Abstract
Denne studien tar sikte på å undersøke hvorvidt kreft stamceller finnes i maligne perifere nerve slire svulster (MPNST). Celler av etablerte linjer, primærkulturer og fersk dissekerte svulster ble dyrket i serumfrie forhold supplert med epidermal og fibroblast vekstfaktorer. Fra en etablert human MPNST cellelinje, S462, celler som oppfyller kriteriene for kreftstamceller var isolert. Klonale sfærer ble erholdt, som kan passeres flere ganger. Anriking av stamcelleliknende cellene i disse sfærene ble også støttet av økt uttrykk av stamcellemarkører som CD133, Oct4, nestin og NGFR, og redusert uttrykk av modne cellemarkører som CD90 og NCAM. Videre er cellene av disse klonale S462 sfærer differensieres i Schwannske celler, glatt muskel /fibroblast og nevroner-lignende celler under visse differensieringsinduserende kulturbetingelser. Til slutt, subkutan injeksjon av kulene inn immunodeficient hårløse mus førte til tumordannelse på en høyere rente i forhold til foreldreheftende celler (66% versus 10% på 2,5 × 10
5). Disse resultatene gir bevis for eksistensen av kreft stamcelleliknende celler i maligne perifere nerve slire svulster
Citation. Spyra M, Kluwe L, Hagel C, Nguyen R, Panse J, Kurtz A, et al. (2011) Cancer Stem Cell-Like celler avledet fra Ondartet Perifere nerver Kappe svulster. PLoS ONE seks (6): e21099. doi: 10,1371 /journal.pone.0021099
Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 22 desember 2010; Godkjent: 20 mai 2011; Publisert: 13 juni 2011
Copyright: © 2011 Spyra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet delvis av en bevilgning fra det amerikanske forsvarsdepartementet Nevrofibromatose program (W81XWH-07-0359 til SDR) og «Bundesministerium für Bildung und Forschung» (BMBF) (01GM0480 til AK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ondartede perifere nerve slire svulster (MPNSTs) er bløtvevssarkomer oppstår fra perifere nerver og har høy forekomst av lokalt residiv og hematogenous metastase [1]. De står for 10% av alle bløtvevssarkomer. Halvparten av disse maligniteter forekomme hos pasienter med nevrofibromatose type 1, et tumorsuppressorgen syndrom med en hyppighet på omkring en i 3000. MPNST, spesielt de som er forbundet med nevrofibromatose type 1, er en av de mest aggressive ondartede sykdommer hos mennesker med en svært dårlig prognose [2].
Resultater fra nyere studier tyder på at mange ondartede svulster inneholder celler med egenskaper av stamceller inkludert selvfornyelse, klonalitet, multipotency, og høy forekomst av tumordannelse i immunsvikt mus [3], [4 ]. Som embryonale stamceller, blir kreft stamceller postulert å være resistente [5], [6]. I vår siste klinisk utprøving ved hjelp av imatinib mesylate, en tyrosin kinase reseptor hemmer, flere pasienter med MPNST viste innledningsvis lovende respons som sine svulster krympet til svært små kjerner. Men forekom tilbakefall i alle tilfeller, og de tilbakevendende svulster ikke svare på det opprinnelige behandlingen noen flere (upubliserte observasjoner). Muligens, en liten del av stamcelle-lignende celler unnsluppet terapi og førte til tilbakefall
kreft stamceller er blitt rapportert og omfattende studert i en rekke faste tumorer [7] -. [9], de har ennå ikke blitt identifisert i MPNSTs. I denne studien har vi testet hypotesen om at MPNSTs også inneholde stamcelleliknende celler, som kan bli beriket
in vitro
. Stamcelleliknende celler fra en etablert human MPNST cellelinje, S462, ble videre karakterisert
in vitro
,
in vivo Hotell og molekylært.
Materialer og metoder
Pasienter og svulster
diagnosen nevrofibromatose type 1 ble gjort i henhold til National Institute of Health diagnostiske kriterier [10]. MPNST tumorer (n = 12), plexiform (n = 3) og kutane nevrofibromer (n = 3) ble oppnådd hovedsakelig fra Kirurgiske og maxillofacial kirurgiske avdelinger ved Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf og noen fra Nevrofibromatose Clinic, München. Oppnåelsen av svulster ble godkjent av den lokale Review Board (Hamburg Ärztkammer, OB-011/07), og alle pasienter ga skriftlig samtykke. Umiddelbart etter kirurgisk fjerning, ble prøvene plassert i Hanks bufret saltoppløsning (Gibco, Paisley, UK). En del av hver prøve ble brukt til å bekrefte den patologiske diagnose av tumor (Institute of neuropathology, universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf). En annen del ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Det gjenværende vev ble benyttet for celledyrking.
Cellekultur
Celler av etablerte cellelinjer MPNST S462 og S1507-2 ble dyrket under standard betingelser med serum [11]. Dissosiasjon og dyrking celler fra ferske resected MPNSTs ble som tidligere beskrevet [11].
Anriking av stamcelleliknende celler
Celler av etablerte linjer, primærkulturer og ferskt dissosierte svulster ble dyrket under stammen celleforhold i stamcelle-medium (SCM) som består av Neurobasal medium (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) med human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF 20 ng /ml, R D), 5 mL CD34-PE, 5 pl CD56-PC5 eller 5 pl CD90-PC7 (Beckmann Coulter) ble tilsatt (optimal antistoffkonsentrasjoner ble bestemt av flere fortynning eksperimenter). Som negative kontroller ble cellene inkubert i den samme buffer supplert med 10 ul IgG1-PE, 10 ul IgG1-FITC, 5 ul IgG1-PC5, 10 ul IgG1-PC7 (Beckmann Coulter) i 30 minutter ved 4 ° C. For påvisning av den intracellulære antigenet nestin (R dersom dette er vesentlig, ble post-hoc sammenligninger ved hjelp Dunn test utført. Økningen i antallet av proliferative celler over tid ble analysert ved anvendelse av en ikke-parametrisk gjentatte målinger ANOVA; dersom dette er vesentlig, ble post-hoc sammenligning bruker Tukeys test utført. Den samme test ble utført for å sammenligne en økning i proliferasjon av CD133 positive og negative kuler over tid. Forskjeller i den relative mengde av cDNA analysert ved RT-PCR, og endringer i prosentandelen av positive celler i paren adherente celler og kuler analysert ved flowcytometri, ble testet ved anvendelse av ikke-parametriske Mann-Whitney U-test. Forskjeller i hyppigheten av tumordannelse mellom mus injisert med adherente celler og kuler henholdsvis, ble beregnet ved hjelp av Chi-square-test. Alle gjennomsnittsverdier er representert som gjennomsnittet ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Verdier ble betraktet som signifikant når p. 0,05
Resultater
Sphere formasjon fra MPNST celler
For å undersøke hvorvidt MPNSTs inneholde stilk-lignende celler, celler fra 2 etablerte linjer og 12 dissekerte tumorene ble dyrket i serumfritt medium inneholdende EGF og FGF. Kuler eller kulelignende aggregater ble oppnådd fra de to cellelinjene og 10 ut av den 12 dissekert ferske tumorer. Kuler dannet ved lav tetthet, så lavt som en celle pr brønn, og formert i minst 20 passasjer fra den etablerte cellelinje MPNST S462. Kuler eller kulelignende aggregater ble også hentet fra en annen etablert MPNST linje (S1507-2) og fra primær MPNST celler og fersk dissekert MPNSTs; imidlertid, overlevde de bare i 2 til 12 passasjer, og kunne ikke fås ved celletettheter under 100 celler per brønn. Tilsvarende kuler eller kulelignende aggregater ble også oppnådd fra primærkulturer avledet fra plexiform nevrofibromer og kutane nevrofibromer, men kan ikke bli passert mer enn to ganger. Ytterligere eksperimenter derfor fokusert på områder av S462.
In vitro karakterisering av MPNST S462 kuler
Foreldre MPNST S462 celler passasje 35, som under standard mellom forhold med serum vokse adherently, dannet flytende kuler etter 2 dager under stamcelle forhold (fig 1A, B;. heft S462 celler refererer til foreldre S462 cellelinje). Proliferasjon av celler i kulene viste at disse var ikke bare aggregater (fig. 2A). Når disse primære sfærer ble dissosiert og cellene forgylte ved ekstremt lav densitet i brønner i en 96-brønners plate, ble sekundære sfærer erholdt i 16,7% ± 2,4 fra brønner inneholdende enkle celler. Hyppigheten av sfære dannelse fra enkeltceller øker når kulene ble passert videre (fig. 2B). Klonale kuler ble også hentet fra heft S462 cellene i veldig tidlig passasje to, med en høyere frekvens av primær sfære formasjon 31,86% ± 2,50, nesten dobbelt så høy som med heft S462 celler av passasjen 35. Hittil har MPNST S462 kuler vært passeres etter klonale forhold over 20 ganger.
(A) Foreldre S462 celler under standard kultur forhold med serum vokse adherently (kanal 35). (B) Flytende sekundær sfære etter to uker under stamcelle forhold uten serum. Kulen ble avledet fra en enkelt celle og således var klonal. Barer = 20 mikrometer.
bromdeoksyuridin innlemmelse analysen avslørte spredning av S462 celler i klonale sfærer (sekundær kuler). Den økning i celle absorbans var signifikant til 8, 10 og 15 dager i SCM versus 3 dager (p 0,01 **). Endringer i hyppigheten av sfæren dannelse i brønner som inneholder enkeltceller opprinnelig fra tilhenger S462, deretter fra dissosierte kuler belagt som enkeltceller og passeres fortløpende. Økningen i hyppigheten av sfære formasjon med økende passasje var signifikant (passasje 1 (primær kuler) versus passasjer 10 (10
th kuler) og 12 (12
th kuler), P 0,01 **, passasje 2 ( sekundære kuler) versus passasjer 10 (10
th kuler) og 12
th kuler), P 0,05 *)
Up-regulering av stamcellemarkører og nedregulering av modne. cellemarkører i S462 kuler
real-Time PCR avslørt oppregulering av stamcellemarkører nestin, NGFR, OCT4, Notch4, SOX2, CD133 og SOX9 i S462 kuler av passasjer mellom 13 og 16, i forhold til S462 adherente celler holdes under SCM dyrkingsbetingelser i 14-16 timer (fig. 3A, venstre). I motsetning til dette, ble EGF-reseptor (EGFR) og NCAM, en markør for umodne Schwannske celler, uttrykt ved lavere nivåer i S462 sfærer enn i foreldre adherente celler (fig. 3A, til høyre).
(A) Fast -Tid PCR. Uttrykk for hver markør i kulene ble normalisert mot uttrykk for den samme markør i heft S462 celler. Spheres på passasjer mellom 13 og 16. * p 0,05; tilhenger versus sfære transkripsjon uttrykk (nestin, NGFR, Oct4, Sox2, CD133, Sox9, EGFR og NCAM). (B) Flowcytometri. Endringer i prosentandelen av celler som uttrykker moden og stamcelle progenitor markører i heftende celler og i sfærer (passasjer 8 og 13), CD133 og NCAM tilhenger versus kuler p 0,05 *, CD34 og CD90 tilhenger versus kuler p 0,01 **, NGFR og nestin tilhenger versus kuler p 0,01 ***. EGFR, epidermal vekstfaktor-reseptor; NGFR, nervevekstfaktor-reseptor; NCAM, celle adhesjon molekyl.
Flowcytometri viste økt uttrykk av neural crest markører NGFR, CD133 og nestin i kulene i forhold til foreldreheft S462 celler (fig. 3B). Andelen av celler som uttrykker CD34 ble også øket i kulene til ca 50%. I tillegg, omtrent 60% av den NGFR positive populasjon ko-uttrykkes-CD133 i vedheftende S462, og i kulene (66,84 ± 10,82% adherente versus 60,81 ± 12,21% kuler, ikke signifikant) (Fig. 4). Motsatt ble CD90 og NCAM uttrykt sjeldnere i S462 kuler enn i heftende celler (fig. 3B).
Side og frem scatter analyse av heftende celler (venstre kolonne) og kuler (ved passering 8, høyre kolonne) viste forskjellige typer celler. Levende celler ble inngjerdet i R1 (øvre panel), og gatings for NGFR (R2) positive celler (midterste paneler) vises i oransje. NGFR-positive celler (representert i oransje) innenfor CD133-positive celler viser samtidig uttrykk for CD133 /NGFR (nedre paneler). NGFR celler co-uttrykker CD133 er sjeldne i den heftende cellepopulasjon og økt i kuler. Isotype kontroller for alle antigener ble brukt til å sette opp kvadrantene for negative populasjoner. NGFR, nervevekstfaktor reseptor.
Høyere frekvens på S462 sfære dannelse og spredning i CD133 + celler
Ved hjelp av magnetiske kuler basert sortering, beriket vi CD133 positive og negative celler fra serum -cultured adherente celler S462 (passasje 35) til 90 og 80%, henholdsvis, og dyrket dem separat i SCM ved lav celletetthet. Flere kuler dannet i CD133 + populasjonen sammenlignet med den CD133- populasjonen (35,21% mot 18,35%). I tillegg celler i CD133 + kuler spredte seg raskere enn de i CD133- sfærer (absorbans ved 405 nm på 0,7 ± 0,047 versus 0,39 ± 0,0312, p 0,001).
S462 kuler er i stand til avstamning differensiering
for å vurdere potensialet for multilineage-differensiering, clonally avledet kuler og heft S462 celler fra passasje 35 var både dyrket i medium som inneholder serum, som induserer differensiering. Etter to til tre uker, ble ekspresjon av S100 observert i et lite antall av celler fra S462 klonale kuler, noe som indikerer avstamning differensiering til Schwannske cellelignende celler. I motsetning til dette, ble ekspresjon av denne markøren ikke observert i de adherente S462-celler (data ikke vist). Mer enn 50% av cellene fra de klonale kulene uttrykt nestin når dyrket i serumholdig medium, sammenlignet med ingen av de adherente S462-celler (data ikke vist).
Legge neuregulin og forskolin indusert spesifikk differensiering til S100 + Schwann cellene i nesten alle celler av klonale S462 kuler, men bare en liten del av adherente celler S462 var virkelig positive for S100 og viste lett forskjellig morfologi (fig. 5A). Den bi-polare morfologien til S100 + Schwannske celler differensiert fra klonale kuler (fig. 5A, D) var lik den i Schwannske celler avledet fra et plexiform neurofibroma (Fig. 5A innsats). Disse differensierte celler fra klonale kuler også uttrykte Schwann cellemarkører neurofilament og NGFR (Fig. 5A), heftende celler uttrykt neurofilament men svært sjelden NGFR (data ikke vist).
heftende celler (venstre kolonne) og dissosiert sfære -celler (høyre kolonne) ble dyrket med vekstfaktorer som induserer differensiering i celler som likner (A) Schwannske celler, (B) SM /Fb og (C) nevroner, noe som er positivt farget for S100 /NGFR /neurofilament (Schwannske celler), SMA ( SM /Fb), og MAP-2 (nevroner), henholdsvis. Sett i A illustrerer S100 + Schwann celler avledet fra en plexiform neurofibroma kultur. (D) fase kontrast mikroskopi fra differensierte celler under 3 dyrkningsforhold for å generere Schwann celle, SM /Fb og Nevron-lignende celler. Differensierte celler er angitt med piler og ikke-differensierte celler ved pilspisser. Barer = 20 mikrometer. NGFR, nervevekstfaktor; SMA, glatt muskel aktin; MAP-2, microtubule assosiert protein-2; PNF, plexiform neurofibroma; LC, som-celler.
På samme måte, eksponering for bFGF og transformerende vekstfaktor-SS1 indusert spesifikk differensiering til SM /Fb-lignende celler i en stor del av cellene fra klonale S462 kuler mens bare et fåtall S462 adherente celler viste glatt muskel aktin ekspresjon og fibroblastoid morfologi (fig. 5B, D).
til slutt, cyklisk AMP og retinsyre indusert nevrogen linjen differensiering i celler av klonale sfærer, som de uttrykte MAP-2 og oppviste neuron-spesifikk morfologi som store cellelegemer og neuritter (fig. 5C, D). I kontrast, mens heftende celler uttrykte MAP-2 under de samme kulturelle forhold (Fig. 5C), disse cellene viste ikke nevron-lignende morfologi.
In vivo karakterisering av S462 sfære celler
subkutan injeksjon av 2,5 x 10
5 celler av klonale S462 kulene (n = 9) førte til synlig solid tumordannelse 1 til 3 måneder etter injeksjon i 66% av nakne mus. I motsetning til dette påvisbare faste tumorer bare dannes i 10% av nakne mus (n = 10) når det samme antall adherente S462-celler ble injisert, til denne tumoren er nødvendig over tre måneder skjema (fig. 6A). Histologisk svulster fra begge heftende celler og kuler utstilt typiske kjennetegn ved MPNST:. Spindel formet, svært proliferativ som vist med høyt antall Ki67 positive celler, og S100 negative tumorceller (Figur 6b)
(A) Frekvens og tid for tumordannelse med 2,5 x 10
5 heftende (n = 10, passasjen 35) eller klonal sfære S462 (n = 9), CD133
+ (n = 9) og CD133
– (n = 5) celler injisert subkutant. Alle sfære celler ble oppnådd mellom passasjene 8 og 13. Heft versus kuler og tilhenger versus CD133 + kuler p 0,05 *. (B) Histologi av tumorer avledet fra heftende celler (venstre panel) og sfære celler viste at disse svulstene ligner MPNSTs. H E viser typiske spindel form cellene MPNST (piler, topp panel), som er svært proliferativ av Ki-67 immunstaining (piler, midtre panelet) og negative for S100 (nederst panel). Bar = 200 um, gjelder for alle mikrografer. (C) Celler dissosiert fra mus svulster dannes sekundære kuler
in vitro plakater (representant sekundær sfære 3 uker etter plating enkeltceller). Bar = 20 mikrometer.
Når 2,5 × 10
5 celler fra CD133 + sfærer (n = 9) og CD133- sfærer (n = 5) ble injisert i hårløse mus subkutant, bare CD133 + celler resulterte i synlig tumordannelse hos 55% av musene, mellom to uker og en måned etter injeksjon (fig. 6A). Når 5,6 x 10
4 celler fra CD133 + kuler (n = 3) ble injisert, tumorer dannet i 66% av musene og tok omtrent en måned for å utvikle seg. I motsetning til 2,5 × 10
5 celler fra CD133- kuler ikke føre til noen synlige tumordannelse; og høyere antall celler (5 × 10
6, n = 7) førte til synlige svulster i bare 14% av mus og ca 2 måneder etter injeksjon.
Når svulster fra mus ble nylig skilt og belagt som enkeltceller i stamcelledyrkningsforhold, runde kuler dukket opp i løpet av to dager (fig. 6C). Disse kulene kunne dyrkes clonally løpet påfølgende passasjer. Hyppigheten av sfære dannelse av celler fra tumorer dyrket i mus som var ca. 32%, høyere enn den for adherente S462 celler ved passasje 35 (som var ca. 17%), mens sammenlignbar med den for adherente S462 celler ved passasje 2, som var rundt 31%.
Diskusjoner
i denne studien har vi brukt kultur forholdene optimalisert for nevrale stamceller, for anriking av kreft stamceller-lignende celler fra MPNSTs. Vi lyktes i å skaffe og berikende slike celler fra en etablert MPNST cellelinje, S462, og dermed vist at kreft stilk-lignende celler finnes i MPNST. Kuler kunne oppnås fra enkelt MPNST S462 celler, noe som indikerer at de er sanne prolifererende kuler og ikke aggregater av celler. Sfærer ble også oppnådd fra primære S462 ved passasje 2, med en enda høyere frekvens. Det er således usannsynlig at de stilk-lignende celler vi oppnådd, anriket og studerte er en artefakt av langtidskultur.
Vi kunne ikke oppnå klonale sfærer som kan passeres av en andre MPNST cellelinje, flere primære MPNST kulturer, nystekte dissekert svulster eller plexiform og kutane nevrofibromer [12]. MPNST svulster er klinisk, genetisk og histopathologically svært heterogen [1]. Det er mulig at bare S462 linje, som ble avledet fra en meget aggressiv og tilbakevendende tumor, inneholder en tilstrekkelig andel av stamcelle-liknende celler som er umoden nok til å muliggjøre dannelsen av klonale kuler under de valgte betingelser. Spheres fra noen andre MPNSTs kan passeres ved høyere tettheter opp til 12 ganger, noe som indikerer noen stamcelleliknende potensial. forholdene den kulturen vi benyttet i denne studien er usannsynlig å være optimal for kreft stilk-lignende celler i MPNST. Dette kan også gjenspeiles i de vansker med å etablere permanente kulturer fra ferske svulster, selv i standard kultur forhold med serum ([14].
S462 celler uttrykte en rekke stilk eller stamcellemarkører, inkludert nestin, NFGR CD133 og CD34 i varierende grad, noe som tyder på at disse cellene er mindre differensiert og mer umodne. uttrykk av disse markørene ble betydelig økt i klonale kuler som støtter vår hypotese som stammer lignende celler er anriket i kulene. CD133 + S462 kuler hadde en høyere frekvens av sfære formasjon
in vitro
og tumordannelse hos mus sammenlignet med CD133- kuler. Denne markøren markerer således kreft stilk-lignende celler i MPNST til en viss grad, men ikke utelukkende.
neural crest stilk celler har evnen til å fornye seg selv og skille ut en rekke av linjene, inkludert neuroner, gliaceller, og myofibroblasts [15], [16]. i nærvær av respektive vekstfaktorer, celler i MPNST S462 klonale kuler differensierte inn i celler som ligner Schwann celler, SM /Fb og nerveceller. En slik avstamning differensiering var mye mindre dyp og sjeldnere i heft MPNST celler. Disse funnene tyder på at udifferensierte eller dedifferensierte celler, som har en høyere potensial for differensiering enn differensierte celler, er anriket i klonale S462 kuler. Faktisk, CD34, en glycophosphoprotein, normalt uttrykt av modne endotelceller, mesenchymale og hematopoetiske progenitorceller, og enda viktigere i nevrale stamceller er også lokalisert i MPNSTs tumorer, sannsynligvis i endoneurial fibroblaster [17], [18]. Økningen i ekspresjon av denne markøren i sfærene viser at et økende antall celler er forbundet med et mer differensiert fenotype under stamcellebetingelser som anvendes. Det er også mulig at nevrale stamcelledyrkningsforholdene indusere eller fremme dedifferentiation av S462 celler eller spredning av stilk-lignende celler i foreldre befolkningen.
selvfornyelse er en av egenskapene til stilk-lignende celler. Økningen i sfære ferd med aging i stamcelle media antyder at frekvensen av stilk-lignende celler i løpet av kulene øker med vekst, som ville være forventet dersom disse dyrkningsbetingelser velge ut for, eller støtte økt proliferasjon, eller overlevelse, av stammelignende celler. Derfor er en berikelse for kreft stamceller i kuler sammen med reduserte andeler av differensierte celler den sannsynlige årsaken til den økte tumorigent potens av kuler. Interessant, som vist i native MPNST, muse-avledede tumorer viste faktisk ingen ekspresjon av Schwannske celledifferensiering markør S100.
Vårt resultater gir bevis for eksistensen av kreft stilk eller stamcelle-liknende celler i MPNST. Disse cellene vokse som klonale kuler for flere passasjer i henhold nevrale stamcelle kulturelle forhold, hurtig stilk /stamcellemarkører og indusere tumordannelse i immunodeficient hårløse mus på et vesentlig høyere frekvens enn heftende celler. Studere disse cellene kan bidra til en bedre forståelse av biologi og patogenesen av MPNST og kan muliggjøre identifisering av spesifikke mål for utvikling av behandlingsformer.
Takk
Vi vil gjerne takke Institutt for nevrokirurgi, onkologi og nevropatologi (University Medical Center Hamburg Eppendorf, Hamburg, Tyskland) for å tillate oss å bruke sine fasiliteter. Spesiell takk går til Dr. H. Guenther (Institutt for nevrokirurgi), K. Kluge, A. Schaefer og C. Horn, (flowcytometrisystemer innretningen av Avdeling for kreftbehandling og Hematologi) og M. Haberkorn (Institutt for nevropatologi) for å gi oss vitenskapelige og tekniske råd. Vi er også veldig takknemlige til professor R. Friedrich, Dr. M. Blessmann (Institutt for Maxillofacial Surgery), professor E. Yekebas og Dr. M. Bockhorn (Department of Surgery) fra University Medical Center Hamburg Eppendorf og Dr. U. Wahlländer -Danek (Nevrofibromatose Clinic, München, Tyskland), for å gi tumormateriale.
