Abstract
Bakgrunn
Menneskelige kreft konsumere større mengder glukose i forhold til normalt vev med mest blir omdannet og utskilt som laktat tross rikelig oksygen tilgjengelighet (Warburg effekt). Den underliggende høyere rate av glykolyse er derfor ved roten av tumordannelse og vekst. Normal kontroll av glycolytic allosteriske enzymer virker svekket i tumorer; Men fenomenet er ikke helt avklart.
metodikk /hovedfunnene
I denne artikkelen viser vi bevis for at mors 85-kDa 6-phosphofructo-en-kinase (PFK1) , et regulatorisk nøkkel enzym fra glykolyse som er normalt under kontroll av feedback-inhibering, gjennomgår posttranslasjonell modifisering. Etter proteolytisk spaltning av den C-terminale del av enzymet, en aktiv, kortere 47-kDa-fragmentet ble dannet som var ufølsom for citrat og ATP-inhibering. I tumorigene cellelinjer, vil bare de korte fragmenter, men ikke det native 85-kDa PFK1 ble påvist ved immunblotting. Liknende fragmenter ble detektert også i et tumorvev som er utviklet i mus etter subkutan infeksjon med tumorigene B16-F10 celler. Basert på begrenset proteolytisk oppslutning av kanin muskel PFK-M, en aktiv citrat inhibering bestandig kortere form ble erholdt, hvilket indikerer at en enkelt posttranslasjonell modifiseringstrinn var mulig. De eksakte molekylmasser av de aktive kortere PFK1 fragmenter ble bestemt ved å sette inn de avkortede gener konstruert fra menneskelig muskel PFK1 cDNA inn i en
PFK
null
E. coli
belastning. To
E. coli
transkoding for de modifiserte PFK1s av 45 551 Da og 47835 Da vokste i glukose medium. Innsetting av modifisert avkortet menneskelig
PFK
M gener også stimulert glukoseforbruk og laktat utskillelse i stabile transfektanter av ikke-tumorigent human HEK celle, noe som tyder på den viktige rollen kortere PFK1 fragmenter i styrke glycolytic forandring.
Konklusjoner /Betydning
posttranslational forbehold PFK1 enzym kan være den avgjørende faktoren for deregulert glycolytic flux i svulster som i kombinasjon med endrede signalmekanismer i hovedsak støtter rask spredning av kreftceller
Citation.: Šmerc A, Sodja E, Legiša M (2011) posttranslational Modifisering av 6-phosphofructo-en-kinase som en viktig funksjon i Cancer Metabolism. PLoS ONE 6 (5): e19645. doi: 10,1371 /journal.pone.0019645
Redaktør: Anil Kumar Tyagi, Universitetet i Delhi, India
mottatt: 10 desember 2010; Godkjent: 12 april 2011; Publisert: 04.05.2011
Copyright: © 2011 Šmerc et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av den slovenske Forskning Agency (kontrakt nummer J4-9606 og 1000-07-310027, https://www.arrs.gov.si/sl/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en konsekvent karakteristisk for ondartede celler er forbruket av en større mengde glukose sammenlignet med normale celler og konvertering av flertallet av glukose til melkesyre. Tumorcellene fortrinnsvis bruke glykolyse i løpet av mitokondriell oksidativ fosforylering for glukoseavhengig ATP produksjon selv i nærvær av nok oksygen til drivstoff mitokondriell respirasjon. [1]. Denne avvikende energisk metabolisme, kjent som «Warburg effekten», er derfor i roten av tumordannelse og vekst og har blitt enda diskutert som en mulig kjennetegn på kreft [2].
I det siste tiåret, oppdagelsen av onkogener omdirigert interesse fra studier av cellenes stoffskifte i tumorer overfor de som tar sikte på å avdekke funksjonen av onkogener som styrer stoffskiftet. Så langt de avgjørende faktorene anerkjent for å produsere kreft metabolsk fenotype synes å være de onkogene mutasjoner som endrer vekstfaktor signaliserer gjennom PI3K /Akt /mTOR pathway [3]. Aktivering av denne veien øker metabolske aktiviteter for glykolyse av to store arrangementer. Først blir syntesen av sukkeret transporter Glut1 indusert for å lette glukoseopptak av cellene [4], [5]. For det andre, blir aktiviteten av transkripsjonskompleks HIF-1α økt, noe som i samarbeid med transkripsjonsfaktoren c-Myc øker syntesen av flertallet av glykolytiske enzymer [6]. Økte mengder av villtype-enzymene følgelig resultere i økte spesifikke aktiviteter. Imidlertid er glykolytisk fluks i eukaryote organismer kontrollert ved allosteriske enzymer som beholder sin regulering ved tilbakemelding inhibering på tross av de forhøyede aktiviteter mellomledd enzymer. Denne uttalelsen har blitt bekreftet av eksperimenter i
E. coli product: [7] og
S. cerevisiae product: [8], hvor overekspresjon av alle glykolytiske enzymer hadde ingen virkning på hastigheten av glukoseforbruk og /eller etanolproduksjon. Derfor er en nødt til å konkludere med at viktige modifikasjoner av kinetikken av regulatoriske enzymer skal også være involvert i metabolske endringer som skjer i løpet av transformasjonen av normale pattedyrceller til kreftceller.
glykolyse er sentral i primær metabolisme, og på vanlig måte, er det strengt regulert av tre allosteriske enzymer, heksokinase, 6-phosphofructo-1-kinase (PFK1) og pyruvat-kinase (PK), som katalyserer individuelle irreversible trinn. Heksokinase, er involvert i den første reguleringstrinnet, synes hovedsakelig i en HK2 isoenzymet form i tumorer som er bundet til den mitokondrielle ytre membran som vender mot cytosol. Microlocation av dette enzymet muliggjør fortrinnsrett til nylig syntetisert ATP for å fosforylere glukose, og det er motstandsdyktig mot produkt hemming [9]. En annen allosterisk enzym er pyruvat kinase, som regulerer metabolsk fluks over terminale del av glykolyse. Tumorceller er blitt vist å uttrykke utelukkende embryonale M2 isoformen av PK som kan aktiveres av fruktose-1,6-bisfosfat. Imidlertid binding av tyrosin-fosforylerte peptider til PK-M2 resulterer i utslipp av allosterisk aktivator, som fører til hemming av enzymatisk aktivitet. Deaktivering av PK-M2 i tumorceller antas å avlede glukosemetabolismen fra energiproduksjon til anabole prosesser [10].
Men den mest komplekse kontroll over glycolytic flux skyldes PFK1 (EC 2.7.1.11), som overgår de regulatoriske rollene til de andre to allosteriske enzymer. PFK1 katalyserer fosforyleringen av fruktose-6-fosfat til fruktose-1,6-bisfosfat, ved hjelp av MgATP som en fosforyl donor [11]. PFK1 stimuleres av fruktose-2,6-bisfosfat (F-2,6-BP), ADP /AMP og ammonium-ioner, mens citrat og ATP fungere som sterke hemmere [11], [12].
under utviklingen, eukaryote PFK1 enzymer utviklet av dobbeltarbeid, tandem fusjon og divergens av katalytiske og effektor bindingssteder av en prokaryot stamfar [12]. Imidlertid, strenge bevaring mellom aktive sete-rester i den N-terminale segment av eukaryote enzym og de av bakterielle PFKs antyder at det aktive sete av eukaryotisk PFK1 ligger bare i den N-terminale del [12]. På den annen side, de allosteriske ligand bindingssteder som utviklet seg underveis i evolusjonen av mutasjoner i C-enden gjør at finjustering av regelverket enzymet ved forhøyede nivåer av spesifikke nedstrøms metabolitter. En av de allosteriske ligandene er citrat, som virker som en potent inhibitor av alle pattedyr PFK1 isoformer. Studier på citrate allosteriske steder i kanin muskel PFK1 konkluderte med at disse områdene utviklet seg fra den fosfoenolpyruvat (PEP) /ADP allosterisk stedet for
Escherichia coli
. Aminosyrerester som danner citrat allosterisk sete er lokalisert både i N- og C-termini av molekylet [13].
I pattedyr genomer, tre forskjellige PFK1 gener er til stede og er en annen måte uttrykkes i enkelte vev. I menneskelig vev, deres protein produkter har følgende molekylmasser: muskeltype (PFK-M), 85051 Da [14]; leveren type (PFK-L) 84 917 Da [15]; og blodplatetype (PFK-P), 85596 Da [16].
Alle tre isoenzymer er sterkt hemmet av citrate, med IC
50 verdier av 0,08, 0,13 og 0,18 mm hjernen (blodplater), muskel og lever PFK1, henholdsvis [17]. Alle menneskelige PFK1 isoformer er også rapportert å være intenst hemmet av ATP-konsentrasjoner høyere enn 0,05 mM, ennå (F-2,6-BP) kan motvirke de negative effektene av ATP til en viss grad [18].
, i kreftceller, er aktiviteten av PFK1 enzymer som antas å være oppregulert bare ved tap av p53-funksjon, noe som fører til nedregulering av den tigar protein som virker som en fruktose-bisfosfatase-2,6-[19 ]. Følgelig nivået av F-2,6-BP holdt seg høy i tumorer og fungerte som en sterk positiv stimulans.
Men en PFK1 isoform som var mindre følsom for citrate hemning (K
i = 0,75 mM citrat), og mer følsom for aktivering av F-2,6-BP ble beskrevet i human glioma [20]. En PFK1 isoform med liknende kinetiske egenskaper ble også observert i det raskt voksende gnager AS-30D hepatomceller, som viste fullstendig ufølsomhet overfor sine allosteriske hemmere, citrat og ATP, i nærvær av fysiologiske konsentrasjoner av F-2,6-BP. I tillegg ble enzymet sterkt aktivert ved sine aktivatorer NH
4
+, AMP, og F-2,6-BP [21]. Likevel, arten av PFK1 isoformer som oppviser endringer i enzymkinetikk ble ikke undersøkt i detalj.
A citrat inhibering resistent form for PFK1 som ble aktivert til et høyere nivå ved allosteriske aktivatorer er nylig blitt beskrevet i det kommersielt viktige sopp,
Aspergillus niger product: [22] – [24]. Disse kinetiske egenskaper ble tilskrevet 49-kDa underenheter, som er relativt små PFK1 molekyler med hensyn til andre eukaryote PFK1s på ca 85 kDa. Videre undersøkelser viste at de kortere 49-kDa-fragmentene er dannet av en to-trinns posttranslasjonell modifisering av den native 85-kDa-enzym [23] – [25].
I den foreliggende rapport presenterer vi bevis for at en lignende posttranslasjonell modifisering av den native muskel-type PFK1 kan også forekomme i pattedyrcancerceller som dermed fører til dannelse av aktive kortere PFK1 fragmenter med endrede kinetiske parametre.
Resultatene
Analyser av aminosyre sekvensene til den humane PFK-M-proteinet
opprinnelsen av pattedyrgener som koder for enzymer PFK1 ved duplisering av prokaryote stamfar gener [12] kan bekreftes ved justeringen av aminosyrerestsekvenser av N- og C- halvdeler av det humane PFK-M-isoenzymet, og viser betydelig homologi (supplerende fig. S1). Analyse utført av ClustalW [26] viste 25,4% identitet, 21,6% sterk likhet, 11,6% svak likhet og 41.8% forskjell mellom aminosyrerestene i begge halvdeler av primærstrukturen.
studier på posttranslasjonell modifikasjon av
A. niger
PFK1 viste at det native enzym ble først spaltet av serin protease til en kortere protein som var i utgangspunktet inaktive, men gjenvant aktiviteten etter fosforylering av en spesifikk treonin rest som ble lokalisert i den enzym aktivt senter [25]. Et negativt ladet aminosyrerest (fosforylert treonin) var vesentlig for generering av enzymaktivitet [25]. Ved å erstatte kodonet for treonin residuet med en for glutaminsyre i den avkortede
A. niger PFK
A, behovet for fosforylering av opprinnelig inaktive kortere PFK1 fragmenter ble eliminert og aktive kortere PFK1 fragmenter ble kodet direkte av den modifiserte
PFK, En gener [25]. Ved å samkjøre de utledede aminosyresekvenser av tre menneskelige isoenzymer med at av
A. niger
enzym (supplerende fig. S2), en negativt ladet aminosyre-rest (asparaginsyre) ble funnet bare i sekvensen av PFK-M i posisjonen som svarer til den threoninrest i
A. niger
protein. De to andre isoenzymer, PFK-L og PFK-P, inneholdt et ikke-polart alaninrest ved den tilsvarende nettstedet. PFK-M med en negativt ladet asparaginsyrerest i denne kritiske locus ble derfor konkludert å være den mest sannsynlige kandidat for generering av aktive kortere PFK1 fragmenter etter en enkelt posttranslasjonell modifiseringstrinn.
In vitro
posttranslational modifisering av pattedyr PFK1
for å bekrefte at, ble PFK1 isolert fra kanin muskel. Det rensede enzym ble inkubert med forskjellige proteaser og testet for tilstedeværelse av nylig genererte, aktive, citrat hemming bestandig kortere PFK1 fragmenter. Forskjellige kommersielt tilgjengelige proteaser fra forskjellige arter ble anvendt i de enkelte forsøk.
Forsøket ble utført i en buffer inneholdende 5 mM citrat, som virker som en sterk inhibitor av det native enzym, men ikke av de kortere fragmenter. Etter å ha begrenset proteolyse av det rensede opprinnelige PFK1 med proteinase K (0,001 mg /ml), ble PFK1 aktivitet påvist. En gradvis økning i PFK1 aktivitet ble påvist i prøvene som ble eksponert for proteolytisk virkning for lengre perioder (Fig. 1). Med SDS-PAGE, ble fragmenter på omtrent 45 kDa observert etter begrenset proteolyse med 0,001 mg /ml Proteinase K (supplerende fig. S3), mens inkubasjon med proteinase K ved en høyere konsentrasjon (0,01 mg /ml) fremstilt inaktive, litt kortere fragmenter. Ingen aktive fragmenter kunne påvises etter spalting av innfødte enzym med andre kommersielt tilgjengelige enzymer av mikrobiell eller opphav hos pattedyr.
Aktiviteter på mors PFK1 isolert fra kanin muskel etter begrenset proteolyse av proteinase K (mørk) og ubehandlet innfødte enzym (lys) som målt i et system inneholdende 5 mM citrat. Dataene er representative for tre uavhengige målinger og er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.
Dette eksperimentet viste først og fremst at en ettrinns posttranslational modifisering av pattedyr PFK1 var mulig for ettergivende aktive kortere PFK1 fragmenter. Den protease som faktisk var involvert i produksjonen av slike fragmenter i humane celler gjenstår å fastslå, men de mest sannsynlige kandidatene er serinproteaser som må aktiveres intracellulært.
Oppdager korte PFK-M fragmenter i metastatisk tumor celle linjer ved immunblot
for å undersøke hvilke PFK1 former er til stede i tumorceller, fire forskjellige neoplastiske cellelinjer som er kjent for å indusere metastatiske svulster etter innsetting i forsøksdyr ble brukt. De følgende cellelinjer ble testet: humane karsinomceller HeLa-celler; mus melanom B16-F10 celler; og to lymfomer, rotte Nb2-11 linjen og den menneskelige TF-1 linje. For western blotting, hevet et antistoff mot en epitop av enzymets aktive senter som var identisk i forskjellige pattedyr PFK1-M isoformer, men ikke i L- eller P-isoformer, ble benyttet.
i homogenater av alle neoplastisk celle linjer, mengden av opprinnelig PFK1 av 85 kDa var lavere enn påvisningsgrensen immunoblotting (fig. 2). Imidlertid ble en rekke med lavere molekylvekt fragmenter flekket. I alle cellehomogenater, fragmenter av omtrent 47 kDa var til stede, mens noen andre fragmenter dukket opp sporadisk. I motsetning til de tumorigene cellelinjer, ble bare de native 85 kD PFK1 enzymer observert i lymfocytter isolert fra perifert humant blod. Naturlige enzymer var dominerende også i humane embryoniske nyreceller (HEK 293-cellelinje) ved hjelp av en identisk metode immunofarging. HEK celler ble udødeliggjort av adenovirus, men var ikke tumorigent. Selv om ingen 47 kDa lavmolekylært fragment ble påvist i HEK-celler, ble noen litt kortere opprinnelige enzymformer observert som kan være et produkt av alternativ spleising. I human muskel, har en alternativ transkript som koder for en PFK-M-isoenzymet er rapportert, hvilket gav et aktivt enzym med 749 aminosyrerester og en molekylvekt på 81776 Da [27]. Bevis for alternativ spleising av det PFK-M-genet er også blitt rapportert hos mus [28].
Western-blots av fire tumorigene cellelinjer (ovenfor) viste tilstedeværelsen av fragmenter av forskjellige lengder, med et fragment av 47 kDA regelmessig til stede, mens ingen innfødte 85-kDa PFK1 kunne observeres. I ikke-neoplastiske cellelinjer (nedenfor) (HEK celler), de innfødte PFK1 formene var dominerende, mens i normale lymfocytter isolert fra perifert blod fra mennesker bare et enkelt proteinbånd ble påvist tilsvarende 85 kDa innfødte PFK1. I Western blot av lymfocytter to volumer av cellelysat ble påført gelen.: 10 ul (til venstre), og 20 ul (høyre)
I kontrollgruppen ble det ikke bånd observert når en prøve vekstmedium ble immunoblottet med antistoffer som brukes for PFK1 deteksjon.
Oppdage korte PFK-M fragmenter i svulster ved immunoblotting
i en svulst som har utviklet seg i en C57BL /6 mus, 10 dager etter subkutan injeksjon av B16-F10 celler, var nesten identiske fragmenter påvises som i B16-F10 celler som vokser i en vevskultur (fig. 3). Men i en tumor, et sterkt bånd som tilsvarer det native PFK-M enzym var til stede som sannsynligvis stammer fra ikke-tumorigen støttevevet slik som blodkar, stroma eller inflammatoriske celler. Mer detaljert inspeksjon av de kortere fragmenter fra B16-F10 celler og tilsvarende tumor viste at 47 kDa-fragmentet var tilstede i individuelt voksende celler mens de som utvikles i en tumor uttrykte et 45 kDa-fragment.
Ingen opprinnelige PFK1 enzym var påvises i cellene som vokste i en vevskultur, mens i en tumor, et sterkt signal som tilsvarer det native enzym var til stede. Kortere fragmenter ble påvist i begge homogenates med en 47 fragment til stede i individuelt voksende celler og en 45 kDa fragment til stede i en svulstvev.
avkortet menneskelig muskel PFK1 cDNA koder aktive kortere PFK-M fragmenter i
E.coli
celler med forstyrret innfødte
PFK
A
i neste trinn, effektiviteten av aktive kortere menneskelige PFK-M fragmenter ble testet i en
E. coli
stamme som manglet egne innfødte PFK1 proteiner. Selv om den eksakte molekylære massen av de kortere fragmenter ikke kunne fastslås fra Western blot, ble en serie av avkortede gener fremstilt fra human muskel PFK1 cDNA. Avkortede gener ble satt inn i
E. coli
RL 257 [29] belastning, og transformanter ble testet med hensyn til endrede vekstkarakteristika på et medium inneholdende glukose. Proteinene kodet for av avkortede gener som var forskjellige ved flere aminosyreresidier og som omfattes molekylvekt som strekker seg fra 45 kDa til 46 kDa og 47 kDa til 48 kDa (supplerende Tabell S2). To transformanter i stand til å vokse på glukose minimalmedium supplert ble avslørt, en fra hver gruppe av molekylmasser (fig. 4). Den første stammen syntetiserte Fragment 4 (supplerende Tabell S2) med 422 aminosyrerester og en molekylvekt på 45 551 Da, mens den annen stamme som er kodet Fragment nummer 9 (supplerende Tabell S2) med 443 aminosyrerester og en masse på 47 835 Da. Cellene i begge stammer multiplisert til en optisk densitet på 2 i ca 24 timer, noe som indikerte at begge rekombinante proteiner var aktive og i stand til effektivt å delta i bakteriell metabolisme. Ingen vekst av trans koder andre kortere PFK-M fragmenter kunne observeres, selv om syntetiserte rekombinante proteiner ble oppdaget av vestlige blotter (supplerende Fig. S4). Ingen vekst på glukose medium kunne påvises ved en kontroll, foreldre RL257 stamme som bærer den pALTER-Ex1 plasmid uten genet innsatt. Overraskende, transformant som koder for det native, humane PFK-M (85 051 Da) var ikke i stand til å formere seg under identiske betingelser, men høy enzymatisk aktivitet (mer enn 600 mU /ml) målt i det cellefrie ekstraktet.
to
E.coli
trans koder Fragment 4 (⧫) og fragment 9 (□) var i stand til å vokse i supplert glukose minimalmedium. Ingen vekst av foreldre belastning, RL 257, bærer pALTER-Ex-en plasmid uten innsatt genet (•) kunne påvises. Dataene er representative for tre uavhengige målinger og er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.
I begge trans som var i stand til å vokse på glukose medium, ble PFK1 aktivitet påvist i homogenates. I begge transformanter som var i stand til å vokse på glukose medium, ble PFK1 aktivitet påvist i homogenater. I transform koding Fragment 9, aktivitet motstandsdyktig mot ATP og citrate hemming ble spilt inn 0,5 mM av F6P som er nær fysiologisk konsentrasjon [30]. Den Fragment 9 viste høy affinitet mot ATP (K
m på ca 0,05 mm), mens i konsentrasjoner høyere enn 0,2 mm, kunne ingen ATP hemming oppdages (Fig. 5A). Tvert imot, det rekombinante humane opprinnelige 85 kDa PFK-M isolert fra
E. coli RL257
-stamme viste en topp i enzymaktiviteter ved økende konsentrasjoner av ATP. Ved lave konsentrasjoner ATP aktivitetene steg mer langsomt i forhold til det kortere fragment, som viser lavere affinitet av det native enzym mot ATP (K
m~0,3 mM). Imidlertid ATP konsentrasjoner over 0,6 mM forårsaket en kraftig reduksjon av den opprinnelige enzymaktivitet og bare en beskjeden PFK1 aktivitet ble detektert ved ATP-konsentrasjon på 1 mM (Fig. 5A). Natriumcitrat ikke hemmer aktiviteten til den kortere PFK-M-fragmentet (Fig. 5B). Dette er i motsetning til de kinetiske egenskapene til det rekombinante humane opprinnelige PFK-M enzym hvor en sterk følsomhet mot sitrat ble avslørt [31]. Ingen inhibering av kortere fragment med laktat kunne påvises enten (figur 5B.), En metabolitt som nylig er foreslått for å nedregulere mus PFK1 aktiviteter [32].
I figur 5A relative spesifikke aktiviteter PFK1 detekteres i homogenat av transformanten som koder fragment 9 (□) og med naturlig PFK-M enzym isolert fra
E.coli
transformant (○) er vist, som ble målt ved økende konsentrasjoner av ATP. I figur 5B spesifikke PFK1 aktiviteter ble målt i homogenatet av transform kodende fragment 9 uten inhibitor (□), i nærvær av 5 mM Na
3-citrat (◊), og med 5 mM Na-laktat (Δ) . Alle målingene ble utført med 0,5 mm F6P. Dataene er representative for minst tre uavhengige målinger, og er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik.
Fruktose-6-fosfat-metningskurver uten og med F-2,6-BP viste en endring i PFK- M aktivitetene til både det native enzym (fig. 6A) og fragment 9 (fig. 6B). Ved å legge til F-2,6-BP til målesystemet, ble en sigmoid tomt konvertert til Michaelis-Menten kinetikk, preget av en sterk økning i aktiviteter med hensyn til underlaget konsentrasjon. Selv om F-2,6-BP økte affiniteten av begge enzymene mot F6P som et substrat, aktivatoren forårsaket også en markert økning i maksimal hastighet av den korteste fragment 9 (fig. 6B), mens ingen slik virkning kan tas opp med det naturlig enzym (fig. 6A).
i figur 6A F6P metningskurver for den isolerte opprinnelige PFK-M-enzym med (○) og uten (◊) 4 uM av F-2,6-BP er presentert. I figur 6B F6P metningskurver detektert i homogenatet av transform koding Fragment 9 med (□) og uten (Δ) 4 uM av F-2,6-BP er vist. Målingene ble utført med 1 mM ATP. I begge grafer relative spesifikke aktiviteter vises. Dataene er representative for minst tre uavhengige målinger og er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.
De kortere PFK-M fragmenter syntes å være svært ustabil i in vitro forhold. Aktiviteten kan stabiliseres i en viss utstrekning i et cellefritt ekstrakt som inneholdt ca. 10 mg proteiner pr ml ved tilsetning av fruktose-6-fosfat til en sluttkonsentrasjon på 6 mM. Imidlertid hurtig deaktivering ble registrert i målehetteglass (supplerende fig. S5) når mengden av oppløste proteiner ble signifikant redusert. Etter ca 10 minutters inkubasjon ved 30 ° C, kunne ingen NADH forbruk påvises i systemet.
Uttrykk for h
PFK
MFrg9 i ikke-tumorigent HEK 293 celler fremmer vekst, glukose forbruk og laktat produksjon
for å finne ut om modifiserte PFK-M enzymer har lignende fysiologiske effekter i ikke-tumorigene humane celler (Flp-in T-Rex HEK 293 cellelinje), ble stabile transfektanter forberedt på at aktivert konstituerende uttrykk for h
PFK
M koder for den innfødte PFK-M og h
PFK
MFrg9 koding av PFK-M Fragment 9. Vekst, glukose forbruk og melkesyre ble sammenlignet med de i transfektanter bæring integrert tomt plasmid under identiske vekstbetingelser. Cellene uttrykker h
PFK
M og h
PFK
MFrg9 proliferated raskere i forhold til foreldre celler, som observert på semi-logaritmisk graf, men detaljerte analyser av en lineær tomt på de samme dataene foreslo en litt kortere lagfase av transfekterte celler i forhold til foreldrestammen (fig. 7A). Det ble ikke observert den mest drastisk forskjell blant testede transfektanter for laktat utskillelse. Etter 24 timers inkubering, mengden av laktat akkumulert i mediet og normalisert til 1 million celler avslørte fire folder høyere produktivitet av stammen syntetisere Fragment 9 med hensyn til den belastningen som koder for det native PFK-M og seks folder høyere i forhold til foreldrenes press. På dag to, mengden av laktat akkumulert fremdeles var omtrent 30% høyere i cellene med fragment 9, mens senere, tilsvarende verdier ble oppnådd ved alle de tre testede cellelinjer (Fig. 7C). Økt laktatproduksjon av celler som uttrykker h
PFK
MFrg9 genet ble reflektert også i glukoseforbruk. Etter 24 timer, den høyeste mengde glukose, normalisert til den faste celle nummer, har blitt tatt opp av cellene som koder for Fragment 9, ble omtrent 40% mindre glukose forbrukt av cellene syntetiserer det native PFK-M enzymet, mens den overordnede cellene metabolisert enda mindre glukose (fig. 7B).
i figur 7A vekst av Flp-In T-Rex HEK 293 celler med integrerte h
PFK
MFrg9 (h
PFK
MFrg9 /HEK – ▪) koding av Fragment 9; integrert h
PFK
M (h
PFK
M /HEK – •) som koder for den innfødte PFK-M enzym; og celler med integrert tomt plasmid (HEK – ◊) er presentert i logaritmisk modus. I figur 7B glukoseforbruk av transfektanter normalisert til 1 million celler er vist. I figur 7C laktatproduksjon omregnet til 1 million celler er presentert. Identiske symboler for individuelle transfektanter brukes i alle tall. Dataene er representative for tre uavhengige målinger og er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.
Diskusjoner
En rekke onkogener, inkludert Akt [33], BCR-Abl [34], c-myc og HIF [35], fremme glukosemetabolisme i kreftceller. Imidlertid aktivering av Akt alene, som koder for en serin /treonin kinase som er under kontroll av phosphatidylinositide-3-kinase PI3K, har vist seg tilstrekkelig til å stimulere overgangen til aerob glykolyse [36]. Imidlertid forblir de underliggende molekylære endringer på nivå av regulatoriske glykolytiske enzymer dårlig forstått. Konstitutiv aktivering av Akt har vært implisert i regulering av celleproliferasjon [37] og foreslått for å delta i å fremme Glut1 transportøraktivitet [4]. Videre har stimulerende rolle av PI3K /akt-signalreaksjonsveien er rapportert i hormonavhengig proteolytiske induksjon (kallikrein genekspresjon) i bryst [38] og [39] prostatacancercellelinjer. Menneskelig vev kallikreins tilhører en undergruppe av serin proteaser som ligner proteinase K, som vi har vist her for å kløyve innfødte PFK1 enzymer for å danne aktive, citrat hemming bestandig kortere PFK1 fragmenter. Derfor Akt-mediert induksjon av aerob glykolyse kan også være involvert i posttranslational modifisering av PFK1 ved å aktivere proteolytiske enzymer.
Denne antagelsen understøttes av tilsvarende resultater oppnådd med transfekterte celler konstitutivt uttrykker Akt [36] og celler syntetiserer svært aktive kortere PFK1 fragmenter i denne studien. Begge typer celler forbrukes glukose raskere og utskilles laktat i høyere avkastning i forhold til de un-transfekterte celler.
Med Western blotting eksperimenter av tumorigene og normale celler ingen mors 85 kDa enzymet kan bli oppdaget i neoplastiske celler, mens et fragment på 47 kDa var karakteristisk til stede. Men noen andre mindre fragmenter ble oppdaget i tillegg. De mest sannsynligvis stammer fra den opprinnelige PFK1 siden av antistoffet som brukes, viste seg å være spesifikk nok og ingen lavmolekylære peptider viste seg i lysatet av lymfocytter og HEK-celler. Dessuten vet man lite om cytosoliske proteolytisk aktivitet i kreftceller derfor er det vanskelig å spekulere om antall proteaser som kan angripe PFK1 enzymet. Utvilsomt vil bedre informasjon om posttranslasjonell modifisering oppnås ved å bruke en epitop-tagget PFK1 allel. Faktisk testet vi AU1 epitop tag [40] som var N-terminalt smeltet til innfødte PFK-M. Selv om merket
PFK
-M-genet ble uttrykt og protein påvist, kunne ingen enzymaktivitet påvises (resultater ikke vist). Vi tror at utvidelsen av seks aminosyrerester påvirket folding av proteinet i cellene og hindret den korrekte foreningen av monomeres inn i en aktiv tertameric holoenzyme. Dessverre, inaktive enzymet kan ikke være ansatt for studier av posttranslational modifisering av proteolytisk spalting.
Interessant nok ble litt forskjellige kortere fragmenter påvist i B16-F10 cellene vokser individuelt og i en svulst vev. Skjønt, in vivo eksperimenter utført i
E.coli
trans avslørte at både 45 og 47 kDa PFK-M fragmenter kan knytte til en aktiv holoenzyme. Denne observasjon antydet at forskjellige miljøforhold kan påvirke posttranslasjonell modifikasjon av PFK-M in B16-F10 celler.
Etter posttranslasjonell modifikasjon av PFK-M, er enzymaktiviteten bevares, fordi det aktive setet av de eukaryote PFK1s er lokalisert i den N-terminale ende [12]. Imidlertid er kinetiske egenskapene til de kortere PFK-M-fragmenter endres (fig. 5-6). Viktigste modifiserte enzymer blir ufølsomme for citrate og ATP hemming. Ved en proteolytisk spalting av den C-terminale del av det native molekylet noen komponenter av citrat bindingssete går tapt, så vel som et motiv som er ansvarlig for inhibering av ATP (supplerende fig. S1). Lignende kinetiske endringer av de modifiserte PFK1 fragmenter ble også observert etter posttranslational endring av innfødte PFK1 enzym i trådformede sopp
Aspergillus niger product: [24]. 5′-AATTATGGATCCATGACCCATGAAGAGCACC-3′.
doi:10.1371/journal.pone.0019645.s006
(TIF)
Table
