC tumorer hverken inneholdt
BRAF mutasjoner
(p = 0,022) og heller ikke vises et CIMP + profil (p = 0,005) sammenlignet med tumorer fra MSS gamle pasienter. MSI svulster i gamle pasientene hadde en høy grad av
BRAF
mutasjon (36%) og ofte vises en CIMP + profil (62%). MSI unge pasienter skilte seg fra MSI gamle pasienter ved fravær av en methylator fenotype (p = 0,006) og
BRAF
mutasjoner.
transkriptomet analyse
Microarray data var innhentet for 70 pasienter. Uten tilsyn analyser avslørte at, uavhengig av det antall klynger og prosentandelen av variante gener anvendt, var de underliggende skillevegger gående og sterkt forbundet med MMR status og grupper. Andre variabler signifikant assosiert med unsupervised partisjonene var svulst beliggenhet, CIMP status og mutert BRAF. Disse variablene ble seg nært knyttet til MMR status. Alder ble svakt forbundet med noen uten tilsyn skillevegger (oppnådd ved anvendelse av 5% og 20% av de forskjelligste genene). Konsensus partisjon i de 5 klynger ble tettest forbundet med de fire gruppene som er definert på MMR status og alder (figur 3). Cluster 1 (C1) ble nesten utelukkende består av mangelfulle MMR svulster. Cluster C2 ble beriket med dyktig MMR og BRAF-mutert svulster. Klynger C3 og C4 inneholdt mer CIMP +, C4 blir nesten utelukkende består av dyktige MMR svulster fra gamle pasienter. Cluster 5 (C5) ble anriket i sporadiske EOCRC svulster funnet i venstre colon
styrt klassifikasjon av uttrykk profiler. Dendrogram av de nærmeste clustering til konsensus partisjon for k = 5. Legend: io, MSI /Old ; iy, MSI /Young; så, MSS /Old; sy, MSS /Young; d, mangel MMR; p, dyktig MMR; R, høyre colon; L, venstre colon; Re, endetarm; M, mutert; . W, vill-type
neste gjennomført en veiledet analyse av MSS tumorer (n = 54) som leverte en liste over 297 probe sett utgjør 219 svært diskriminerende gener (p 0,001). Dette settet gitt et klart skille mellom sporadiske EOCRC svulster og svulster fra gamle MSS pasienter (figur 4). En omfattende beskrivelse av disse genene er gitt i Tabell S2. Den eneste nøkkelen CRC onkogenese genet som var høyt deregulert i sporadisk EOCRC var beta catenin (
CTNNB1
). Det høye antallet diskriminerende gener mulig for oss å gjennomføre pathway analyser for å bedre forstå sporadisk EOCRC kreftutvikling. Førti-ni trasé ble betydelig anriket for differensial genuttrykk i sporadisk EOCRC forhold til MSS svulster fra gamle pasienter. En fullstendig beskrivelse av dem er gitt i tabell S3. Blant disse 20 var involvert i cellesignalisering, 10 i inflammasjon og apoptose, 7 i adhesjon og /eller motilitet, 7 i utviklingsbiologi og 3 i celleproliferering (figur 5). Flere veier som var oppregulert i sporadisk EOCRC var relatert til store signalveier involvert i CRC som MAP kinase og PI3KCA /AKT eller er knyttet til vekstfaktorer (EGF, HGFR og PDGF) og angiogenese (VEGF). To store veier som er involvert i heft og /eller motilitet regulering (integrin signalveier og celle-til-celle adhesjon signale) var oppregulert i sporadisk EOCRC. Interessant nok har de fleste av trasé relatert til betennelse og /eller apoptose som ble funnet opp regulert i sporadisk EOCRC er direkte eller indirekte knyttet til den TNF-R1 pathway (TNFR1 vei, HIV-1Nef, FAS-signalreaksjonsveien, TNF /stress-relaterte signale) .
varmen kartet viser uttrykket av 219 gener. Basert på uttrykk nivåer, ble genene gruppert i fire klynger av svært overuttrykt gener (røde bokser omgitt av en svart ramme) og en klynge av underexpressed gener i MSS tumorer (blå boksene omgitt av en svart ramme) fra unge pasienter sammenlignet med MSS svulster fra eldre pasienter. MSS: mikro Stabil. MSI. Mikro Ustabilitet
Pathway analyse gruppere de 49 mest betydelig beriket trasé for differensial genuttrykk mellom sporadiske EOCRC og MSS svulster fra gamle pasienter. Pathways ble gruppert i fem hovedkategorier, nemlig celle adhesjon /motilitet, betennelse /apoptose, celleproliferasjon, cellesignalisering og utviklingsbiologi. Fordelingen av de viktigste kanoniske trasé mellom kategorier er detaljert, så vel som deres rang rekkefølge. Denne rangeringen ordren er angitt med symbolet # etterfulgt av radnummer (# 1 betyr at denne veien er den mest deregulerte blant de 49 banene).
Beta catenin immunhistokjemi
microarray data over identifisert beta catenin å være den eneste nøkkelen CRC onkogenese genet deregulert i sporadisk EOCRC. Vi søkte derfor å vurdere beta catenin aktivering ved hjelp av immunhistokjemi. Alle tilfeller av MSS svulster fra unge pasienter (39 tilfeller) og 33 tilfeller (33/36) av MSS svulster fra gamle pasienter ble validert for beta catenin aktivering ved hjelp av immunhistokjemi. Beta catenin aktivering ble identifisert i 17 tilfeller (44%) fra MSS-unge pasienter og 5 tilfeller (15%) fra MSS gamle pasienter (p = 0,01) med en kjernefysisk +/- cytoplasma farging (figur 6).
A. Tverrsnitt av en svulst fra en MSS gammel pasient viser kun membranfarging. B. Tverrsnitt av en svulst fra en sporadisk EOCRC (MSS-Young) pasient viser sterk cytoplasma og nukleær farging med et tap av membranfarging, reflekterer Wnt /beta catenin aktivering.
Diskusjoner
resultatene fra denne studien tyder på at sporadisk EOCRC er et tydelig klinisk og molekylær enhet. For første gang kan vi tilby en integrert analyse av både omfattende kliniske data og genomikk fra en nøye vist sammenhengende rekke av pasienter som hadde vært behandlet og fulgt opp på en enkelt institusjon. Dette translasjonell tilnærmingen har tillatt oss å avgrense tidligere begrenset beskrivelse av denne spesifikke formen for CRC og kaster innsikt i sin spesifikke tumorbiologi.
I øyeblikket er det ingen akseptert klar definisjon av tidlig debutalder i felten av CRC. Derfor er de fleste studier som rapporterer om dette emnet omfatter pasienter i 40-50 års alderen [22], [23]. Det er imidlertid en progressiv økning i hyppigheten av CRC mellom 40 og 50 år, slik det er sannsynlig at det i disse studiene er det en blanding av spesifikk EOCRC enhet og sen debut CRC. For å løse dette problemet brukte vi en mer restriktiv definisjon av både tidlig og sen debut CRC: pasienter mellom 45 og 60 år ble ekskludert for å sikre en klar oppdeling av de to enhetene, og unngå overlapping av disse to formene for barnekonvensjonen. En annen forvirrende faktor i analysen av EOCRC i mange studier er mangelen på skillet mellom arvelige former for CRC, spesielt Lynch syndrom, og den sanne sporadiske formen for CRC. Men Lynch syndrom selv står for en tredjedel av EOCRC tilfeller [24]. Derfor, i denne studien en full stamtavle ble etablert av en klinisk genetiker for alle unge pasienter. Lynch syndrom tilfellene ble identifisert ved hjelp av robuste kriterier og ble klart adskilt fra sporadisk EOCRC. Til tross for dette, i denne studien sporadiske EOCRC pasientene hadde en høy grad av familiens historie (38%). Et mindretall av dem presentert med en autosomal dominant overføring arv (8%) som trolig tilsvarer en arvelig sykdom som genet mottakelighet ennå ikke er identifisert (X-syndrom). På den annen side er det i økende grad erkjent at noen mindre predisposisjon loci kan være ansvarlig for en kompleks form av CRC arvelighet [25]. Derfor kan en slik genetisk predisposisjon også være involvert i noen pasienter med EOCRC. Denne hypotesen støttes av den lave frekvensen av synkron adenom vi observert i sporadiske EOCRC pasienter som kunne reflektere akselerert kreft sekundært til predisponerende faktorer.
Det har lenge vært erkjent at de morfologiske særtrekkene EOCRC er dårlig celledifferensiering, kolloid komponent og lymfatisk stroma reaksjon [22], [26] – [29]. Igjen er disse dataene trolig forvirret av inkluderingen av Lynch syndrom pasienter, noe som vanligvis er forbundet med disse histologiske funksjoner. I de eneste to studier som har spesielt analysert MSS-unge pasienter (en med 24 og en med 55 tilfeller), var det ingen sammenheng mellom mucinous histologi, dårlig differensiering, tumor-infiltrerende lymfocytter og tidlig-inntreden av sykdom [30], [ ,,,0],31]. Vår studie har bekreftet disse opplysningene og vi viser videre at dårlig celledifferensiering og en mucinous komponent er klart forbundet med MSI status uavhengig av alder av pasienten. I kontrast, gjorde vi ikke observere en sammenheng mellom lymfatisk invasjon, perinevral invasjon eller signetring cellehistologi med sporadisk EOCRC, som ble rapportert i de to tidligere studier som er nevnt ovenfor (data ikke vist) [30], [31].
fra et klinisk synspunkt, våre resultater er enig med den kliniske beskrivelsen av sporadisk EOCRC nylig publisert av Chang et al .: Sporadiske EOCRCs stede som svulster med distal plassering og hyppig metastatisk sykdom [30]. I denne studien, er påfallende høy grad av synkrone metastatisk sykdom i EOCRC gruppen (41%) førte oss til å matche MSS gamle pasienter for svulst scenen slik at det ikke skjevhet genuttrykk sammenligninger. Selv om det ikke er statistisk signifikant, unge pasienter hadde en tendens til å ha bedre overlevelse etter stadium av sykdommen sammenlignet med eldre pasienter. Selvfølgelig, yngre pasienter vil trolig gjennomgå mer aggressiv behandling, inkludert kjemoterapi eller gjentatt kirurgisk reseksjon for metastatisk sykdom som kan forbedre dårligere prognose gitt for EOCRC. Selv dels motstridende med eldre studier, hvorav noen var globale analyser basert på registre, dette arbeidet gir pålitelige resultater for de samme nevnte grunner [32] – [35]. Samlet sett viser sporadisk EOCRC som en aggressiv sykdom med distal beliggenhet, høy tumorstadium og ingen klar histologisk spesifisitet.
Denne studien er den første til å gi en oversikt over hyppigheten av et standard panel av genmutasjoner i tillegg som epigenetiske forandringer spesielt for sporadisk EOCRC. Etablerte kolorektal karsinogenisitetsstudier klassifikasjoner, ved hjelp av en kombinasjon av KRAS og BRAF-mutasjoner med CIMP og MSI status, tillate identifisering av tre til fem forskjellige molekylære undergrupper av CRC [36], [37]. For eksempel er KRAS og P53 mutasjoner klassisk forbundet med CIN-kolorektal kreft, mens BRAF-mutasjoner er sterkt forbundet med sporadiske former for CIMP + /MSI + CRC. Noen få studier har undersøkt mutasjon priser i sporadiske EOCRC tilfeller, og vist at 0-8% har
BRAF
mutasjoner, 0 til 4%
PIK3CA
mutasjoner, 6 til 78%
KRAS
mutasjoner, og 64%
TP53
mutasjoner [30], [31], [37] – [40]. Vi identifiserte en sats for
KRAS Hotell og
TP53
mutasjoner (henholdsvis 37% og 44%) som ligner på CIN svulster, men med et fravær av
BRAF
mutasjoner og ingen bevis for en methylator fenotype [41]. Avvikene med data fra litteraturen om mutasjon priser i EOCRC kan være knyttet til fravær av et klart skille mellom MSS og MSI svulster i eldre studier som kan ha påvirket mutasjon priser, spesielt for
KRAS Hotell og
BRAF product: [39], [40]. Samlet vår genetiske studie favoriserer hypotesen om at sporadisk EOCRC er en undergruppe av CIN svulster med verken
BRAF
mutasjon eller methylator fenotype.
oppnås ved unsupervised analyser clustering viste at forskjellene i genet uttrykk profiler (GEP) ble i hovedsak bestemt av MMR status og i mindre grad ved CIMP status, mens alder hadde liten innvirkning. Disse resultatene har tidligere blitt demonstrert av studier som viser at MSI og MSS tumorer med differensial ekspresjonsprofiler, som validerer de foreliggende resultatene [42]. Men selv om GEPs var svært viktig i tilsyn analysene begrenset til MSS svulster, som viser et sett av 219 gener differensierende unge fra gamle pasienter, må resultatet av uttrykket arrays vurderes med forsiktighet siden genet inneholder ofte mislykkes i å reproduseres. Derimot har pathway analyser viste seg å være reproduserbar, og bringe biologisk mening til genekspresjon arrays [43]. Mange veier klassisk involvert i CRC onkogenese var oppregulert i sporadisk EOCRC, for eksempel MAP-kinase, mTOR og VEGF /angiogenese, men veier knyttet til vekstfaktor signalering er også involvert (EGF, HGF reseptor og PDGF). Vi identifiserte også
CTNNB1
som en av de mest over-uttrykte gener i MSS-unge pasienter sammenlignet med MSS gamle pasienter og brukes immunhistokjemi for å vise at dette fører til en over-aktivering av beta catenin i sporadisk EOCRC.
