Abstract
Gambogic syre (GA), den viktigste aktive komponenten i gamboge harpiks, har potent antitumor aktivitet både
in vivo Hotell og
in vitro
. Men de underliggende molekylære mekanismene fortsatt uklare. I denne studien fant vi at GA kunne initiere autofagi i kolorektal kreftceller, og hemming av autofagi prosessen akselerert effekten av proliferativ hemming og apoptotisk celledød indusert av GA, noe som tyder på en beskyttende rolle autophagy. To-dimensjonal elektroforese-baserte proteomforskning viste at GA behandling endret ekspresjon av flere proteiner involvert i redoks-signalisering og lipidmetabolisme. Funksjonelle studier viste at GA-induserte feilregulering av lipid metabolisme kunne aktivere 5-lipoksygenase (5-LOX), noe som resulterer i intracellulær akkumulering ROS, fulgt av inhibering av Akt-mTOR signalering og autophagy initiering. Til slutt, resultatene ved bruk av en xenograft modell foreslått ROS-indusert autofagi beskytte mot antitumoreffekt av GA. Samlet utgjør disse dataene viste nye biologiske aktiviteter av GA mot tykktarmskreft som ligger bak beskyttende rolle ROS-indusert autofagi. Denne studien vil gi verdifull innsikt for fremtidige studier vedrørende kreft mekanismer GA
Citation. Zhang H, Lei Y, Yuan P, Li L, Luo C, Gao R, et al. (2014) ROS-mediert Autophagy indusert av feilregulering av Lipidmetabolisme spiller en beskyttende rolle i kolorektal kreft celler behandlet med Gambogic Acid. PLoS ONE 9 (5): e96418. doi: 10,1371 /journal.pone.0096418
Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Canada
mottatt: 25 desember 2013; Godkjent: 07.04.2014; Publisert: 8. mai 2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (Grant nummer~~POS=HEADCOMP: 30672480), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program, No.2012AA020201), National 973 Basic Research Program of China (2013CB911300) og Utdannings Institutt for Hubei-provinsen vitenskap og teknologi forskningsprosjekter av fremragende unge talenter prosjekt (Q20091207). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje største årsaken til kreft og den fjerde for kreftrelaterte dødsfall i verden [1], [2]. Hvis CRC kan diagnostiseres og behandles på et tidlig stadium, kan omtrent halvparten av CRC pasienter bli kurert ved kirurgi og multimodal behandling før metastasering skjer [3]. Men til dags dato effektive behandlingsstrategier for avansert CRC er begrenset. 40-50% av pasientene har metastatisk sykdom, hvorav 90% dø innen 5 år etter diagnose [4], [5]. Til tross for økende fremskritt innen molekylær medisin, effektiv tidlig diagnostisering, overvåking og behandling av CRC er fortsatt et dilemma. Derfor er forbedret systemiske terapeutiske strategier presserende behov for å effektivt eliminere primær eller metastatisk kreft, som utvikling av nye medikamenter kan være gunstig
Gambogic syre (GA;. C
38H
44o
8 MW 628,76), en polyprenylated xanthone, er en stor aktive ingrediensen i gamboge isolert fra
Garcinia product: [6], [7]. Det har blitt rapportert i tradisjonell kinesisk medisin som gamboge er kaldt, surt, bitter og giftig [8]. I Sørøst-Asia, har GA en lang historie med bruk for avgiftning, homeostase, anti-inflammatorisk og antiparasitt medisiner [7], [9], [10], [11]. I løpet av det siste halve århundre, har farmakologiske studier viste at GA har sterke antitumor aktivitet mot ulike tumorer inkludert human leukemi, hepatoma, oral, bryst, mage, bukspyttkjertel, prostata, epitelial livmorhals og lungekreft [9], [12], [ ,,,0],1. 3]. Nylig, GA har også blitt rapportert å ha en markert anti-tumor effekt for CRC-celler
in vivo
og
in vitro product: [14], [15]. På grunn av det brede spektrum av anti-tumor aktivitet med minimal toksisitet overfor normale celler, og GA blitt godkjent av kinesiske Food and Drug Administration for behandling av forskjellige kreftformer og er ferdig fase II kliniske studier [7], [16]. Selv om GA kjemiske struktur ble identifisert i 1980 fra både detalj NMR- og røntgen-krystallografiske studier [12], [17], [18], og flere antitumor mekanismer (inkludert induksjon av programmert celledød, cellesyklusregulering, telomerase depresjon, aktivering av T-lymfocytter, inhibering av angiogenese, reaktive oksygenarter (ROS) generasjon
osv.
) er blitt foreslått av en rekke forskningsgrupper over hele verden, [7], [12], [13], [18] [19], [20], de molekylære mekanismene som om dens potente anticancer aktivitet forbli tvetydig og krever videre undersøkelser.
Autophagy er en svært konservert katabolsk prosess preget av transport av cellulære komponenter fra bilags autophagosomes til lysosomer for nedbrytning og gjenvinning i respons til nærings sult eller metabolsk stress [21]. Autophagosome kjernedannelse er initiert av PI3 kinase type III-Atg6 /Beclin en kompleks, mens forlengelsen er overvåket av Atg12-Atg5 og Atg8 /LC3-fosfatidyletanolamin konjugerte systemer, som begge er viktige karakteristika for autofagi [21], [22] [23]. Autophagy kan induseres ved en rekke kjemoterapeutiske midler slik som arsenikk og oxaliplatin [24], [25]: imidlertid rolle autophagy i kreft er kontroversiell [26], [27], [28]. Regulert autophagic respons kan sikre den fysiologiske omsetning av ødelagte organeller og resirkulerte makromolekyler for å møte energibehov i respons til cytotoksiske medikamenter, som fører til langvarig celle overlevelse [26], [29]. I motsetning til dette kan en massiv akkumulering av autophagic vakuoler føre til enten autophagic celledød (type II programmert celledød), eller en endelig forsøk på cellen for å overleve, avhengig av tumortype, scene, genetisk sammenheng og det omkringliggende cellulære miljø [26] [29], [30]
reaktive oksygenforbindelser (ROS) er et samlebegrep som omfatter ufullstendig reduksjon av oksygen, inkludert superoksid anion (O
2
-)., hydrogen peroxide (H
2o
2), og hydroksyl-radikalet (HO •) [31], [32]. Viktige kilder til cellulære ROS genereres fra mitokondrielle elektrontransportkjeden (Mito-ETC), NADPH oksidase (NOX) kompleks og det endoplasmatiske retikulum [31], [32]. Kreftceller fra avansert stadium tumorer ofte utviser høy oksidativt stress, noe som tyder på at økte nivåer av ROS spiller en viktig rolle i tumorprogresjon og også skape kreftceller med lavere toleranse for ROS [33], [34]. Aktivering av onkogener, tap av funksjonell p53, avvikende metabolisme og kjemisk behandling har vært rapportert å øke produksjonen ROS i kreftceller [33], [34]. Det intracellulære redoks-homeostase er en viktig determinant for celle skjebne: dreven produksjon av ROS vanligvis resulterer i cytotoksiske virkninger og kan føre til celledød ved apoptose, mens moderate nivåer av ROS kan fungere som en andre-budbringer for regulering av diverse cellulære prosesser som celle overlevelse, spredning og metastase [35], [36], [37]. Opphopning av ROS har blitt rapportert å assosiere med igangsetting av autofagi og bli alltid involvert i utfallet av autofagi (celle overlevelse eller død) [38], [39]. Det er generelt akseptert at ROS kan indusere autophagy, og at autophagy, i sin tur, bistår i clearance av overdreven ROS for å beskytte celler mot oksidativ skade, noe som kan gjenspeile balansen av enten celleoverlevelse eller død [28], [38], [39].
Nyere studier viser at GA kan indusere akkumulering av ROS i kreftceller bidra til anti-kreft-aktivitet [40], [41], [42], mens autophagy kan hemme den terapeutiske effekten av GA på glioblastom celler [43]. I denne studien fant vi at GA kan fremme apoptose og autofagi i kolorektal kreft celler
in vitro Hotell og
in vivo
, og hemming av autofagi forbedret sensitivitet mot GA behandling. I tillegg ble akkumulering av intracellulært ROS som følge av 5-LOX som kreves for GA-indusert autofagi.
Materialer og metoder
Cell Culture and Reagents
human colon carcinoma celle linjer, HCT116 og SW620, og den murine colon carcinoma cellelinje C26 ble anskaffet fra ATCC. Celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum, 10
5 U /l penicillin og 100 mg /l streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 5% CO
2.
de følgende reagenser ble anvendt i denne studien: Gambogic syre (Gaia Chemical Corp, G1000), MTT (Sigma, M2128), 3-metyladenin (3-MA) (Sigma, M9281), NAC (Sigma, A9165), Z-VAD -fmk (Sigma, V116), akridinorange (Sigma, A6014), dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma, D2650) Apocynin (Sigma, A10809), rotenon (Sigma, R8875), nordihydroguaiaretinsyre (NDGA) (Sigma, 74 540) , pepstatin A (Sigma, P4265), E64d (Sigma, E8640). For lagring, ble en 10 mM løsning av GA fremstilt i DMSO, lagret ved -20 ° C, og deretter fortynnet etter behov i kulturmedium
Antistoffer mot de følgende proteinene ble anvendt:. Spaltet Caspase 3 (Cell signale , 9664S), Beclin 1 (Santa Cruz, sc-11427), LC3 (Abcam, ab58610), Atg5 (Abcam, ab78073), Atg7 (Abcam, ab53255), p62 (Abcam, ab91526), 5-LOX (Abcam, ab39347 ), aktin (Santa Cruz, sc-1616), Akt (Cell signalering, 4685), fosfor-Akt (Cell signalering, 4051), mTOR (Cell signalering, 2983), fosfor-mTOR (Cell signalering, 2971), p70 S6K (Santa Cruz, sc-9027), fosfor-p70 S6K (Santa Cruz, 7984-R), pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert anti-kanin-sekundært antistoff (Santa Cruz, sc-2004), HRP-konjugert anti-muse-sekundært -antistoff (Santa Cruz, sc-2005).
cellenes levedyktighet Assay
Cellene ble sådd ut i 96-brønners kulturplater og behandlet i 12 timer, 24 timer og 36 timer henholdsvis. Deretter ble cellelevedyktigheten ble bedømt ved anvendelse av MTT-analyse [44]. Absorbans ble målt ved 490 nm (forsøk bølgelengde) og 570 nm (referansebølgelengde) med en multi-brønn spektrofotometer (MDC, Sunnyvale, CA).
Annexin V-FITC /PI dobbeltmerket Flow Cytometry
for å oppdage den apoptotiske forholdet mellom celler behandlet med GA (0,25, 0,5 eller 1,0 mm), uttrykk for Annexin V-FITC og utelukkelse av PI ble oppdaget ved hjelp av to-farge flowcytometri (FCM). HCT116 eller SW620 celler ble oppsamlet under anvendelse av EP-rør, vasket to ganger med PBS og resuspendert i 500 ul bindingsbuffer. Prøvene ble inkubert med 5 ul Annexin V-FITC i 10 minutter ved værelsestemperatur og deretter 5 ul PI ble tilsatt. Hver prøve ble inkubert i ytterligere 10 minutter ved romtemperatur i mørke før fluorescensintensiteten ble kvantifisert ved hjelp av et strømningscytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).
GFP-LC3 Farging av autophagosomes
HCT116 og SW620-celler ble transfektert med en pEGFP-LC3 plasmid (betegnet som GFP-LC3) ved anvendelse av lipofektamin 2000 (Invitrogen, 11,668,027) i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescensen av GFP-LC3 ble sett og hastigheten av GFP-LC3-stemplet vakuolen formasjons (autophagosomes) ble tellet under et fluorescensmikroskop [45], [46]. Celler med GFP-LC3 punctate prikker ble definert som positivt dersom celler som hadde 5 eller flere GFP-LC3 prikker i cytoplasma [47].
Påvisning av Surt Vesicula Organ
celler (1 x 10
5) ble sådd ut i 6-brønns plater. Etter behandling, ble cellene farget med 1 pg /ml akridinorange i 15 minutter, vasket med PBS og undersøkt ved fluorescens-mikroskopering [48], [49].
Elektronmikros
Celler ble høstes, pelletert og festet i paraformaldehyd (0,1% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylat) i 2 timer, postfiksert med 1% OsO
4 i 1,5 timer, vasket og til slutt farget i 1 time i 3% vandig uranylacetat. Prøvene ble deretter skylt med vann igjen, tørket med gradert alkohol (50%, 75% og 95-100% alkohol) og innleiret i Epon-Araldite harpiks (Canemco, 034). Ultratynne snitt ble kuttet på en Reichert Ultramicrotome, kontra med 0,3% bly citrate og undersøkt på en Philips EM420 transmisjonselektronmikroskop. Celler med autophagic vakuoler ble definert som positiv hvis de hadde 5 eller flere autophagic vakuoler. Området okkupert av autophagic vakuoler og cytoplasma ble bestemt med Image Pro Plus Bildeanalyse Software versjon 3 og brukes til å beregne cytoplasmatiske området okkupert av autophagic vakuoler [50].
TUNEL analysen
TUNEL analysen ble utført ved hjelp av blindgaten Fluorometrisk TUNEL system (Promega, G3250) i henhold til produsentens instruksjoner. Tunel positive celler ble undersøkt under et fluorescens mikroskop [51].
RNA interferens
Atg5
,
Beclin 1, 5-LOX Hotell og negativ kontroll siRNA ble syntetisert ved Genepharma. Sekvensene av siRNA var som følgende: menneskelig
Atg5
siRNA, sanse 5′-GAC Guu GGU AAC UGA CAA ATT-3 «og antisense 5′-UUU HiG AGU UAC CAA CGU CTT-3»; menneskelig
Beclin en
siRNA, sanse 5′-GGA GCC AUU UAU UGA AAC UTT-3 «og antisense 5′-AGU UUC AAU AAA UGG CUC CTT-3». 5-LOX er utformet i henhold til tidligere studie (målretting sekvens: 5′-GCGCAAGTACTGGCTGAATGA-3 «, NM_000698) [52]. SiRNA ble transfektert med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, 11668027) for 24 timer i HCT116 cellene i henhold til produsentens protokoll.
reaktive oksygen arter (ROS) Måling
Intracellulær ROS-nivået ble oppdaget av flekker celler med 2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) (GENMED, GMS10016.2) i henhold til produsentens instruksjoner. Den DCFH-DA signalet ble målt med en Molecular Devices Spectramax M5 fluorimeter (490 nm eksitasjon og 530 nm emisjon).
Immunoblot
Proteiner ble ekstrahert i RIPA-buffer (50 mM Tris-base, 1,0 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% TritonX-100, 1% natriumdeoksykolat, 1 mM PMSF) og kvantifisert med nevnte DC-proteinanalysesett (Bio-Rad). Prøver ble separert ved 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert over natten med Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST) (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) i 5% skummet melk ved 4 ° C, og deretter analysert ved hjelp av de primære antistoffer: kanin-anti-Beclin 1 (utvannet 1:500), kanin-anti-Atg5 (utvannet 1:1,000), kanin-anti-atg7 (utvannet 1:500), kanin-anti-LC3 (utvannet 1:1,000), kanin -Anti-5-LOX (utvannet 1:1,000), kanin-anti-Akt (utvannet 1:1,000), kanin-anti-fosfor-Akt (utvannet 1:1,000), kanin-anti-mTOR (utvannet 1:1,000) , kanin-anti-fosfor-mTOR (utvannet 1:1,000). Blottene ble inkubert med de respektive primære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking tre ganger i TBST, ble blottene inkubert med HRP-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff (fortynnet 1:5,000) eller HRP-konjugert anti-muse-sekundært antistoff (fortynnet 1:6,000) i 1 time ved romtemperatur. Blottene ble visualisert ved hjelp av western Immobilon Chemiluminescence reagenser (Millipore, WBKLS0500).
Som et mål på autophagic fluks, immunoblot for LC3 ble utført i fravær eller nærvær av lysosomal enzymhemmere. LC3 fluks ble bestemt ved forholdet av densitometrisk verdi på LC3-II i forhold til den tilsvarende DMSO-behandlet kontrollgruppe uten behandling, som beskrevet andre steder [23], [53].
2-DE og MS /MS-analyse
2-DE og MS /MS-analyse ble utført som beskrevet tidligere [54]. I korthet ble cellene løst i lyseringsbuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% pH3-10 amfolytt, Bio-Rad, USA) i nærvær av protease inhibitor (Sigma). Prøvene ble anbrakt i IPG strimler (17 cm, pH3-10NL, Bio-Rad) ved hjelp av en passiv rehydrering metode, og deretter underkastet isoelektrisk fokusering (Bio-Rad). Den andre dimensjonen separasjon ble utført med 12% SDS-PAGE etter likevekt. Gelene ble farget med CBB R-250 (Bio-Rad). Identifisering og kvantifisering av protein flekker i gelen ble oppnådd ved hjelp PDQuest programvare (Bio-Rad).
I-gel protein fordøyelse ble utført ved hjelp av massespektrometri klasse trypsin i henhold til produsentens instruksjoner. Gelen flekker ble avfarget med 100 mM NH
4HCO
3/50% acetonitril (ACN) og dehydrert med 100% ACN. Gelene ble deretter inkubert med trypsin (Promega, V5280), etterfulgt av dobbelt ekstraksjon med 50% ACN /5% trifluoreddiksyre (TFA). Peptid-ekstraktene ble tørket i en speed-VAC konsentrator (Thermo), og underkastet massespektrometrisk analyse ved hjelp av et Q-TOF massespektrometer (Micromass, Manchester, UK) utstyrt med en ESI-kilde.
Immunhistokjemi
Immunohistochemistry ble utført ved hjelp av Dako EnVision System (Dako Cytomation GmbH, Hamburg, Tyskland). Fortløpende parafinvoks vevssnitt (3-5 mikrometer) ble avvokset og vannes ut. Antigen gjenfinning ble utført ved forbehandling av lysbildene i citrat-buffer (pH 6,0) i en mikrobølgeovn i 12 min. Deretter objektglass ble avkjølt til værelsestemperatur i avionisert vann. Endogen peroksidaseaktivitet ble stoppet ved inkubering av lysbildene i metanol inneholdende 3% hydrogenperoksyd etterfulgt av vasking i PBS i 5 min, hvoretter delene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med normalt geiteserum og deretter inkubert ved 4 ° C over natten med den primære antistoffer. Neste delene ble skyllet med vaskebuffer (PBS med 0,1% bovint serumalbumin) og inkubert med pepperrotperoksydase-bundet geit-anti-kanin-antistoffer, etterfulgt av omsetning med diaminobenzidin og kontra med Mayers hematoksylin.
tumor xenograft modell
Eksperimentelle protokoller ble utført i samsvar med europeiske fellesskap rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609 /EØF) med godkjenning av Etisk komité Tongji Medical College. Sunn hunnmus (BALB /c, 6-8 ukers alder, ikke-fruktbar og 18-20 g hver) ble injisert subkutant med C26-celler (en million celler per mus). Når tumorene var omtrent 5 mm x 5 mm i størrelse (vanligvis ti dager etter inokulering), ble dyrene tilfeldig paret-matchet inn i to grupper (ni mus per gruppe) på følgende måte: en kontrollgruppe (intraperitoneal injeksjon av kjøretøyet: 5% DMSO , 50% PEG-400 i PBS) og en gambogic syregruppe (intraperitoneal injeksjon av 8 mg /kg gambogic syre gang annenhver dag i seks ganger). Tumorvolumene ble evaluert som følger: tumorvolum (mm
3) = (lengde x bredde
2) /2. Dyrene ble avlivet 12 dager etter injeksjon. Svulster ble dissekert og frosset i flytende nitrogen eller fast i formalin umiddelbart.
For å teste effekten av combi behandlinger, når svulstene var ca 600 mm
3, dyrene var pair-matchet i fire grupper (8 mus pr gruppe): en kontrollgruppe, GA, GA + NAC, og GA + 3-MA. Kontrollgruppe: intraperitoneal injeksjon av kjøretøyet: 5% DMSO, 50% PEG-400 i PBS. GA behandling: intraperitoneal injeksjon av 8 mg /kg gambogic syre en gang annenhver dag i ti ganger. NAC behandling: Dyrene mottok enten avionisert vann eller vann inneholdende NAC (7 mg /ml, nøytralisert til pH 7,4 med NaOH); Vi antok en gjennomsnittlig mus vekt på 25 g og daglig vannforbruk på 6,7 ml, estimert daglig morens dose var 1,9 g /kg /d [55]. 3-MA behandling: subkutane injeksjoner av saltløsning (kontroll) eller 1 mg /kg 3-MA, og injeksjonen ble gjentatt hver dag [56]. Tumorvolum ble evaluert som følger: tumor volum (mm
3) = (lengde × bredde
2) /2
Statistisk dataanalyse
Sammenligninger mellom to gruppene var. utført av Student test. Statistisk signifikans ble definert som
* p 0,05;
** p 0,01;
*** p 0,001
Resultater
GA induserer apoptose i tykktarmskreftceller
For å bestemme effekten av. GA på kolorektal kreft celler, ble HCT116 og SW620-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av GA i 12 timer, 24 timer eller 36 timer, henholdsvis. MTT-analysen ble anvendt for å bestemme cellenes levedyktighet. Som vist i figur 1A, behandling med GA resulterte i inhibering av proliferative HCT116-celler i både en dose- og tidsavhengig måte med IC
50 verdier på omtrent 1,1 uM, 0,6 uM og 0,5 uM i 12 timer, 24 timer og 36 timer, henholdsvis. SW620-celler viste bare doseavhengig hemming med en IC
50-verdi på omtrent 2 uM. I tillegg ble effekten av GA på tykktarmskreft celledød undersøkt ved anvendelse av Annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) og propidiumjodid (PI) dobbel-farging, såvel som TUNEL-analyser. Som vist i figur 1B, ble prosentandelen av Annexin V-positive celler, som er en indikasjon på døde celler, betydelig øket etter behandling med GA. Disse resultatene var i samsvar med de som ble oppnådd fra den TUNEL-analysen (figur 1C). Neste, vi undersøkt om GA-indusert celledød var caspase-avhengige. Som vist i figur 1D, ble spaltet caspase-3 akkumulert på GA behandling. Videre kan GA indusert celledød bli markert reversert av en pan-caspase-hemmer, Z-VAD-FMK (figur S1), noe som tyder på at GA induserte en caspase-avhengig apoptotisk celledød.
(A) HCT116 og SW620-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av GA i 12 timer, 24 timer eller 36 timer, og cellelevedyktigheten indeksen ble målt ved MTT-analyse. (B) HCT116 og SW620-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av GA i 24 timer ble celle apoptose påvist ved annexin-V fluorescein-isotiocyanat (FITC) og propidiumjodid (PI) dobbel farging etterfulgt av strømningscytometri-analyse. Dot tomt visning av Annexin V-FITC-fluorescens sammenlignet med propidiumjodid fluorescens er vist i logaritmisk skala. Levende celler testet negativt for både annexin V-FITC og PI. Populasjoner testing annexin V positive /PI negative var klassifisert som et tidlig stadium i apoptotiske celler, og dobbelt positive celler ble klassifisert som døde celler. Søylediagram som viser prosentandelen av døde celler etter forskjellige behandlinger. (C) HCT116 og SW620-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av GA i 24 timer, ble døde celler detektert ved TUNEL assay. De TUNEL-positive celler ble tellet fra minst 100 tilfeldige felt. (D) Immunoblot-analyse av spaltede-kaspase 3 fra lysater av HCT116 og SW620-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GA i 24 timer, og behandlet med 1 pM GA i 12 timer og 24 timer.
GA Starter Autophagy i Colorectal cancer celler
for å bedre forstå den anti-kreft effekt av GA, den ultra av HCT116-celler behandlet med GA eller DMSO ( 0,1%) ble analysert ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Tallrike membranbundne vakuoler, karakteristisk for autophagosomes, ble observert i cytoplasma av GA-behandlede celler, mens membranbundne vakuoler sjelden kunne bli funnet i celler behandlet med DMSO (figur 2A). I tillegg ble akridin orange farging brukt til å analysere dannelsen av sure vesikulær organeller (avos), en annen viktig funksjon i autophagy. Som vist i figur 2B, HCT116-celler behandlet med GA resulterte i åpen dannelse av gul-orange avos sammenlignet med DMSO-behandlede celler.
(A) øvre paneler. Representative transmisjonselektronmikroskopibilder som viser ultrastructures av HCT116-celler behandlet med enten DMSO (kontroll, 0,1%) eller 1 mM GA i 24 timer. Lavere paneler. Cellene med autophagic vakuoler ble definert som celler som hadde fem eller flere autophagic vakuoler. Prosentandelen av cellene med autophagosomes og gjennomsnittlig antall vakuoler per celle ble analysert fra minst 100 tilfeldig valgte TEM felt. Skala barer: 1 mikrometer; 100 nm (indikert forstørrelser). (B) akridin orange farging i HCT116-celler behandlet med DMSO (kontroll, 0,1%), 0,5 uM GA eller 1,0 uM GA i 12 timer. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. ** P. 0,01
lokalisering og aggregering av LC3 er kjent for å være viktig for transport og modning av autophagosome [57]. Derfor pEGFP-LC3 plasmid ble transient transfektert inn i både HCT116 og SW620 celler for å ytterligere bekrefte om GA initierer autofagi i kolorektal kreftceller. Som antydet i figur 3A, er prosentandelen av GFP-LC3-positive celler og gjennomsnittlig mengde GFP-LC3 punkter var begge signifikant øket ved behandling GA på en doseavhengig måte. Den lipidert form av LC3 formerer fra LC3-I til LC3-II er korrelert med graden av autophagosome formasjon [57]. GA også markert forbedret omsetningen fra LC3-I til LC3-II, som ble ytterligere akkumulert i nærvær av E64d og pepstatin A (begge lysosomal proteasehemmere) (figur 3B), noe som tyder på at GA kunne forbedre autophagic fluks. I tillegg til LC3, er uttrykk for en serie av autophagic relaterte proteiner, inkludert p62, Beclin 1, Atg7 og Atg12-Atg5, har vist seg å bli endret under autofagi [23]. Derfor, undersøkte vi ekspresjon av disse proteiner ved GA behandling. Som vist i figur 3C, GA oppregulert ekspresjon av Beclin 1, Atg7 og Atg12-Atg5 på en doseavhengig måte, mens akkumuleringen av p62 ble redusert. Disse resultatene videre demonstrert at GA kan indusere dannelsen av autophagosomes i kolorektal kreftceller.
(A) HCT116 og SW620-celler transfektert med en pEGFP-LC3 plasmid ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av GA i 24 timer. Celler ble definert som positiv hvis de hadde 5 eller flere GFP-LC3 prikker i cytoplasma. Prosentandelen av cellene med GFP-LC3 prikker og det gjennomsnittlige antall av GFP-LC3 punkter per celle ble analysert fra minst 100 tilfeldige felt. (B) Immunoblot-analyse av omdannelsen av LC3-I til LC3-II i HCT116-celler og SW620-celler etter behandling med indikerte konsentrasjoner på GA i 24 timer, eller med 1,0 uM av GA i 12 timer og 24 timer i fravær eller nærvær av lysosomale-inhibitorer (E64d og pepstatin hver på 10 ug /ml). (C) Immunoblot-analyse av ekspresjonsnivået av Atg12-Atg5 konjugat, Atg7, Beclin 1 og p62 etter behandlet med indikerte konsentrasjoner på GA i 24 timer, eller med 1 uM av GA i 12 timer og 24 timer. Actin fungerte som en lasting kontroll. * P 0,05; ** P. 0,01
Blokkering av Autophagy Forbedrer GA-indusert apoptose
Med tanke på paradoksale rollen autofagi i å fremme celledød eller overlevelse, vi behandlet ytterligere kolorektal kreftceller med en som vanligvis anvendes autofagi inhibitor (3-MA), enten alene eller i kombinasjon med GA for å bestemme den funksjonelle rolle av autophagy i GA-indusert apoptose. Som vist i figur 4A, forbehandling av HCT116-celler sammen med 3-MA betydelig forbedret effekten av GA-indusert proliferativ undertrykkelse. I samsvar med dette, er resultatene av Annexin V-/PI dobbel-farging (figur 4B) og TUNEL-analyser (figur 4C) viste også at GA i kombinasjon med 3-MA oppviste en sterkere pro-apoptotiske virkning sammenlignet med GA alene. I tillegg til transient transfeksjon med Atg5- eller beclin1 målrettet siRNA ablate Atg5 eller beclin 1-ekspresjonen kan hemme GA-indusert LC3-II-akkumulering, samt forsterke den anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger av GA i HCT116-celler (figur 4D-G). Disse dataene tyder på at autofagi beskytter GA-behandlede kolorektal kreftceller fra apoptotisk celledød.
(A-C) HCT116-celler behandlet med vehikkel-kontroll (1 ‰ DMSO, Control), 3-MA, 1 uM GA (GA), eller 1 uM GA i nærvær 3-MA (GA + 3-MA) i 24 timer. Og deretter ble cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-assay (A), og den apoptotiske virkning ble påvist ved PI /annexin-V-farging (B) og TUNEL-analyser (C). (D) Immunoblot påvisning av ekspresjonen av ATG5, beclin-1 og LC3 i HCT116-celler behandlet med GA i den foreliggende eller fraværende med siATG5 eller siBeclin 1. (E-G) HCT116-celler behandlet med Lipofectamine 2000 (kontroll), kontroll siRNA (siControl), siATG5 (siATG5), 1fiM GA (GA), GA i nærvær kontroll siRNA (GA + siControl), siATG5 (GA + siATG5) eller siBeclin1 (GA + siBeclin 1) i 24 timer. Og deretter ble cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-assay (E), og den apoptotiske virkning ble påvist ved PI /annexin-V-farging (F) og TUNEL-analyser (G). * P 0,05; ** P. 0,01
Redox feilregulering ble indusert ved GA Behandling
For å utforske den mekanismen som GA induserer autofagi, vi profilert differensielt uttrykte proteiner i HCT116 cellene behandlet med eller uten GA. Ved å sammenligne 2-DE mønstre, ble differensielt uttrykte proteiner er definert som en statistisk meningsfylt (p 0,05) hvis begge to følgende kriterier var oppfylt: 1) intensitet forandringer av 2,0 ganger og 2) observert i minst tre individuelle eksperimenter. 25 flekker som oppfylte disse kriterier ble utvalgt og analysert ved hjelp av ESI-Q-TOF tandem massespektrometri, og en total av 27 proteiner ble identifisert (fig. 5A, tabell I). MS /MS-data ble spørres ved hjelp av søkealgoritmen MASCOT mot Expasy proteinsekvens database. Proteiner ble identifisert basert på en rekke kriterier, inkludert pI, MW, peptid identifikasjon, og dekning (tabell I). Av disse ble 13 proteiner nedregulert, mens 14 proteiner ble oppregulert post GA behandling (Fig. 5D). De identifiserte proteinene ble delt inn i ulike grupper basert på deres subcellulære lokalisering og biologiske funksjoner (fig. 5B og 5C). Proteinene ble funnet å være lokalisert i cytoplasma (59%), kjerne (4%), mitokondrie (15%), cellemembran (11%), eller endoplasmatiske retikulum (11%). Dette impliserte roller i spredning og Apopotosis (37%), Redox regulering (22%), Lipidmetabolisme (15%), Glycometabolism (15%), translasjonell Proteinmodifisering (4%), og molekylær anstand (7%). Etter spredning og Apopotosis, de neste mest endrede proteiner var involvert i redoks regulering på GA behandling, noe som tyder ROS kan være involvert i GA-indusert autofagi.
(A) Representative todimensjonale gel bilder av kontroll og GA -behandlede (1 uM, 24 h) HCT116-celler. Totalt proteinekstrakter ble separert på pH 3-10 lineære immobilisert pH gradient strimler i den første dimensjonen, etterfulgt av 12% SDS-PAGE i andre dimensjon og visualisert ved CBB farging. (B) De identifiserte proteiner ble kategorisert i grupper etter deres subcellulære steder. (C) 27 forskjellige proteiner ble klassifisert i 6 grupper basert på deres biologiske funksjoner. (D) Protein klynge kart generert av tilhørende programvare. Ekspresjon av proteiner i kontrollgruppen var konstant på 0, mens proteiner oppregulert i GA-behandlede celler er i rødt, og downregulated proteinene er i grønt. Intensiteten av fargen grønn eller rød tilsvarer graden av endring, henholdsvis i henhold til fargen stripe nederst på figuren.
ROS er nødvendig for GA-indusert Autophagy <
